新型冠狀病毒的核酸檢測及安全防護

黃鵬飛(中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津 300309)

0 引言

2019年12月新型冠狀病毒(SARS-CoV-2，簡稱新冠病毒)引起的新型冠狀病毒性肺炎(COVID-19)在湖北省武漢市蔓延。在疫情爆發(fā)的早期，高通量測序是檢測病毒的主要手段，但是該檢測技術費用昂貴，檢測時間長并且對儀器和操作員提出了很高的要求，無法滿足大規(guī)?？焖贆z測需求。實時熒光定量RNA 反轉錄與cDNA 聚合酶鏈式擴增相結合的檢測技術的應用基于國內外大流行病的經驗，可以高效、快速地完成病毒標本的檢測，具有高靈敏度、高特異性、易于推廣的優(yōu)點，因此成為我國疫情防控的首要檢測手段。本文結合實踐對熒光定量RNA 反轉錄與cDNA 聚合酶鏈式擴增相結合的檢測方法的應用進行探討，并提出了生物實驗研究、手術護理過程中的安全防護措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源

2020年2月15日至2020年3月15日我院發(fā)熱門診室收治的763 位發(fā)熱患者。

1.1.2 試劑與儀器

試劑選用上海源葉生物科技有限公司生產的核酸提取試劑盒和新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。檢測儀器選用Bio-Rad伯樂 CFX Connect 熒光定量PCR 儀。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

預約采樣，每日上午、下午分別采集一批樣本，由穿戴三級生物安全防護裝備的醫(yī)護人員采集患者的咽拭子，對于多次咽拭子檢測為陽性或高度疑似的患者，進一步采集痰液或肛門拭子。

1.2.2 樣本包裝、運送及接收

收集樣品后，將其放入病毒存儲管中并冷凍，試管外貼條碼。用75%的乙醇噴灑樣品管后放在密封袋。每個包裝僅限存放一個樣品管。樣本由專門人員送到實驗室。接待人員對箱子的外表面進行消毒，用75%的乙醇噴灑運輸樣品運輸箱表面，將其打開再對箱子進行乙醇消毒。最后，取出樣品運輸箱并在生物安全柜中打開，檢查樣品數量是否正確，樣品管是否完好，有無破損泄漏。

1.2.3 提取樣本核酸

通過磁珠法提取核酸RNA，為擴增核酸，使用新冠病毒開放閱讀碼框(ORF1ab)和基因編碼核衣白核蛋白(N)基因特異性保守序列為靶區(qū)，構建雙靶基因。與PCR 反應溶液結合使用可以通過在定量PCR 熒光儀上改變熒光信號來進行RNA 檢測。

1.2.4 檢測結果分析

實驗中使用的PCR 檢測系統包括內源內標(IC)引物，可通過確定正常內標來監(jiān)控樣本采集、核酸提取及擴增情況，有效減少假陰性檢測結果。在每個批次的實驗中建立三個陰性質量對照和一個關鍵的陽性質量對照，將它們隨機插入樣品中同時檢測，以監(jiān)控實驗結果的可靠性。分析結果時應首先檢查陰性和陽性質量控制結果，陰性質量控制品的FAM 和ROX 通道都沒有Ct 值或Ct 值大于40，陽性質量控品FAM，ROX 通道和內標通道HEX 的Ct 值小于等于35。如果質控產品的結果滿足上述要求，則實驗結果有效，否則結果無效，需重新測試。

每個測試樣品的結果應參考試劑盒說明，分析結果如下：(1)如果FAM 或ROX 通道檢測出典型S 型擴增曲線，Ct 值小于等于40，可以報告為樣品中SARS-CoV-2 核酸陽性。(2)如果FAM和ROX 通道都未測得典型S 型擴增曲線，無Ct 值或Ct 值大于40，HEX 通道測得S 型擴增曲線，Ct 值小于等于40，則樣本可以判斷為SARS-CoV-2 樣本核酸陰性。(3)如果FAM、ROX、HEX通道均未測得典型S 型擴增曲線，且沒有Ct 值或Ct 值大于 40，則表示樣本細胞含量低或反應被抑制，樣品測試結果無效，需找到原因并消除，重新測試。

2 檢測過程中的安全防護

2.1 標本采集過程中的安全防護

核酸檢測樣品包括上呼吸道樣品(如口咽拭子，鼻咽拭子等)，下呼吸道樣品(如痰液、呼吸道提取物、肺泡灌洗液等)，患者病癥發(fā)作期間的血液、糞便。收集樣品時應該確保收集者配備生物安全三級防護設備。據統計最常用的咽拭子樣本核酸檢測準確率、靈敏度較低，下呼吸道樣本檢測則陽性率偏高。比較理想是檢測患者痰液，建議使用6 mL，3%生理鹽水霧化吸入20min，從下至上輕拍患者背部促使痰液排出。對于無法采集痰標本的患者仍需要用咽拭子檢測核酸，但應考慮影響核酸檢測的因素例如采集材料、采集深度等。

2.2 樣本轉運過程中的安全防護

收集樣品后，樣本試管外部用75%的乙醇噴灑消毒，將其放在專用雙層一次性密封袋中，再用75%的乙醇噴灑密封袋外表后將其放在轉運箱(帶有生物安全標志)中，對轉運箱進行消毒并立即送交檢查，整個過程必須在兩個小時內完成。工作人員隨身攜帶75%的乙醇以應對突發(fā)事件。新冠病毒肺炎臨床實驗室檢測生物安全防護指南指出在發(fā)生突發(fā)事件時轉運工作人員不可自行處置轉運箱，而應與接收地點聯系以說明情況并與接收人員協調處理。建議轉運人員應該隨時攜帶75%乙醇，如果運輸箱的密封件發(fā)生損壞可以立即進行緊急消毒處理，如果樣品泄漏，請到接收處與接收人員共同處理。

2.3 樣本接收過程中的安全防護

樣本接收人員應配備二級生物安全保護裝備。在對樣品進行雙重簽名驗收操作后，接收人員要用75%乙醇對轉運箱的外表面進行噴灑消毒。然后將其靜置20 分鐘左右，輕輕開啟轉運箱，再次用75%乙醇對轉運箱的內部、密封袋進行噴灑消毒。重點檢查樣本轉運過程中是否發(fā)生泄漏，以及核對樣本來源信息是否正確，如患者個人信息，然后將樣本放入儲藏盒中，并在4℃專用冰箱中進行存儲，存儲時間不能大于24h。對于血漿樣本可以在4℃下最長存儲3 天，在-20℃下可以長期保存。應當記錄樣本收集、轉運、接收環(huán)節(jié)的信息，以方便進行跟蹤。

3 醫(yī)護過程中的安全防護

3.1 手術間的安全防護

要嚴格按照治療傳染病的相關程序，新冠病毒肺炎患者或疑似病例正在接受手術時，手術室應是充分消毒的負壓手術室，負壓前后室門禁止和手術間門同啟。手術完成后要關閉負壓，并消毒。

3.2 醫(yī)護人員、患者的個人安全防護

3.2.1 提高醫(yī)護人員防護意識

通過一定的措施強化醫(yī)護人員對新冠病毒的安全防護意識，使其可以主動進行安全發(fā)防護，積極學習安全管理規(guī)章制度，包括手衛(wèi)生、醫(yī)療廢棄物處理、消毒和隔離系統、標準化安全防護裝備穿戴和拆除、使用負壓手術室操作、清潔通道的位置布局。

加強醫(yī)護人員穿戴和脫除安全防護裝備的培訓，確保醫(yī)護人員掌握防護裝備的穿脫方法。

在手術前醫(yī)護人員要做好自我檢查，如果發(fā)現雙手有皮膚損傷，應避免參加手術。如果必須參與手術則應該受到特別保護。在新冠病毒肺炎患者手術過程中，如果醫(yī)護人員身體處于抵抗力較低的時期，則禁止上手術臺。

3.2.2 合理排班保證醫(yī)護人員體力

合理安排醫(yī)護人員工作，對孕婦、哺乳期婦女，原則上不安排參加新冠病毒患者手術。創(chuàng)建具有內部和外部明確分工的護士和麻醉師。內部巡查護士、洗手護士、麻醉師主要負責對手術室中的患者進行治療護理，手術期間禁止越過規(guī)定區(qū)域以減少污染物擴散。外部巡查護士、外部麻醉師主要負責產品和藥品的供應。平時要保證醫(yī)護人員的休息時間，加強營養(yǎng)。

3.2.3 規(guī)范轉移患者

在將患者送入送出手術室的過程中，為盡量減少患者轉移過程中的污染，因該給意識清醒、呼吸受限的患者佩戴口罩。氣管插管患者氣管導管接口應連接病毒細菌過濾器，整個過程使用密封式轉運車轉運。

3.2.4 做好手術中的防護

在開始手術之前，醫(yī)護人員必須采取適當的防護措施，都應穿著防護服，佩戴N95 口罩、醫(yī)用手套，還應穿鞋套。手術完成后嚴格按照規(guī)定在指定位置脫下防護服，以免造成二次污染。必須嚴格遵守手術無菌原則、消毒隔離要求進行嚴格消毒。

3.3 終末消毒

環(huán)境與物體表面消毒。清潔人員也要穿戴標準化防護裝備，用1mg/mL 氯消毒液擦拭物體表面。

手術室內物品消毒。被血液或其他分泌物沾染的物品必須用含2mg/mL 氯的消毒布擦拭，其余的要用含1mg/mL 的消毒布擦拭，然后再用清水擦拭。手術室的地板和墻壁上有血跡或分泌物，必須噴灑2mg/mL 的含氯消毒劑并浸泡0.5h 后再用清水擦拭，其余地板、墻壁、天花板要用1mg/mL 的氯來擦拭。

手術室消毒，打開負壓層流0.5h，然后關閉層流，并使用含3%過氧化氫的蒸汽熏蒸噴霧劑對手術室中的空氣進行消毒，再密閉兩個小時后打開層流通風流動并用清水擦拭物品表面以防腐蝕。

4 結語

通過分析新冠病毒檢測樣本的收集、轉運、接收、核酸提取過程中應注意的問題，提出了明確的檢測依據，對于確保新冠病毒核酸檢測結果的準確性有其重要作用，同時探討了樣本收集、轉運、接收中及醫(yī)護過程中的安全防護。目前，對于COVID-19 的發(fā)病機制、臨床發(fā)病過程、治療方案仍在持續(xù)研究中。作為一種診斷方法，病毒核酸檢測仍是一種快速、可靠、必不可少的檢測方法。為了進一步提高核酸檢測的準確度和速度，需要提高檢測試劑盒的穩(wěn)定性。目前很多研究人員還在積極探索更有效的檢測方法，例如數字PCR，這將有助于更快、更準地檢測新冠病毒，在控制疾病進程、實現早發(fā)現、早治療以及有效預防控制疫情中起到非常關鍵的作用。