HSCCC 分離天然產(chǎn)物中化學(xué)成分研究進展

梁元昊 徐文麗 胡瑞雪 劉玉峰

（1.遼寧大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧沈陽110036； 2.遼寧省天然產(chǎn)物制藥工程技術(shù)研究中心， 遼寧沈陽110036）

從天然產(chǎn)物（包括瓜果蔬菜、酒渣醬料） 中分離制備活性有效成分并將用于疾病治療，正受到越來越多人的重視，但上述成分種類過多，故對其提取分析是一個非常復(fù)雜的過程［1?2］。天然產(chǎn)物的傳統(tǒng)分離方法存在純度低、分離不徹底、樣品變性等問題，從而阻礙了對有效化學(xué)成分性質(zhì)的研究［3］，故如何對其進行分離，進而實現(xiàn)資源深度利用，得到高產(chǎn)率、高純度活性物質(zhì)是當(dāng)前重點。

高速逆流色譜（HSCCC） 是由美國國立衛(wèi)生研究院Ito博士在20 世紀(jì)80 年代最先研制一種獨特的液?液分配色譜法，它將分析物分配成2 種互不相溶的液體，被分離組分在該溶劑系統(tǒng)中具有不同的溶解度，進而產(chǎn)生分配系數(shù)差，使目標(biāo)化合物能依次被流動相洗出，從而實現(xiàn)組分分離，已廣泛地應(yīng)用于創(chuàng)新藥物、植物提取、保健品、天然產(chǎn)物、化妝品等行業(yè)中［4?5］。本文對HSCCC 在天然產(chǎn)物活性小分子分離、多肽和蛋白質(zhì)等生物大分子分離、手性分離方面進行概述，以期為分離純化高產(chǎn)率、高純度有效化學(xué)成分提供一種新的分析方法與思路。

1 HSCCC 概述

1.1 優(yōu)缺點 HSCCC 不需要固定載體作為固定相，可大容量負(fù)載，具有高標(biāo)本負(fù)載能力和目標(biāo)分析物的高回收率［6］；與柱色譜法、HPLC 制備方法相比，它進一步放大了分離、制備過程，避免了常規(guī)分離方法可能導(dǎo)致在分離、純化階段由于不可逆的吸附而損失活性成分或分解的問題；能輕松有效地分離具有相似骨架和極性的組分［7］。但該方法在溶劑體系的選擇和優(yōu)化方面，尚無更充分的理論依據(jù)，需要根據(jù)主觀經(jīng)驗進行多次實驗，進而篩選出較佳的溶劑系統(tǒng)，有一定的隨機性和繁瑣性；分離效果易受到兩相密度差［8］、溫度、體積流量、轉(zhuǎn)速等因素的影響［9］；消耗溶劑過多，一次分離時間過長（以小時計）［10］；制備分離量還不能達到公斤級的分離純化［11］，故仍需要進一步改進與完善。

1.2 溶劑體系選擇 在使用HSCCC 分離天然產(chǎn)物活性成分時，最大的問題是如何選擇一個正確的溶劑系統(tǒng)，對其篩選可占總分析時間的90%［12］。HSCCC 兩相溶劑體系較穩(wěn)定，溶劑系統(tǒng)分層時間主要分成3 類，疏水性溶劑體系通常為5～16 s，親水性溶劑體系一般為38～59 s，中性溶劑體系為19～29 s［13］，一般條件下，溶劑系統(tǒng)不會引起樣品的分解、變性，而且其溶解度較高，故目標(biāo)化合物在兩相溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的選擇范圍要恰當(dāng)，一般在0.5～2之間［14］。由此確定，HSCCC 溶劑系統(tǒng)［15］在強極性溶劑體系中常用雙水相，如正丁醇?水、乙酸乙酯?水；中等極性溶劑體系中主要是氯仿?水、乙酸乙酯?水，可在此基礎(chǔ)上添加正丙醇、甲醇、異丙醇、正己烷、正丁醇等來調(diào)配比例；對于弱極性溶劑體系，可采用正己烷?水、石油醚?水、三氯甲烷?水基本體系，同時添加乙酸乙酯、甲醇進行調(diào)配。此外，無水溶劑體系也是理想的選擇，由于其不含水，故回收溶劑較方便，而且樣品后處理更便捷，節(jié)約了成本，目前應(yīng)用最廣泛的是正己烷?乙腈體系，采用乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷對其進行調(diào)配［16］。

2 應(yīng)用HSCCC 分離化學(xué)成分

2.1 天然產(chǎn)物活性小分子 天然產(chǎn)物主要化學(xué)成分包括生物堿、苷類、黃酮、蒽醌、甾體、萜類、香豆素、揮發(fā)油、酚類、植物色素類、糖類、脂類等［17］，并且不同種類化合物的藥理作用也有所差異［5］。

2.1.1 多酚 多酚是食品中最豐富的抗氧化劑，富含該成分的天然產(chǎn)物或飲料都與預(yù)防某些慢性疾?。ㄈ绨┌Y和心血管疾病） 有關(guān)［18］。HSCCC 是一種全液相色譜系統(tǒng)，它在一定程度上消除了多酚的分離過程中的不可逆吸附和尾影形成［19］，主要采用2 種溶劑系統(tǒng)，當(dāng)多酚分子量較小時，主要采用中等極性溶劑，如氯仿?甲醇?水、正己烷?水?甲醇?乙酸乙酯等［20］；當(dāng)其分子量較大時，主要采用正丁醇?水等極性較強的溶劑體系［21］，具體應(yīng)用時可適當(dāng)對溶劑進行調(diào)整。

Peng 等［22］在最優(yōu)條件下采用正己烷?乙酸乙酯?水（3 ∶17 ∶20）、乙酸乙酯?甲醇?水（50 ∶1 ∶50） 溶劑體系，通過兩步分離成功地從柿子中得到出7 種主要多酚，純度均高于95.0%，并且發(fā)現(xiàn)HSCCC 在制備二聚原花青素方面具有明顯的優(yōu)勢。Kohler 等［23］將葡萄籽提取物黃烷?3?醇間苯三酚加合物在乙酸乙酯?甲醇?水（1 ∶5 ∶0.1 ∶5、1.5 ∶10 ∶1.5 ∶10） 體系下直接用HSCCC 全液相色譜技術(shù)進行分離，發(fā)現(xiàn)所得餾分中含有純度極高的化合物，實現(xiàn)了對二聚體到四聚體原花青素的分離。此外，HSCCC 分離低聚原花青素時已證實可應(yīng)用于半制備規(guī)模上，在某些情況下可采用制備型高效液相色譜法進行最終純化。Jiang 等［24］建立了一種簡便、快速、峰容量顯著提高的離線二維HSCCC，分別以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（3 ∶5 ∶3 ∶5）、乙酸乙酯?正丁醇?水（7 ∶3 ∶10） 為第1、第2 維兩相溶劑體系，成功從苦蕎粗提物中分離出槲皮素3?O?蘆丁苷、蘆丁、山柰酚?3?蘆丁苷、槲皮素、山柰酚，純度均在96%以上，可為苦蕎新制劑、功能性產(chǎn)品開發(fā)及進一步生物測定提供理論依據(jù)。Wen 等［25］采用HPLC?HSCCC 聯(lián)用技術(shù)，以氯仿?甲醇?水?正丁醇（4 ∶3 ∶2 ∶1.5） 為溶劑從山楂葉中分離得到4 種黃酮，純度均在98%以上。

2.1.2 生物堿 Sutherland 等［26］報道了通過HSCCC 分離純化天然產(chǎn)物有效成分的研究概況，涵蓋了來自56 個科、108 種植物，從中分離了354 個化合物，其中關(guān)于生物堿的文獻有56 篇，占化合物總數(shù)的16%。Guo 等［27］將HSCCC 與HPLC?DAD?QTOF?MS／MS 分析相結(jié)合，選擇石油醚?乙酸乙酯?甲醇?水（8 ∶4 ∶7 ∶5） 作為溶劑體系來分離厚樸粗提取物，并將2 種主要木脂素、厚樸酚剔除后，對生物堿等微量成分進行富集，再通過保留時間、UV、準(zhǔn)分子離子、裂解途徑結(jié)合比對標(biāo)準(zhǔn)品或已知化合物，初步確定了其結(jié)構(gòu)。Zou 等［28］采用重結(jié)晶法預(yù)處理蘆薈乙醇提取物，以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（5 ∶2 ∶5 ∶3） 為溶劑一步合成了3 種喹諾酮類生物堿｛1?甲基?2 ［（6Z，9Z） ?十五碳二烯基］ ?4 （1H） ?喹諾酮、二氫玫瑰堿、1?甲基?2?十五烷基?4 （1H） ?喹諾酮｝，然后以5 ∶3.5 ∶8.75 ∶8.25 比例從各亞組分中又分離出3 種喹諾酮類生物堿［1?甲基?2?十一烷基喹啉?4 （1H） ?酮、（Z） ?1?甲基?2? （十三碳?5?烯?1?基） 喹啉?4 （1H） ?酮、1?甲基?2?壬基喹啉?4 （1H） ?酮］。劉德明等［29］采用HSCCC 對正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、水等溶劑進行搭配組合以篩選溶劑體系，發(fā)現(xiàn)石油醚?乙酸乙酯?甲醇?水（5 ∶1 ∶2 ∶4） 分離生物堿類的效果最佳，并從黃柏粗提物中分離得到小檗堿、黃柏堿、巴馬丁和白瓜蔞堿，純度均可達95%以上。

2.1.3 皂苷 由于苷分子中所連糖基較多，極性較大，以固體為載體的傳統(tǒng)方法對其分離時易造成死吸附，HSCCC技術(shù)被證明是分離此類物質(zhì)的理想方法，對降低分離提取成本、提高產(chǎn)品質(zhì)量有重要的意義［30］。在分離極性較小的單糖苷時，主要采用醋酸乙酯?甲醇?水、氯仿?甲醇?水、正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水溶劑體系，并可通過調(diào)節(jié)其比例來進一步分離不同極性者［31］；對于極性較大的雙糖苷或多糖苷，大多采用醋酸乙酯?正丁醇?水，通過調(diào)節(jié)正丁醇用量來進一步分離不同極性者［32］，但這并不是絕對的，一般是根據(jù)前人經(jīng)驗來進一步巧妙地縮短分離時間和步驟。

Du 等［33］發(fā)現(xiàn)，HSCCC 是一種在實驗室規(guī)模上分離三萜糖苷的有效方法，可用于制備苦瓜中純?nèi)圃碥?，首先通過硅膠柱層析法從粗提物中得到2 種三萜皂苷，進而使用不同比例甲基叔丁基醚?正丁醇?甲醇?水溶劑體系作進一步分離純化。Ma 等［34］以正丁醇?乙酸? 6 mmol／L 醋酸銨水溶液（4 ∶1 ∶5） 為溶劑體系，采用HSCCC?ELSD 技術(shù)，成功地從大蒜粗提液中一步分離純化出4 種甾體皂苷，從300 mg 粗品中分離得到4 個化合物，純度可達93.0%以上，這也是上述聯(lián)用技術(shù)首次用于分離和純化該類成分。

2.1.4 其他 HSCCC 已被用于純化足量的抗微生物化合物，用于測定天然抗菌化合物的抑制譜和作用方式［35］。Liang 等［36］將HSCCC 作為羥基不飽和脂肪酸的純化方法，可獲得足夠量以研究對菌絲體真菌、分生孢子、酵母的抑制譜。Wu 等［37］將HSCCC 與超臨界萃取相結(jié)合，以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（7 ∶3 ∶8 ∶2） 為溶劑體系，成功提取分離了山蒼子中對甲氧桂皮酸乙酯和肉桂酸乙酯，兩者純度分別為98.4%和98.1%，有效解決了由于常規(guī)分離技術(shù)中精力、溶劑消耗大，樣品、對照品損失多的問題。Wei等［38］引入HSCCC 來純化番茄紅素，以正己烷?二氯甲烷?乙腈（10 ∶3.5 ∶6.5） 為非水溶劑體系，得到了純度高于95%的該成分。Zou 等［39］建立了一種基于三相溶劑體系液?液萃取和HSCCC 來快速富集蟾蜍肉中微量丁二烯內(nèi)酯4 個差向異構(gòu)體的方法，首先選擇響應(yīng)面法優(yōu)化后的正己烷?乙酸甲酯?乙腈?水（3 ∶6 ∶5 ∶5） 溶劑體系對粗提液進行液?液萃取，再用氯仿?甲醇?水（4 ∶2 ∶2） 溶劑體系進行富集，有助于蟾蜍肉的定量分析和安全性評價。

2.2 多肽、蛋白質(zhì)等生物大分子 蛋白質(zhì)作為天然產(chǎn)物中的第一大營養(yǎng)素，對生物體內(nèi)的生命活動起著重要作用，基于此，由其降解得到的生物活性多肽也引起了人們廣泛關(guān)注。HSCCC 主要采用雙水相溶劑系統(tǒng)和含有丁醇的體系來用于蛋白質(zhì)、多肽的前處理，對復(fù)雜樣品粗分時再通過其他分離技術(shù)來得到高純度樣品［40］，但由于溶劑體系比較單一，難以達到完全分離的條件，所得成分的種類也有限，導(dǎo)致該技術(shù)局限于簡單二肽、中極性或弱極性的肽類衍生物的分離［41］。因此，基于HSCCC 分離蛋白質(zhì)和多肽的分析主要集中于其標(biāo)準(zhǔn)品分離，以便于研究儀器分離效率與機理，從而進一步實現(xiàn)中試放大［42］。

Li 等［43］使用HSCCC 結(jié)合反膠束溶劑系統(tǒng)，開發(fā)了一種從苦瓜果實中分離蛋白質(zhì)的新方法，這也是首次在苦瓜中發(fā)現(xiàn)該成分。另外，HSCCC 在分離蛋白質(zhì)等大分子時，由于有機溶劑會使生物大分子及細(xì)胞發(fā)生不可逆的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)改變，故通常選用雙水相體系［44］。郅文波等［44］采用多分離柱高速逆流色譜研究聚乙二醇1000?磷酸鹽雙水相體系的固定相保留率，以及該體系對蛋白質(zhì)混合物和雞蛋清的分離效果，發(fā)現(xiàn)pH 為9.2 時細(xì)胞色素C、溶菌酶、血紅蛋白的分配系數(shù)差異最大，在體積流量10 mL／min、轉(zhuǎn)速850 r／min 的條件下成功地分離了雞蛋清，得到了卵白蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白。

2.3 天然產(chǎn)物手性分子 在分離天然產(chǎn)物手性分子中的單體化合物時，由于異構(gòu)體分子性質(zhì)不同，通常只有一種異構(gòu)體具有較強生物活性，而另一種基本無活性或活性較弱，或具有不同藥理活性甚至毒性［45］，如何從中分離得到單一的異構(gòu)體是急待解決的問題。隨著高效手性添加劑的發(fā)現(xiàn)和逆流色譜儀器的進一步完善，近年來HSCCC 在相關(guān)方面已經(jīng)得到了成功應(yīng)用。通過HSCCC 分離羧酸、糖苷、萜類生物堿等異構(gòu)體時，主要使用乙酸乙酯?水、正丁醇?水等強極性體系；分離多酚、苯丙類、苷類、芳香酸等異構(gòu)體時，大多采用甲基叔丁基醚?水、正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水等中等極性體系。此外，還可采用逆流色譜閉路循環(huán)、多重雙向洗脫模式等多樣化洗脫模式適當(dāng)提高異構(gòu)體分子間的色譜分離度［46?47］。

2.3.1 立體異構(gòu) 兒茶素、表兒茶素互為構(gòu)象異構(gòu)體，均屬于黃烷醇多酚類化合物，但對兩者大量制備分離方法的研究報道較少。成超等［48］采用HSCCC 實現(xiàn)了2 種成分的完全分離，在120 min 內(nèi)以正己烷?乙酸乙酯?水（1 ∶20 ∶20） 為溶劑系統(tǒng)，得到了兩者純度分別在99%、95%以上，同時在柱體積放大約6 倍的情況下可獲得上樣量放大50 倍的理想制備分離效果，這正是該技術(shù)的優(yōu)勢所在［48］。段文娟等［49］采用乙酸乙酯?正丁醇?甲醇?水（5 ∶0.7 ∶1 ∶5）、乙酸乙酯?正丁醇?甲醇?水（5 ∶0.5 ∶1 ∶5） 作為溶劑體系，從連翹果實中分離制備了2 對木脂素類立體異構(gòu)，即（＋） 松脂醇單甲醚?β?D?葡萄糖苷和連翹苷、（＋） 松脂醇?β?D?葡萄糖苷和（＋） 表松脂醇?4′?O?β?D?葡萄糖苷。

2.3.2 構(gòu)造異構(gòu) 在HSCCC 一步法分離過程中，有時很難找到理想的高純度溶劑體系，制備高效液相色譜法（prep?HPLC） 常作為額外的分離步驟來實現(xiàn)HSCCC 和HPLC 之間的互補作用［50］。在大黃蒽醌糖苷傳統(tǒng)的分離過程中，通過二氧化硅、凝膠色譜法分離大黃酚1?O?β?D?葡萄糖苷、大黃酚8?O?β?D葡萄糖苷2 種異構(gòu)體時存在很大的困難，Chen 等［51］通過prep?HPLC 結(jié)合HSCCC 成功分離了兩者。孫文宇等［46］開發(fā)了大孔樹脂?洗脫?推擠逆流色譜法，以正丁醇?乙酸乙酯?水（2 ∶3 ∶5） 為溶劑體系從30%白芍乙醇提取物中分離得到了芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，再采用洗脫?推擠逆流色譜和普通逆流色譜，以正己烷?乙酸乙酯?甲醇?水（0.5 ∶5 ∶1 ∶5） 為溶劑體系，從其95% 提取物中分離得到苯甲酰芍藥苷、6′?O?苯甲酰芍藥內(nèi)酯苷，純度均高于95%。

3 結(jié)語

國內(nèi)外關(guān)于從天然產(chǎn)物中分離純化單體化合物的工藝優(yōu)化過程報道較少，基本上仍停留在溶劑提取、常壓柱色譜水平，傳統(tǒng)分離方法對含有量低、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似、不能結(jié)晶組分的分離提純常受到限制，存在固態(tài)載體吸附損耗、樣品變性、回收率低等問題。HSCCC 可在短時間內(nèi)實現(xiàn)高效分離和分析，具有無固體載體、避免分離樣品與固體載體表面產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而變性、不可逆吸附等優(yōu)點，而且對樣品預(yù)處理要求較低，適用于粗提取物分離，從而提供了更便捷、更有效、產(chǎn)率和純度更高的提取方法，極大地減少了昂貴標(biāo)準(zhǔn)品購買成本及樣品制備富集負(fù)擔(dān)。但該技術(shù)在溶劑體系的選擇和優(yōu)化方面尚無更充分的理論依據(jù)，只能根據(jù)經(jīng)驗來減少實驗次數(shù)，進而篩選出較佳的溶劑系統(tǒng)，故仍需要繼續(xù)探索如何能在此基礎(chǔ)上進一步創(chuàng)新，使其逐漸發(fā)展成一種應(yīng)用更廣的色譜技術(shù)。