趨化因子受體CCR7依賴的樹突狀細(xì)胞遷移的調(diào)控機(jī)制①

程玉潔 劉 娟 (海軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所暨醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是連接天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵橋梁，DC的功能調(diào)控決定了免疫應(yīng)答的整體平衡。DC廣泛分布于淋巴及非淋巴組織，它的體內(nèi)遷移對于其成熟活化及功能調(diào)控至關(guān)重要[1]。DC體內(nèi)遷移受到趨化因子及趨化因子受體相互作用的精密調(diào)控。趨化因子CCL19/CCL21作用于DC表面的CCR7，引導(dǎo)DC最終遷移到外周免疫器官，對激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答及維持免疫耐受都發(fā)揮重要作用[2,3]。

穩(wěn)態(tài)情況下，非淋巴組織的未成熟DC(immature DC，imDC)經(jīng)歷自發(fā)的成熟過程，形成半成熟DC(semimature DC，smDC)。病原體或炎癥信號刺激后，imDC活化為成熟DC(mature DC，mDC)。半成熟DC和mDC上調(diào)趨化因子CCR7(C-C chemokine receptor type 7)，在趨化因子CCL19和CCL21(C-C motif chemokine 21)的作用下沿著淋巴管遷移，并穿過被膜下淋巴竇(subcapsular sinus，SCS)，進(jìn)入引流淋巴結(jié)[4,5]。CCL21的另外一個受體為非典型趨化因子受體4(atypical chemokine receptor 4，ACKR4)。ACKR4表達(dá)于SCS的內(nèi)皮細(xì)胞表面，與CCL21結(jié)合后可以捕獲并內(nèi)吞降解CCL21，從而在淋巴結(jié)中形成一個朝向T細(xì)胞區(qū)CCL21的濃度梯度，最終將DC趨化至T細(xì)胞區(qū)，進(jìn)一步激活T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答[6,7]。除外CCR7，其他的趨化因子受體也被證實(shí)參與影響DC的體內(nèi)遷移。如皮膚受過敏原刺激后，CD301b+DC顯著上調(diào)CCR8并在CD169+SIGN-R1+巨噬細(xì)胞分泌的CCL8的刺激下遷移至淋巴組織，繼而活化Th2細(xì)胞最終激發(fā)過敏性免疫應(yīng)答[8]。本文重點(diǎn)討論CCR7信號介導(dǎo)的DC遷移及其調(diào)控機(jī)制。

1 CCR7依賴DC遷移的信號活化機(jī)制

CCR7是一種七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，CCL19和CCL21是CCR7僅有的配體，DC通過細(xì)胞膜上的CCR7感知淋巴管中的細(xì)胞因子濃度梯度而精準(zhǔn)定向遷移。有研究表明CCR7對CCL19的反應(yīng)可能比CCL21的反應(yīng)時間更短，且只有CCL19可以有效地刺激CCR7磷酸化和內(nèi)化，導(dǎo)致受體脫敏[9]。體外實(shí)驗(yàn)中觀察到細(xì)胞對低濃度的CCL19和CCL21表現(xiàn)出相似的敏感性，但是當(dāng)細(xì)胞同時暴露于CCL21和CCL19相同梯度甚至相反梯度時，細(xì)胞會優(yōu)先向CCL21方向遷移。這一現(xiàn)象可能與CCL21與基質(zhì)蛋白多糖和信號緊密結(jié)合，不需要內(nèi)化有關(guān)[10]。然而在體內(nèi)情況下，CCR7如何區(qū)分識別CCL19和CCL21來源的趨化信號以調(diào)節(jié)DC遷移和免疫應(yīng)答尚不清楚。

CCR7信號活化與蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)密切相關(guān)。聚唾液酸化是將多聚唾液酸連接到糖苷上的過程，由多聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST8Sia Ⅱ和ST8Sia Ⅳ介導(dǎo)。研究表明，St8sia4酶缺失后，小鼠淋巴結(jié)體積明顯變小，DC遷移能力幾乎消失。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DC的CCR7分子能夠攜帶聚唾液酸，CCL21的C端與唾液酸結(jié)合后能夠解除其全長的自我抑制，促進(jìn)CCR7和CCL21有效結(jié)合，觸發(fā)遷移過程和炎癥應(yīng)答[11]。此外，多個胞內(nèi)蛋白對于促進(jìn)CCR7介導(dǎo)的遷移信號和適應(yīng)性免疫活化有重要作用，如磷脂酰肌醇3激酶PI3Kγ(phosphatidylinositol 3-kinase-γ)[12]、糖基磷脂酰肌醇錨蛋白Sema7A(GPI-anchored protein semaphorin 7A)[13]、白三烯C4轉(zhuǎn)運(yùn)體(leukotriene C4 transporter，MRP1)[14]等。由于CCR7信號活化觸發(fā)的DC遷移在免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，機(jī)體需要復(fù)雜的胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)CCR7信號，確保DC受病原體刺激后能夠快速動員并到達(dá)次級淋巴結(jié)，而在遷移后期能夠及時“剎車”，以調(diào)節(jié)免疫活化及免疫耐受的平衡。研究表明，骨架收縮、代謝平衡、表觀調(diào)控等胞內(nèi)過程在CCR7信號及DC遷移過程中發(fā)揮多樣化的調(diào)控作用，影響免疫應(yīng)答的最終效應(yīng)。

2 CCR7依賴的DC遷移的信號調(diào)控機(jī)制

2.1骨架收縮 細(xì)胞骨架是細(xì)胞維持形態(tài)、運(yùn)動、功能的重要成分。骨架收縮不僅提供了細(xì)胞運(yùn)動的原動力，也在多個層面發(fā)揮了調(diào)控作用。肌球蛋白收縮和肌動蛋白的聚合是細(xì)胞遷移的基本特征和動力。肌動蛋白在頭部聚集，肌球蛋白在尾部收縮，以維持肌動蛋白的逆流，產(chǎn)生細(xì)胞與環(huán)境之間的摩擦力，使得細(xì)胞朝著頭部方向運(yùn)動，該過程決定了細(xì)胞極性和運(yùn)動的方向[15]。上述機(jī)制是免疫細(xì)胞遷移過程中骨架重塑的一般性特征，但是DC又有其獨(dú)特的方式。

imDC在攝取抗原之后成熟活化，形成mDC并攜帶抗原遷移至淋巴結(jié)，進(jìn)而刺激獲得性免疫應(yīng)答的發(fā)生。研究表明，mDC比imDC表達(dá)更高水平的CCR7，從而對趨化因子受體CCL19/CCL21的反應(yīng)性更高。除此之外，細(xì)胞內(nèi)是否存在其他機(jī)制導(dǎo)致imDC和mDC對趨化因子的反應(yīng)方式不同，從而決定imDC和mDC的遷移特征？近期研究表明，imDC的遷移依賴兩種肌動蛋白(actin)調(diào)節(jié)機(jī)制，一種是細(xì)胞尾部RhoA-mDia1依賴的actin池，用來促進(jìn)細(xì)胞向前運(yùn)動，一種是細(xì)胞頭部Cdc42-Arp2/3依賴的actin池，用來抑制細(xì)胞遷移但促進(jìn)抗原攝取。當(dāng)DC成熟后，Arp2/3依賴的actin明顯減少，Rho依賴的actin明顯增多，使得mDC降低抗原攝取能力，并快速、持續(xù)地往淋巴結(jié)遷移[16]。因而，骨架系統(tǒng)能夠根據(jù)DC的不同成熟狀態(tài)及需求進(jìn)行重塑，進(jìn)而決定其遷移類型。該課題組對該過程的胞內(nèi)信號基礎(chǔ)繼續(xù)深入探索，發(fā)現(xiàn)DC完成攝取抗原刺激后，巨胞飲降低，誘導(dǎo)離子通道蛋白TRPML1(transient receptor potential cation channel,mucolipin subfamily,member 1)表達(dá)上調(diào)，TRPML1繼而誘導(dǎo)溶酶體鈣流上升，活化細(xì)胞尾部肌動蛋白和肌球蛋白重組，繼而促進(jìn)遷移。溶酶體鈣流通過轉(zhuǎn)錄因子TFEB誘導(dǎo)TRPML1轉(zhuǎn)錄，形成正反饋調(diào)節(jié)[17]。該研究表明溶酶體信號可以通過調(diào)控細(xì)胞骨架，促進(jìn)病原體信號和遷移信號的交叉調(diào)節(jié)，促進(jìn)DC高效工作，吞噬抗原后立刻向淋巴結(jié)遷移。因而，DC遷移的時機(jī)、極性、速度都受到骨架系統(tǒng)的靈活調(diào)控。在DC中，尾部的actin聚集可以產(chǎn)生快速的定向遷移，而頭部的actin聚集引發(fā)的是一種慢速遷移。

2.2代謝調(diào)控 代謝作為細(xì)胞中一種極為敏感而靈活的反應(yīng)系統(tǒng)對細(xì)胞表型和功能有明顯影響。DC表達(dá)大量不同類型的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)及細(xì)胞因子受體，感知特定的病原體模式分子或環(huán)境細(xì)胞因子改變，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。不同類型和功能狀態(tài)下的DC有著十分多樣的、動態(tài)的代謝特征，以維持細(xì)胞能量和物質(zhì)需求，保證DC的分化和功能穩(wěn)定[18]。靜息狀態(tài)時，DC主要通過氧化磷酸化和脂肪酸氧化獲得能量。在TLR(Toll-like receptors)刺激后，DC短時內(nèi)迅速上調(diào)糖酵解速率并通過活化誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)誘導(dǎo)一氧化氮(NO)的產(chǎn)生而下調(diào)氧化磷酸化水平[19,20]。糖酵解的增強(qiáng)不僅為DC活化供能，產(chǎn)生的檸檬酸鹽也可以作為體內(nèi)合成游離脂肪酸的前體，促進(jìn)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成以產(chǎn)生和分泌DC活化途徑中所需要的蛋白質(zhì)，這一過程依賴于胞內(nèi)TBK1/IKKε/Akt通路傳遞信號[21]。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)在干擾素誘導(dǎo)劑的作用下氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)和脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)活化上調(diào)并產(chǎn)生干擾素發(fā)揮抗病毒功能，通過CCR9傳遞外周抗原的作用在胸腺內(nèi)誘導(dǎo)免疫耐受的形成[22]。另外，在營養(yǎng)缺乏，乳酸、腺苷等代謝物堆積等情況下，DC會出現(xiàn)一些致耐受的表型，產(chǎn)生TGF-β、IL-10等免疫抑制成分，表達(dá)調(diào)節(jié)性DC(regulatory DC)的特征。此時，腺苷通過誘導(dǎo)AMPK，抑制糖酵解，促進(jìn)氧化磷酸化，抑制DC活化。

淋巴組織處于低氧環(huán)境，而低氧狀態(tài)對DC分化發(fā)育和功能的發(fā)揮影響顯著。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α)與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23]。在常氧情況下，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α被pVHL結(jié)合從而發(fā)生降解。此時葡萄糖攝入后轉(zhuǎn)化為丙酮酸，因氧氣充足，丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，促進(jìn)線粒體氧化磷酸化。而缺氧情況下，HIF-1α活化入核，與HIF-1β及p300/CBP形成復(fù)合體，誘導(dǎo)糖酵解基因表達(dá)，引起糖酵解加強(qiáng)，乳酸堆積。HIF-1α還能夠抑制PDH而降低乙酰輔酶A生成，抑制氧化磷酸化，并且促進(jìn)琥珀酸鹽的富集[24]。近期研究表明抑制糖酵解會損害DC樹突形狀延長、活力的維持、CCR7寡聚和向引流淋巴結(jié)遷移的能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，無論DC受何種因素激活，胞內(nèi)誘導(dǎo)糖酵解對其遷移運(yùn)動的支持和CCR7寡聚都是必要的[25]。然而，CCR7信號激活通過何種機(jī)制觸發(fā)DC糖酵解，DC遷移過程中HIF-1α具體發(fā)揮了怎樣的作用、受到何種調(diào)控并影響炎癥進(jìn)展過程尚不清楚。

2.3表觀修飾 DC表面模式識別受體快速識別和響應(yīng)來自入侵病原體或自身受損細(xì)胞的信號，活化后觸發(fā)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，選擇性地誘導(dǎo)基因活化或沉默，調(diào)控免疫應(yīng)答的最終效應(yīng)[26,27]。表觀遺傳調(diào)控包括DNA甲基化、染色質(zhì)組蛋白翻譯后修飾、核小體重塑、非編碼RNA等機(jī)制，共同調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。組蛋白修飾發(fā)生快速且動態(tài)可逆，可以在刺激信號到達(dá)細(xì)胞膜表面幾分鐘內(nèi)在染色質(zhì)上出現(xiàn)繼而消失，影響免疫細(xì)胞的分化或功能[28]。

在肺臟組織中，cDC前體(pre-cDCs)來源的cDC高表達(dá)CCR7并高效介導(dǎo)DC遷移至淋巴結(jié)，而單核細(xì)胞來源的DC(moDC)細(xì)胞膜上表達(dá)的CCR7較低，因而moDC難以從肺部遷移至淋巴結(jié)，而是在肺臟局部發(fā)揮介導(dǎo)過敏和炎癥反應(yīng)的作用。深入研究表明，肺臟cDC和moDC的CCR7表達(dá)及趨化功能差異受到表觀修飾的調(diào)節(jié)。cDC和moDC的CCR7基因啟動子的H3K27me3(trimethylation of histone 3 lysine 27)水平存在差異。這種CCR7基因表觀修飾差異在細(xì)胞發(fā)育早期尚未形成，而是在單核細(xì)胞向moDC分化的過程中逐漸形成的[29]。然而是何種因素導(dǎo)致了組蛋白修飾的改變，該現(xiàn)象的發(fā)生是DC對肺臟局部免疫微環(huán)境的被動適應(yīng)，還是譜系分化過程中其他因素導(dǎo)致的主動改變尚無明確答案。此外，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2(methyltransferaseEnhancer of zeste homolog 2)通過對核外骨架結(jié)合蛋白(talin)的直接甲基化破壞了其與肌動蛋白的結(jié)合從而調(diào)控細(xì)胞的黏附和遷移[30]。因而，組蛋白修飾酶對于非組蛋白的修飾可能對DC遷移調(diào)控也發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。

長鏈非編碼RNA(long non coding RNA，lncRNA)是一類具有廣泛生物學(xué)功能的非編碼RNA，通過多種作用機(jī)制調(diào)控胞內(nèi)信號，與細(xì)胞分化發(fā)育、周期調(diào)控等眾多生命活動密切相關(guān)。近年來研究表明，lncRNA在免疫細(xì)胞發(fā)育和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要的作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，lnc RNA Dpf3可以阻礙CCR7依賴的DC的遷移，其機(jī)制為Dpf3直接結(jié)合HIF-1a并抑制其所誘導(dǎo)的糖酵解功能，調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白間相互作用[31]。

3 DC遷移與自身免疫性疾病

DC作為天然免疫和獲得性免疫的連接橋梁，與自身免疫性疾病及免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。DC通過參與胸腺T細(xì)胞陰性選擇，使其獲得對自身抗原的耐受從而維持機(jī)體多數(shù)狀態(tài)下的免疫穩(wěn)態(tài)[32]。imDC或調(diào)節(jié)性DC能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞失能或凋亡、促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞生成和功能等，維持外周耐受[33]。當(dāng)免疫穩(wěn)態(tài)被打破，將觸發(fā)免疫系統(tǒng)針對自身組織或細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生[34]。如NF-κB信號一直被認(rèn)為是促炎相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，近期研究表明該通路中一個重要的活化因子IKKβ對于穩(wěn)態(tài)情況下的DC朝向淋巴結(jié)的遷移和聚集有重要作用，能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化，促進(jìn)免疫耐受的形成。敲除IKKβ后，小鼠穩(wěn)態(tài)DC遷移和Treg細(xì)胞生成明顯降低，自身免疫性疾病發(fā)生概率明顯上升[35]。

越來越多的研究表明DC遷移紊亂可能導(dǎo)致DC在炎癥部位的過度聚集及活化，導(dǎo)致組織過度炎癥，甚至引發(fā)自身免疫性疾病。CCL19/CCL21被證明與多種自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)及炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CCL19/CCL21或其受體CCR7的基因缺失小鼠中實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、抗原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)病明顯減弱，且DC介導(dǎo)的Th1及Th17細(xì)胞活化顯著降低。因此CCL19/CCL21依賴DC遷移及功能活化對于維持免疫應(yīng)答及免疫調(diào)控的動態(tài)平衡發(fā)揮關(guān)鍵作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，抑制劑FTY720通過減少CCL19分泌和降低DC上CCR7功能顯著抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率和嚴(yán)重程度[36]。因此，DC相關(guān)趨化因子及趨化因子受體可能成為自身免疫性疾病的潛在診斷標(biāo)識和治療靶點(diǎn)。

4 討論與展望

2011年，諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎授予了三位在天然免疫領(lǐng)域做出杰出貢獻(xiàn)的免疫學(xué)家。其中，Steinman等[37]，DC的發(fā)現(xiàn)者，在DC的生理功能、臨床應(yīng)用等方面做出了突出貢獻(xiàn)。1972年發(fā)現(xiàn)DC以來，對DC發(fā)育分化、功能調(diào)控、臨床應(yīng)用的研究不斷取得突破[37]。2010年4月29日，由美國Dendreon公司生產(chǎn)的DC疫苗Provenge成為首個被美國FDA批準(zhǔn)正式上市的治療性腫瘤疫苗，并用于晚期尤其是對激素療法失效的前列腺癌患者[38]。此外，CCR7在多種腫瘤如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥中表達(dá)，這種在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中共同表達(dá)的特點(diǎn)可能成為DC疫苗腫瘤治療的新靶點(diǎn)[39]。可以看出，DC的理論和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究在認(rèn)識免疫應(yīng)答根本原理、攻克重大免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮了重要作用。

然而DC領(lǐng)域仍然有許多懸而未決的重要科學(xué)問題亟待進(jìn)一步研究。DC的分類是否可以更加細(xì)化、定居外周的DC亞群和遷移性的DC亞群在早期是如何劃分的、DC遷移過程是否受到未知代謝物的調(diào)控、在穩(wěn)定狀態(tài)和炎癥狀態(tài)過程中的DC遷移存在哪些不同，這些領(lǐng)域都等待進(jìn)一步探究。相信隨著研究的深入，以DC為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫療法將在自身免疫性疾病、感染性疾病和腫瘤等疾病的治療與干預(yù)中發(fā)揮更加重要的作用。