Tim-3抗腫瘤免疫的研究進(jìn)展①

董 頔 陳志芳

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,烏魯木齊 830054)

免疫細(xì)胞和分子是腫瘤生物學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點，具有支持或抑制腫瘤發(fā)展、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。腫瘤免疫逃逸是指腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)識別和攻擊，從而得以在體內(nèi)生存和增殖的現(xiàn)象[1]。近年來，針對腫瘤免疫逃逸機(jī)制進(jìn)行的癌癥免疫療法取得了令人矚目的臨床效果[2，3]。程序性死亡受體(programmed cell death protein 1，PD-1)作為免疫抑制分子，在腫瘤免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[4]。盡管針對PD-1的檢查點阻斷策略取得了成功，但大部分癌癥患者尚未從這種新療法中獲益[5]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)已被發(fā)現(xiàn)在傳染病、自身免疫疾病和腫瘤小鼠模型中介導(dǎo)免疫耐受[6-8]。Tim-3作為癌癥免疫療法的潛在候選因子已經(jīng)獲得突出地位，并且已經(jīng)證明Tim-3與其他檢查點抑制劑的體內(nèi)阻斷增強(qiáng)了抗腫瘤免疫力并抑制了幾種臨床前腫瘤模型中的腫瘤生長[8-10]。

1 Tim-3的分子結(jié)構(gòu)

Tim-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)在人和小鼠的多種免疫細(xì)胞類型中表達(dá)。小鼠的Tim-3由281個氨基酸殘基組成，而其人類同源物由302個氨基酸殘基組成，與小鼠Tim-3具有63%的同源性[11]。Tim-3屬于免疫球蛋白超家族(IgSF)，包括膜遠(yuǎn)端免疫球蛋白(IgV)結(jié)構(gòu)域、胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、黏蛋白區(qū)和信號肽區(qū)。其中胞漿區(qū)主要功能是參與信號傳遞，決定下游信號通路的傳導(dǎo)，IgV結(jié)構(gòu)域與適當(dāng)配體的結(jié)合對于Tim-3的免疫調(diào)節(jié)具有重要作用，有助于誘導(dǎo)外周耐受和抑制抗腫瘤免疫[12]。與跨膜結(jié)構(gòu)域相鄰的Tim-3細(xì)胞質(zhì)尾部含有5個酪氨酸殘基的保守區(qū)域，其中兩個對于偶聯(lián)到下游信號傳導(dǎo)途徑至關(guān)重要[13]。這兩個酪氨酸殘基的肽序列在人和小鼠之間高度保守，并且作為SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序起作用。含SH2結(jié)構(gòu)域的激酶許多是T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)信號通路的關(guān)鍵組成部分，說明Tim-3和TCR通路之間存在功能關(guān)系[14]。

2 Tim-3的配體

2.1Galectin-9 關(guān)于Tim-3配體，最初鑒定了兩種細(xì)胞膜外相關(guān)蛋白，其分子量分別約為35 kD和60 kD，并與Tim-3IgV結(jié)構(gòu)域結(jié)合。分子量為35 kD的細(xì)胞膜外相關(guān)蛋白在生物化學(xué)上被表征為C型凝集素Galectin-9[15]。Galectin-9是一種含有兩個串聯(lián)碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域的可溶性蛋白質(zhì)，特異性識別Tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域中N-連接糖鏈的結(jié)構(gòu)，但不識別Tim-2和Tim-4等Tim家族蛋白質(zhì)[16]。與Tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域和其他半乳糖凝集素(包括半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-4)的相互作用相比，Tim-3IgV結(jié)構(gòu)域和Galectin-9之間的結(jié)合具有最高親和力，表明Galectin-9和Tim-3之間存在特異性結(jié)合的相互作用[17]。Galectin-9和Tim-3之間的相互作用引發(fā)Th1細(xì)胞死亡，從而抑制組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，減少自身免疫疾病的發(fā)生[18]。相同的，Galectin-9還誘導(dǎo)結(jié)腸癌Tim-3+CD8+TIL的凋亡[19]。然而，因為Galectin-9被發(fā)現(xiàn)可增加Tim-3介導(dǎo)的NK細(xì)胞系中IFN-γ的產(chǎn)生，所以并非所有Galectin-9-Tim-3相互作用都會導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。在人類THP-1骨髓細(xì)胞中，Galectin-9激活Tim-3介導(dǎo)的PI3KmTOR信號傳導(dǎo)通路而不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。

Galectin-9和Tim-3在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上的相互作用可能會導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生改變，其通過改變IL-12和IL-23的產(chǎn)生從而影響Th1或Th17的應(yīng)答[22]。

Tim-3與Galectin-9之間存在反向作用。小鼠結(jié)核病模型的研究表明，Tim-3通過小鼠和人類細(xì)胞中Galectin-9依賴性機(jī)制，對誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中的抗分枝桿菌活性非常重要[23]。研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3 T細(xì)胞轉(zhuǎn)基因CD4+T細(xì)胞控制Galectin-9陽性的巨噬細(xì)胞中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)制，進(jìn)一步證實了Tim-3-Galectin-9反式相互作用介導(dǎo)的負(fù)性信號對于巨噬細(xì)胞中的抗結(jié)核分枝桿菌活性至關(guān)重要[24]。這種負(fù)性信號通路在控制感染者的結(jié)核分枝桿菌生長方面起著重要作用，這些人T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)會增加。總的來說，Tim-3反向作用于Galectin-9，使Th1和Tc1控制細(xì)胞內(nèi)病原體來清除被感染的巨噬細(xì)胞[25]。IFN-γ誘導(dǎo)Galectin-9表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體的清除，同時確保T細(xì)胞上的Tim-3分子不會對Th1細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生克隆增殖[26]。

2.2Ceacam1 第二個被發(fā)現(xiàn)的Tim-3配體是癌胚抗原細(xì)胞黏附分子1(Ceacam1)，其分子量約為60 kD[27]。Ceacam1膜遠(yuǎn)端Ig V區(qū)是一種高度保守的結(jié)構(gòu)，與Tim-3的Ig V區(qū)具有結(jié)構(gòu)相似性，并且沿著它們的FG環(huán)相互作用，研究者們推測這就是配體的結(jié)合位點[28]。當(dāng)Ceacam1過表達(dá)時，可以顯著增強(qiáng) Tim-3 分子的負(fù)性免疫調(diào)控功能，并且在沒有Ceacam1表達(dá)的情況下Tim-3的抑制功能會被削弱[27]。此外，Ceacam1-Tim-3反式相互作用會抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能，并且對維持T細(xì)胞耐受是必需的[29]。Galectin-9和Ceacam1分別與Tim-3的Ig V區(qū)中的不同區(qū)域結(jié)合，均會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)尾部釋放Tim-3信號通路抑制性調(diào)節(jié)劑Bat3這樣的下游效應(yīng)發(fā)生[30]。因此，這兩種配體可能在調(diào)節(jié)Tim-3信號傳導(dǎo)中具有協(xié)同作用。

2.3HMGB1 高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)作為Tim-3配體，是一種與損傷相關(guān)的分子模式蛋白，可以感知內(nèi)源性危險信號[31]。HMGB1可以從活化的樹突狀細(xì)胞主動釋放，以促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的反應(yīng)。在樹突狀細(xì)胞中，HMGB1在核酸轉(zhuǎn)運到內(nèi)體囊泡過程中起關(guān)鍵作用，這是樹突狀細(xì)胞感知腫瘤衍生的應(yīng)激因子或病原體相關(guān)的分子模式的關(guān)鍵步驟，并產(chǎn)生對腫瘤或病原體感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)[32]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤浸潤性樹突狀細(xì)胞中Tim-3表達(dá)水平高于正常組織樹突狀細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)水平。Tim-3與HMGB1結(jié)合以阻斷核酸向內(nèi)體的轉(zhuǎn)運，從而抑制模式識別受體介導(dǎo)的對腫瘤衍生核酸的先天免疫應(yīng)答[33]。因此，阻斷Tim-3介導(dǎo)的核酸感應(yīng)系統(tǒng)的抑制作用可能會有助于DNA疫苗的開發(fā)和化療用藥的進(jìn)展。有趣的是，Tim-3上的HMGB1結(jié)合表位與Tim-3上的Ceacam1結(jié)合表位大部分重疊，F(xiàn)G環(huán)中的Q62(人類E62)是與HMGB1和Ceacam1相互作用的必需氨基酸殘基，由此衍生出了HMGB1和Ceacam1之間潛在競爭性結(jié)合Tim-3的問題[34]。

2.4PtdSer 磷脂酰絲氨酸(PtdSer)是Tim-3的非蛋白質(zhì)配體，與Tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域的FG-CC′環(huán)結(jié)合。 由于FG-CC′環(huán)形成的裂縫是所有Tim蛋白共有的特征結(jié)構(gòu)，因此PtdSer也是Tim家族其他蛋白的配體[35,36]。PtdSer與Tim蛋白的結(jié)合與凋亡細(xì)胞的清除有關(guān)[37]。因為T細(xì)胞沒有清除凋亡小體的作用，所以T細(xì)胞中Tim-3-PtdSer的相互作用目前尚不清楚[38]。然而，IL-10與Tim-3陽性的T細(xì)胞共表達(dá)，所以Tim-3與PtdSer的相互作用可能誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。

由于Tim-3 IgV結(jié)構(gòu)域中FG-CC′環(huán)存在重疊的結(jié)合位點，因此了解Ceacam1、HMGB1和PtdSer如何協(xié)調(diào)它們與Tim-3的相互作用并調(diào)節(jié)特異性免疫是非常重要的。

3 Tim-3與腫瘤

3.1Tim-3生物學(xué)特性與癌癥的關(guān)系 Tim-3除了在免疫細(xì)胞和腫瘤中的表達(dá)升高外，它的遺傳多態(tài)性也與癌癥有關(guān)。在中國人的啟動子區(qū)域(-574G/T，-882C/T，-1516G/T和-1541C/T)和編碼區(qū)域內(nèi)鑒定出Tim-3基因的多態(tài)性(+4259T/G，氨基酸取代物：精氨酸替換亮氨酸)[39]。攜帶+4259TG基因型的受試者與對照組相比，患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險增加2.81倍，且存活時間明顯縮短[40]。攜帶+4259 TG基因型和+4259G等位基因的受試者與對照組相比，胰腺癌患病率顯著增加[41]。

3.2Tim-3與癌癥預(yù)后 多種腫瘤的癌細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TILs)和內(nèi)皮細(xì)胞中均已發(fā)現(xiàn)Tim-3的表達(dá)[42]。已有充分證據(jù)表明，在腫瘤組織樣本Tim-3的蛋白水平和mRNA表達(dá)水平均升高，并且與前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、膀胱尿路上皮癌和宮頸癌患者的預(yù)后不良有關(guān)[19,43-46]。腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞中Tim-3表達(dá)增加也與CD8+T細(xì)胞功能障礙和HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌和前列腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[43,47]。同樣，胃癌患者NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)增加與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[4]。因此，人類免疫細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)增加可作為各種腫瘤的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。

3.3Tim-3參與腫瘤T細(xì)胞的調(diào)節(jié) 在不同癌癥中進(jìn)行的研究最終證實Tim-3由于其與腫瘤T細(xì)胞耗竭有關(guān)而充當(dāng)抗腫瘤免疫的負(fù)調(diào)節(jié)劑。在晚期黑色素瘤的患者中，有腫瘤-睪丸抗原家族NY-ESO-1抗原特異性表達(dá)的Tim-3+PD-1+CD8+T是腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞中功能高度失調(diào)的一種細(xì)胞，并且約30%的NYESO-1特異性CD8+T細(xì)胞表達(dá)Tim-3[48]。同樣的，在非小細(xì)胞肺癌患者中，近33%的CD8+TILs表達(dá)Tim-3[35]。在這些癌癥中，Tim-3+T細(xì)胞共同表達(dá)PD-1并表現(xiàn)出增殖功能和效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的不足。

最近的研究證明了Tim-3除了具有調(diào)節(jié)癌癥CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能，還在調(diào)節(jié)人Tim-3+Foxp3+Treg細(xì)胞中起到關(guān)鍵作用，肝細(xì)胞癌，卵巢癌，結(jié)腸癌和宮頸癌中均有Tim-3+Foxp3+Treg細(xì)胞的存在[19,46,47,49]。在非小細(xì)胞肺癌患者中，約60%的CD4+Foxp3+TILs中表達(dá)Tim-3[35]。TILs中Tim-3+Foxp3+Treg細(xì)胞的存在與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期癌癥有關(guān)。由于多種臨床模型腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)Tim-3+Foxp3+Treg細(xì)胞的存在，進(jìn)一步證實了Tim-3在Foxp3+Treg細(xì)胞中的作用[50]?？赡苁怯捎贗L-10的表達(dá)增加，這些模型中的腫瘤組織表達(dá)了比Tim-3-Foxp3+Treg細(xì)胞更具免疫抑制性的Tim-3+Foxp3+Treg細(xì)胞。在這些模型中，Tim-3+Foxp3+Treg細(xì)胞被認(rèn)為促進(jìn)了CD8+TIL功能失調(diào)。另一種假設(shè)表明腫瘤微環(huán)境驅(qū)動了Foxp3+Treg細(xì)胞活化，并且Tim-3表達(dá)增加導(dǎo)致了更嚴(yán)重的腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞的免疫抑制。

3.4Tim-3調(diào)節(jié)腫瘤固有免疫細(xì)胞 與Tim-3在T細(xì)胞上的可誘導(dǎo)性表達(dá)相比，在固有免疫細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了Tim-3的成組性表達(dá)。到目前為止進(jìn)行的大多數(shù)體內(nèi)研究已經(jīng)確定Tim-3在抗腫瘤固有免疫中起抑制作用[51]。

Tim-3已經(jīng)被證實在人單核細(xì)胞中具有直接抑制作用[52]。它在未刺激的外周血CD14+單核細(xì)胞上呈成組性表達(dá)，但TLR刺激后，伴隨IL-12產(chǎn)生的增加，Tim-3表達(dá)水平迅速下降。在通過TLR4/7刺激后，阻斷Tim-3會導(dǎo)致單核細(xì)胞中IL-12和IL-10的增加。

最近的一項研究表明，Tim-3在肝細(xì)胞癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)的表達(dá)是由包括TGF-β在內(nèi)的腫瘤衍生信號誘導(dǎo)的[53]。由于可溶性因子如IL-6的分泌，進(jìn)一步促進(jìn)了TAM介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌生長。此外，Tim-3的表達(dá)抑制了該模型中腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的活化。最近的研究表明M1巨噬細(xì)胞具有吞噬、呈遞抗原和促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生等多種功能，并有助于消除具有Tim-3低表達(dá)的癌細(xì)胞[54]。這證明了Tim-3在多種細(xì)胞類型中的起免疫抑制作用及其在腫瘤微環(huán)境中具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞相互作用的功能。

3.5Tim-3和腫瘤細(xì)胞 越來越多的證據(jù)表明，Tim-3的表達(dá)不僅限于免疫細(xì)胞，也在癌細(xì)胞上表達(dá)，如黑色素瘤、骨肉瘤、宮頸癌和腎透明細(xì)胞癌[44，48,55]。最近的兩項研究表明，Tim-3在急性髓性白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)中高表達(dá)， 但不在正常的造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cells，HSCs)中表達(dá)[56，57]。 由于急性髓性白血病患者同時含有LSCs和HSC，因此Tim-3可作為LSC的標(biāo)志物監(jiān)測急性髓性白血病干細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，還在淋巴瘤上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了Tim-3的表達(dá)。

Tim-3在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)說明了其在腫瘤進(jìn)展中的潛在作用。研究表明Tim-3可通過不同的機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，通過激活I(lǐng)L-6-STAT3途徑直接抑制CD4+T細(xì)胞以抑制Th1極化，或激活A(yù)ML細(xì)胞中的mTOR功能[58]。

由于Tim-3-Galectin-9負(fù)性信號通路對于骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)增殖至關(guān)重要， Tim-3在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)與其在TILs上的表達(dá)相似[59]。通過Galectin-9依賴機(jī)制形成MDSCs的免疫抑制功能從而在腫瘤免疫逃避中發(fā)揮重要作用。因此，需要進(jìn)一步研究以更好地了解Tim-3介導(dǎo)的免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用。

4 展望

越來越多的證據(jù)支持Tim-3與人類癌癥相關(guān)。無論是在實驗?zāi)Ｐ瓦€是在人體中，現(xiàn)在已經(jīng)確定，Tim-3和PD-1標(biāo)記多種癌癥的功能失調(diào)T細(xì)胞。此外，在效應(yīng)T細(xì)胞、Treg細(xì)胞和固有免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中觀察到Tim-3的免疫抑制作用,并且由于Tim-3也在非T細(xì)胞中表達(dá)，阻斷Tim-3可能將腫瘤微環(huán)境從免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ罨蚩鼓[瘤狀態(tài),以上發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在這些細(xì)胞中靶向Tim-3的重要性。由于Tim-3不僅在CD8+T細(xì)胞和Foxp3+Treg細(xì)胞這兩個關(guān)鍵的促腫瘤免疫抑制的免疫細(xì)胞上表達(dá)，并且在骨髓細(xì)胞、NK細(xì)胞、癌癥干細(xì)胞和癌細(xì)胞本身也有表達(dá)，而且Tim-3與免疫抑制和腫瘤促進(jìn)作用相關(guān)，所以Tim-3是抗癌免疫治療的一個非常合適的靶向目標(biāo)。

目前的實驗結(jié)果說明阻斷Tim-3可以提高細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，Tim-3單克隆抗體可能與其他免疫治療方式共同作用來增加抗腫瘤治療的功效。徹底了解Tim-3在各種腫瘤和腫瘤免疫治療模型中的不同作用，有利于進(jìn)一步靶向Tim-3的藥物開發(fā)和設(shè)計與PD-1或CTLA-4單克隆抗體的組合療法。