丙泊酚抑制wnt/β-catenin通路對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)作用①

黃 佳 潘 玫 汪利群 涂云霞

(江西省婦幼保健院生殖健康科，南昌 330006)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，目前全球每年大約有47萬例宮頸癌新增病例[1]。研究數(shù)據(jù)表明，宮頸癌是導(dǎo)致女性死亡的主要疾病之一，目前全球每年因?qū)m頸癌失去生命的患者數(shù)超過20萬例[2,3]。隨著科技的進(jìn)步，醫(yī)療水平的提升，宮頸癌的治療效果顯著改善，但死于宮頸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者仍然較多[4]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系[5,6]。現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，參與 EMT 過程的信號(hào)通路包括Wnt、TGF-β、notch等信號(hào)通路，其中Wnt信號(hào)通路是一條經(jīng)典的通路。Wnt信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力[7]。丙泊酚是一種常見的靜脈麻醉藥，多用于腫瘤切除手術(shù)前的麻醉。近年來研究表明，丙泊酚可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。汪威等[8]研究表明：丙泊酚可以抑制wnt/β-catenin 通路，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移力。本文旨在研究丙泊酚抑制wnt/β-catenin 通路對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的調(diào)節(jié)作用，以期了解丙泊酚抑制wnt/β-catenin 通路對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力的作用機(jī)理，從而為宮頸癌患者治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細(xì)胞 宮頸癌HELA細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2動(dòng)物 成年雌性Wistar大鼠60只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022，普通級(jí)，分12個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只，于本院動(dòng)物中心在15～18℃，相對(duì)濕度為35%～40%條件下飼養(yǎng)。

1.1.3主要試劑與儀器 丙泊酚(樂維靜；國(guó)藥準(zhǔn)字H20030115)購(gòu)自四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司；Caspase-3、Caspase-9、Ki67、PCNA購(gòu)自Abcam公司；Annexin V-FITC、MMP-9和VEGF抗體均購(gòu)自Santa Cruze Biotechnology 公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；磷酸緩沖液PBS購(gòu)自天津科密歐有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自上海博升生物；CCK 試劑盒購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；熒光分光光度計(jì)購(gòu)自上海儀電分析儀器有限公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2方法

1.2.1分組干預(yù) 將人宮頸癌HELA細(xì)胞分為：空白組(Control)、低劑量丙泊酚組(propofol 2.5 μg/ml)、中劑量丙泊酚組(propofol 5 μg/ml)、高劑量丙泊酚組(propofol 10 μg/ml)，分別為0、2.5、5、10 μg/ml 的丙泊酚預(yù)處理。

將60只成年雌性Wistar大鼠分為：空白組(Control)、低劑量丙泊酚組(propofol 10 mg/kg)、中劑量丙泊酚組(propofol 20 mg/kg)、高劑量丙泊酚組(propofol 50 mg/kg)，分別腹腔注射0、10、20、50 mg/kg 的丙泊酚。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將人宮頸癌HELA細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3建立模型 建立宮頸癌移植瘤大鼠動(dòng)物模型及判斷建模是否成功參考高巋然等[9]實(shí)驗(yàn)方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌HELA細(xì)胞，消化、離心后在大鼠皮下注射接種 2.5×1010個(gè)/ml，隔日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況以及大鼠的一般情況。

1.2.4CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 常規(guī)培養(yǎng)宮頸癌HELA細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度大于80%時(shí)，使用胰蛋白酶消化后離心，PBS溶液洗滌，然后使用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×104個(gè)/ml。在96孔板上，每孔加入細(xì)胞懸液90 μl，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別加入0、2.5、5、10 μg/ml的丙泊酚。每孔加入10 μl CCK8試劑輕敲培養(yǎng)板混勻，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，取出測(cè)定其在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，并按照CCK 試劑盒說明書計(jì)算細(xì)胞增殖情況。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 恒溫離心機(jī)保持4℃，1 000 r/min離心 5 min 收集細(xì)胞；收集細(xì)胞后加入100 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞并加入5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI，輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力 參照Hu等[10]的Transwell研究方法。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，制成無FBS懸浮液恒溫培養(yǎng)1 d后，隨機(jī)選取視野使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7大鼠模型試驗(yàn) 將60只成年雌性Wistar大鼠皮下注射宮頸癌HELA細(xì)胞建立移植瘤模型，分別將低中高劑量丙泊酚10、20、50 mg/kg腹腔注射，并設(shè)置空白對(duì)照組，注射等量的生理鹽水。30 d后檢測(cè)腫瘤重量。

1.2.8Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 按照Western blot 檢測(cè)方法操作，蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，采用Imagaquent 5.1軟件對(duì)Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9、MMP-9、VEGF蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與GAPDH灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.9免疫組化觀察 本實(shí)驗(yàn)中免疫組化采用PV 法染色，將石蠟切片5 μm，常規(guī)脫蠟后使用3%過氧化氫甲醇溶液室溫浸泡15 min并使用 4%胃蛋白酶消化15 min，滴加一抗 VEGF(效價(jià)1∶50)，Ki67 (效價(jià)1∶50)置于濕盒中恒溫冰箱保存12 h，使用0.01 mol/L PBS清洗后滴加二抗葡聚糖-酶復(fù)合物，37℃孵育60 min，再次使用0.01 mol/L PBS清洗，顯色后使用蘇木素復(fù)染1 min脫水并封片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，方差分析使用單因素方差分析，若P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響 CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，使用不同濃度丙泊酚處理24 h、48 h及72 h對(duì)宮頸癌HCLA細(xì)胞生長(zhǎng)能力均無顯著影響(P>0.05)；使用丙泊酚處理96 h后的宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)能力顯著低于空白組，且高劑量丙泊酚組宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)能力顯著低于中劑量丙泊酚組和低劑量組，中劑量丙泊酚組宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)能力顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。與空白組相比，丙泊酚處理組Ki67及PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低，且高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B。

圖1 丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of propofol on growth of cervical cancer HELA cellsNote:A.Cell proliferation detected by CCK8;B.Expressions of Ki67 and PCNA proteins vs Control，*.P<0.05.

2.2丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡情況的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，丙泊酚預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組，高劑量丙泊酚組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡率顯著高于中劑量組，中劑量組宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡率顯著高于低劑量組(P<0.05)，見圖2A；與空白組相比，丙泊酚處理組活化的Caspase-3和Caspase-9水平顯著升高且高劑量丙泊酚組活化的Caspase-3和Caspase-9水平顯著高于中劑量組，中劑量組活化的Caspase-3和Caspase-9水平顯著高于低劑量組(P<0.05)見圖2B。

圖2 丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞凋亡情況的影響Fig.2 Effects of propofol on apoptosis of cervical cancer HELA cellsNote:A.Detection of apoptosis by flow cytometry；B.Expressions of related apoptosis proteins Caspase-3 and Caspase-9.*.P<0.05 vs Control.

2.3丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況的影響 Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，相比空白組，丙泊酚預(yù)處理組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低，高劑量組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著低于中劑量組，中劑量組單位面積侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A；與空白組相比，丙泊酚處理組MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平顯著降低，高劑量組MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平顯著低于中劑量組，中劑量組MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平顯著低于低劑量組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3B。

圖3 丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力影響Fig.3 Effects of propofol on motor ability of cervical cancer HELA cellsNote:A.Cell motor ability detected by Transwell；B.Expressions of cell migration-related proteins MMP-9 and VEGF.*.P<0.05 vs Control.

2.4丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞wnt/β-catenin 通路的影響 與空白組相比，丙泊酚預(yù)處理組wnt1、β-catenin和c-Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低，高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 丙泊酚對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞wnt/β-catenin 通路影響Fig.4 Effects of propofol on wnt/β-catenin pathway in cervical cancer HELA cellsNote:*.P<0.05 vs Control.

2.5丙泊酚對(duì)大鼠體內(nèi)腫瘤的影響情況 與空白組相比，丙泊酚預(yù)處理組大鼠腫瘤質(zhì)量顯著降低，高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5A。免疫組化染色可以看出，空白組Ki67和VEGF均被染成淡黃色，呈顯著陽(yáng)性表達(dá)，丙泊酚預(yù)處理組Ki67和VEGF呈藍(lán)色，且隨著丙泊酚濃度增加藍(lán)色逐漸加深，見圖5B。與空白組相比，丙泊酚預(yù)處理組Ki67和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目百分比顯著降低，且高劑量組顯著低于中劑量組，中劑量組顯著低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5C。

圖5 丙泊酚對(duì)大鼠體內(nèi)宮頸癌腫瘤的影響Fig.5 Effects of propofol on cervical cancer tumor in ratsNote: A.Tumor weight in rats；B.Positive rates of Ki67 and VEGF in cervical cancer tissues of rats;C.Expressions of Ki67 and VEGF in cervical cancer tissues by immunohistochemistry (× 400).*.P<0.05 vs Control.

3 討論

增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是細(xì)胞增殖分化的重要蛋白之一，PNCA指數(shù)越高，細(xì)胞的分裂增殖越快[11]。當(dāng)PNCA指數(shù)持續(xù)升高會(huì)使細(xì)胞在形態(tài)和結(jié)構(gòu)機(jī)能上改變并且使得細(xì)胞獲得無限增殖的能力[12]。增殖細(xì)胞周期相關(guān)核抗原(Ki67)是一種細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原，可以反映細(xì)胞增殖能力，當(dāng)Ki67表達(dá)升高，說明細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，Ki67表達(dá)降低則說明該細(xì)胞增殖能力降低。石小燕等[13]研究表明：Ki67的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)中可以看出使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細(xì)胞中Ki67及PCNA蛋白表達(dá)顯著降低，且在一定濃度范圍內(nèi)隨著丙泊酚處理濃度增加Ki67及PCNA蛋白表達(dá)顯著降低。表明了丙泊酚可以通過降低Ki67及PCNA蛋白表達(dá)水平抑制宮頸癌HELA細(xì)胞的增殖能力，且呈濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種程序性死亡，其中Caspase是細(xì)胞凋亡的核心。Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族的凋亡因子[14]。王銘等[15]研究表明：Caspase-9是Caspase家族中最常見的凋亡啟動(dòng)子。在Caspase家族中主要執(zhí)行凋亡的基因?yàn)镃aspase-3[16]。有活性的Caspase-9裂解使得 proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3并通過剪切另外的Caspase底物，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致移植瘤發(fā)生凋亡，達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細(xì)胞中有活性的Caspase-3、Caspase-9含量顯著增加，說明丙泊酚處理可以促進(jìn)宮頸癌HELA細(xì)胞的凋亡，同時(shí)隨著丙泊酚處理濃度的增加，有活性的Caspase-3、Caspase-9含量顯著增加，表明丙泊酚促進(jìn)宮頸癌HELA細(xì)胞的凋亡呈濃度依賴性。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)能力的蛋白水解酶。MMPs與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、遷移、運(yùn)動(dòng)及血管生成等有著密切的關(guān)系[18]。劉進(jìn)忠等[19]研究表明：腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移首先需要降解ECM并破壞基底膜。MMP-9則是降解 ECM最重要的蛋白酶類。當(dāng)MMPs激活后形成的MMP-9降解、破壞腫瘤表面成分后會(huì)使得腫瘤細(xì)胞沿缺失的基底膜向周圍組織浸潤(rùn)，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細(xì)胞MMP-9顯著降低，且隨著丙泊酚的濃度增加MMP-9表達(dá)水平顯著降低，說明丙泊酚可以抑制宮頸癌HELA細(xì)胞表達(dá)MMP-9，達(dá)到抑制腫瘤侵襲和遷移的效果，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。

劉洪偉等[20]研究表明激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系，研究證實(shí)，抑制 Wnt1 信號(hào)通路可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。劉春蘭等[21]研究表明：免疫組化方法分析 Wnt1 和 β-catenin 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于正常宮頸細(xì)胞，且與疾病的發(fā)展呈正相關(guān)。研究證實(shí)在宮頸鱗狀上皮的惡性轉(zhuǎn)換過程中Wnt1 和 β-catenin參與其中，同時(shí)在宮頸癌的發(fā)展過程中起了促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)使用丙泊酚處理后宮頸癌HELA細(xì)胞中Wnt1 和 β-catenin蛋白及該通路相關(guān)蛋白c-Myc表達(dá)顯著降低，說明丙泊酚可以抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，同時(shí)隨著丙泊酚處理濃度的增加，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量進(jìn)一步減少，說明Wnt/β-catenin 信號(hào)的抑制程度會(huì)隨著丙泊酚濃度的升高而增加，且呈劑量依賴性。

綜上所述，丙泊酚可通過抑制Wnt/β-catenin 通路實(shí)現(xiàn)抑制宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)凋亡因子Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，抑制細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制Wnt/β-catenin 通路有關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。但調(diào)控宮頸癌HELA細(xì)胞相關(guān)通路較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以進(jìn)一步探討丙泊酚通過調(diào)節(jié)其他通路對(duì)宮頸癌HELA細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、遷移及凋亡機(jī)制的影響。