蜜蜂主要幼蟲疾病防治新技術(shù)

龍登隆 姜玉鎖 徐凱 蘇文婷 劉玉玲 牛慶生│文

1 吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林132108；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷030801

蜜蜂幼蟲病是養(yǎng)蜂生產(chǎn)中蜜蜂幼蟲期爆發(fā)疾病的統(tǒng)稱，其給蜜蜂健康和養(yǎng)蜂生產(chǎn)帶來(lái)巨大的危害。蜜蜂的幼蟲病主要包括美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病、白堊病和囊狀幼蟲病，這些疾病的病原具有極強(qiáng)的耐受性，且極易引發(fā)傳染流行，一旦發(fā)病很難徹底殺滅，不及時(shí)救治可能會(huì)導(dǎo)致蜜蜂整群死亡。對(duì)于幼蟲病，之前大多數(shù)治療手段為使用抗生素，但抗生素的使用和濫用導(dǎo)致病原對(duì)抗生素產(chǎn)生了抗藥性，且抗生素等藥物的使用不僅容易造成蜂產(chǎn)品中藥物殘留，降低蜂產(chǎn)品品質(zhì)，還會(huì)導(dǎo)致蜜蜂腸道菌群失衡，對(duì)蜜蜂的新陳代謝和免疫反應(yīng)產(chǎn)生不良影響。

隨著養(yǎng)蜂相關(guān)法律法規(guī)的頒布，抗生素在養(yǎng)蜂業(yè)中的使用受到嚴(yán)格管制，通過(guò)物理或化學(xué)滅活控制幼蟲病較困難，一味的銷毀只能控制疾病不再傳播，并不能有效的防治，而且會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在新西蘭，蜂農(nóng)在確診美洲幼蟲腐臭病后會(huì)將銷毀所有染病蜂群的蜂箱和蜜蜂。在德國(guó)，多數(shù)的防治手段為人工將未染病的成年蜜蜂從受感染的蜂群中移出后銷毀蜂群，這種方法僅僅是在將成年蜜蜂保留下來(lái)以減少損失而已，這會(huì)增加養(yǎng)蜂生產(chǎn)的成本，而且并未有效地進(jìn)行防治。鑒于以上，本文介紹近些年國(guó)內(nèi)外利用植物天然產(chǎn)物、蜂產(chǎn)品提取物、蜜蜂腸道菌群來(lái)防治蜜蜂幼蟲病的新方法，為蜜蜂幼蟲病的綜合防治提供新思路。

一、美洲幼蟲腐臭病

1.病原和流行病學(xué)

美洲幼蟲腐臭病屬于細(xì)菌病，對(duì)養(yǎng)蜂業(yè)危害嚴(yán)重，其病原體是幼蟲芽孢桿菌（Paenibacillus larvae）。2日齡的幼蟲即會(huì)感染美洲幼蟲腐臭病，但到4～5日齡時(shí)才會(huì)出現(xiàn)發(fā)病癥狀，大部分蜜蜂幼蟲在封蓋后死亡，尸體從白色變?yōu)榈稚俳?jīng)咖啡色最后變?yōu)楹谏?/p>

2.防治技術(shù)

關(guān)于美洲幼蟲腐臭病的研究較多，包括利用蜂膠提取物、植物精油、植物提取物以及噬菌體來(lái)抑制幼蟲芽孢桿菌的生長(zhǎng)或者殺死病原。

（1）蜂膠提取物

蜂膠有助于保護(hù)蜂群免受不同病原體的侵害，具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎等生物學(xué)特性。在10 mg/ml濃度下蜂膠乙醇提取物能抑制幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)，這種抑制活性主要來(lái)源于蜂膠中的黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類和二氫黃酮醇類。Boonsai等采用瓊脂擴(kuò)散法分別研究了泰國(guó)蜂膠中的甲醇、二氯甲烷和正己烷提取物對(duì)幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)的抑制活性，研究表明，這三種提取物中只有蜂膠的甲醇提取物表現(xiàn)出一定的抗菌活性[1]。Isidorov分析了蜜蜂采自歐洲楊樹、樺樹的9個(gè)蜂膠樣品中的化合物成分，并測(cè)試這些蜂膠對(duì)幼蟲芽孢桿菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)幼蟲芽孢桿菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用[2]。

（2）植物精油

植物精油是萃取植物特有的芳香物質(zhì)，其由多種化合物組成，如酚類、醛類、酮類等，這些有機(jī)化合物對(duì)廣譜的革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌等病原體具有極強(qiáng)的抗菌活性。Flesar檢測(cè)了26種不同化學(xué)成分的天然化合物和19種植物提取物對(duì)幼蟲芽孢桿菌的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)天然化合物中血根堿抗菌效果最強(qiáng)[3]。多種植物精油也可以抑制幼蟲芽孢桿菌的生長(zhǎng)，牙買加胡椒油和山胡椒油更是可以殺滅幼蟲芽孢桿菌。麝香草精油對(duì)幼蟲芽孢桿菌具有很好的抑制效果。

（3）植物提取物

與植物精油一樣，植物提取物也具有較廣的抗菌作用。蛇麻和香桃木的甲醇二氯甲烷提取物抑制幼蟲芽孢桿菌的活性，且在2～8mg/ml范圍內(nèi)對(duì)幼蟲芽孢桿菌均具有明顯的抑制作用。金絲桃花中少量的二氯甲烷和甲醇提取物對(duì)幼蟲芽孢桿菌的抗菌活性也很高。黑楊樹芽和普通白楊樹芽的提取物中的三萜化合物具有很強(qiáng)的抗菌能力，而黃酮類和糖苷類化合物也具有一定的抗菌能力，但活性較弱。月桂的水醇提取物也能有效的抑制幼蟲芽孢桿菌生長(zhǎng)。

（4）噬菌體

利用噬菌體治療美洲幼蟲腐臭病同樣具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。當(dāng)宿主體內(nèi)出現(xiàn)大量特定的細(xì)菌時(shí)，在自然環(huán)境中大量存在的噬菌體會(huì)開始自我繁殖。用噬菌體來(lái)治療美幼病，可以避免對(duì)受感染蜂巢進(jìn)行的破壞性處理（如焚燒銷毀），而且噬菌體具有專一性，它不會(huì)對(duì)蜜蜂、人類或其他微生物造成傷害，安全性較高。Brady等在受感染蜂群中的飼喂糖漿中加入3種噬菌體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一段時(shí)間后該蜂群竟然自愈[4]。Yost等將7種噬菌體混合用于美幼病感染前預(yù)防和感染后的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體混合物對(duì)美幼病具有一定的治療效果，且感染前的預(yù)防效果要好于感染后的治療效果[5]。LeBlanc從幼蟲芽孢桿菌噬菌體中分離出一種新的噬菌體溶菌素PlyPalA，其能使75%的感染幼蟲恢復(fù)健康[6]。上述研究結(jié)果均表明噬菌體治療美洲幼蟲腐臭病的有效性。

（5）有機(jī)化合物

除抑制幼蟲芽孢桿菌的活性外，防止孢子萌發(fā)也是防治美洲幼蟲腐臭病的有效途徑，因?yàn)殒咦用劝l(fā)是幼蟲染病的第一步。Alvarado等測(cè)試了35種吲哚類和酚類化合物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用，并鑒定了其對(duì)幼蟲芽孢桿菌孢子萌發(fā)的強(qiáng)抑制作用，發(fā)現(xiàn)5-氯吲哚能顯著降低孢子的萌發(fā)[7]，由此可推斷，抑制幼蟲芽孢桿菌孢子可能成為控制美洲幼蟲腐臭病的最有效途徑。

二、歐洲幼蟲腐臭病

1.病原和流行病學(xué)

歐洲幼蟲腐臭病也是一種細(xì)菌性疾病，由蜂房蜜蜂球菌（Melissocccus plutonius）引起。該幼蟲病一般從4日齡幼蟲到化蛹期隨時(shí)可能死亡，大多是未封蓋期間死亡。幼蟲的顏色從珍珠白色逐漸變?yōu)辄S色、棕色和灰黑色。病死的幼蟲蜷縮于巢房底部，尸體殘余物無(wú)粘性，緊粘房壁，子脾常呈“花子”現(xiàn)象。

2.防治技術(shù)

目前檢測(cè)蜂房蜂球菌的實(shí)驗(yàn)室方法包括Elisa、免疫組化定位和PCR。但蜂房蜂球菌不產(chǎn)孢子，使用實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)技術(shù)很難識(shí)別，在癥狀明顯的幼蟲中也很難檢測(cè)到蜂房蜂球菌。當(dāng)前對(duì)蜂房蜂球菌的防治技術(shù)主要集中在蜜蜂腸道益生菌和抗菌物質(zhì)等方面。

（1）蜜蜂腸道益生菌

蜜蜂胃腸道中的益生菌能引起蜜蜂免疫反應(yīng)，因此將胃腸道菌群作為養(yǎng)蜂業(yè)疾病控制的替代制劑受到廣泛關(guān)注。從蜜蜂胃中成功分離出2種乳酸桿菌屬菌株：R4BT和R4C，其中R4BT對(duì)蜂房蜂球菌和幼蟲芽孢桿菌均有較好的抑制作用。蜜蜂腸道分離出的乳酸桿菌飼喂給感染歐洲幼蟲腐臭病的幼蟲，發(fā)現(xiàn)其對(duì)染病幼蟲治愈效果良好，表明乳酸桿菌對(duì)蜂房蜂球菌也有抑制作用。日本蜜蜂分離出一株芽孢桿菌屬細(xì)菌Acja3對(duì)蜂房蜂球菌具有抑制活性，飼喂Acja3后染病幼蟲死亡率降低。

（2）脂肪酸亞油酸

早期有研究發(fā)現(xiàn)患白堊病死亡的幼蟲體內(nèi)存在一種抗菌物質(zhì)可以抑制蜂房蜂球菌和幼蟲芽孢桿菌的生長(zhǎng)，隨后的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗菌物質(zhì)為脂肪酸亞油酸。該研究結(jié)果也帶動(dòng)了相關(guān)脂肪酸對(duì)歐洲幼蟲腐臭病的治療研究。Hornitzky測(cè)試28種脂肪酸對(duì)幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜂球菌培養(yǎng)物的抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪酸對(duì)幼蟲芽孢桿菌和蜂房蜂球菌具有一定的抑制效果，其中15種脂肪酸對(duì)幼蟲芽孢桿菌有抗菌作用，8種脂肪酸對(duì)蜂房蜂球菌有抗菌作用[8]。但是后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)到對(duì)蜂房蜂球菌有抗菌作用的8種脂肪酸雖然有抑菌效果，但并不能對(duì)患病幼蟲具有治療效果。

三、白堊病

1.病原和流行病學(xué)

白堊病是蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）引起的真菌性疾病，導(dǎo)致感染的主要原因是工蜂用含有蜜蜂球囊菌孢子的食物哺育幼蟲。染病幼蟲尸體表面覆蓋一層白色絨毛狀霉菌，隨著病原菌的進(jìn)一步生長(zhǎng)，蟲尸不斷脫水干燥，變成黑色或白色僵尸。

2.防治技術(shù)

目前治療白堊病的方法仍然是化學(xué)物質(zhì)和抗生素，但有些化學(xué)藥物具有腐蝕性，不僅會(huì)污染蜂產(chǎn)品，還會(huì)減緩蜂王產(chǎn)卵的速度，而抗生素則具有殘留性。而正在進(jìn)行研究的包括利用蜂膠提取物、植物精油、蜜蜂胃腸道菌群以及噬菌體來(lái)抑制或者殺死病原體。

（1）植物精油

在治療真菌疾病白堊病時(shí)，用天然的植物精油治療白堊病變得尤為關(guān)鍵。Ansari利用27種植物精油進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)21種精油具有抑制效果，其中胡蘿卜籽、丁香花蕾和山胡椒等5種精油對(duì)蜜蜂球囊菌具有很強(qiáng)的抑制效果[9]。利用桂皮、香茅精油、檸檬香茅精油和橙皮油抑制蜜蜂球囊菌，而這些精油在低濃度下都能顯著抑制菌絲生長(zhǎng)。Kloucek檢測(cè)了70種揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)有39種表現(xiàn)出抗真菌作用。其中辣根揮發(fā)油的抑菌作用最強(qiáng)，牛至、大蒜和百里香精油也有一定的效果[10]。薄荷、薰衣草等天然精油對(duì)蜜蜂白堊病病原菌也有一定的抑制作用。

（2）蜂膠提取物

由于蜂膠廣泛的抗菌作用，所以蜂膠提取物也成為了控制白堊病的有效方法。Wilson發(fā)現(xiàn)蜂膠提取物對(duì)美洲幼蟲腐臭病和白堊病具有很高的抑制作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蜂膠中5種3-?；潼S酮醇對(duì)幼蟲芽孢桿菌和蜜蜂球囊菌均表現(xiàn)出抑制活性，且在這些二氫黃酮醇類中?；L(zhǎng)的對(duì)幼蟲芽孢桿菌抑制活性更強(qiáng)，?；虒?duì)蜜蜂球囊菌的抑制活性更強(qiáng)[11]。

（3）蜜蜂胃腸道微生物

蜜蜂胃腸道菌群也被研究用來(lái)抑制蜜蜂球囊菌活性。Reynaldi從蜜蜂腸道中分離出249種芽孢桿菌和類芽孢桿菌，篩選出枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和環(huán)狀芽胞桿菌對(duì)蜜蜂球囊菌具有較好的抑制效果[12]。從蜜蜂和蜜蜂腸道中分理出的三株芽孢桿菌菌株也對(duì)蜜蜂球囊菌具有較好的抑制效果?？岫趵淠c道分離出的枯草芽孢桿菌對(duì)蜜蜂球囊菌具有顯著的抑制作用。

（4）溶菌酶

有研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶同樣可以抑制蜜蜂球囊菌的活性：可食用的鹽酸溶菌酶對(duì)感染的幼蟲進(jìn)行飼喂，發(fā)現(xiàn)高濃度的鹽酸溶菌酶能使染病蜂群恢復(fù)到感染前的水平。

四、囊狀幼蟲病

1.病原和流行病學(xué)

囊狀幼蟲病是由囊狀幼蟲病病毒（SBV）引起的，幼蟲感染病毒后一般在5～8日齡發(fā)病。囊狀幼蟲病的特征是幼蟲不能蛹化，蟲體在死亡前由珍珠白變成淡黃色，最終變成深褐色。該病容易反復(fù)發(fā)生，一般每3～4年發(fā)生一次。

2.防治技術(shù)

目前對(duì)中蜂囊狀幼蟲病的防治方法不多，在蜂王卵巢和雄蜂的精液中都檢測(cè)到了囊狀幼蟲病病毒，表明囊狀幼蟲病病毒可以通過(guò)自然交配由雄蜂將病毒傳染給蜂王，蜂王再將病毒垂直傳播傳染給后代，使得防治變得更加困難。當(dāng)前我國(guó)中蜂囊狀幼蟲病主要依靠選擇抗性蜜蜂種群以及運(yùn)用中藥進(jìn)行治療，但是沒(méi)有較好的效果，因此需要尋找新型防治方法。

（1）蜂王漿等蛋白類物質(zhì)

有研究利用西方蜜蜂蜂王漿飼喂染病的中華蜜蜂幼蟲發(fā)現(xiàn)幼蟲的死亡率明顯降低，這可能是兩種蜂王漿的不同成分改變了蜜蜂的代謝途徑，導(dǎo)致兩種蜜蜂對(duì)病毒感染的抗性差異。Sun等人利用抗體效價(jià)為25的蛋黃免疫球蛋白Y飼喂染病蜂群，發(fā)現(xiàn)其對(duì)蜂群的治愈率為95%～100%。沈克飛等利用抗微生物肽SP6飼喂人工感染的中蜂囊狀病幼蟲，發(fā)現(xiàn)SP6對(duì)囊狀幼蟲病病毒感染中蜂有良好的防治效果[13]。

（2）銀離子

利用混合有銀離子的糖水飼喂感染囊狀幼蟲病的蜂群，試驗(yàn)蜂群群勢(shì)及活力均好于沒(méi)有飼喂銀離子糖水的對(duì)照染病蜂群，說(shuō)明銀離子對(duì)感染囊狀幼蟲病病毒的東方蜜蜂治療是有效的。

（3）分子生物學(xué)技術(shù)

Liu等人用特定的CSBV雙鏈RNA序列 (dsRNA)喂養(yǎng)蜜蜂幼蟲證實(shí)了攝入CSBV衍生的dsRNA可以保護(hù)蜜蜂幼蟲免受CSBV感染[14]。隨著分子生學(xué)技術(shù)的不斷突破，相信在將來(lái)會(huì)成為病毒病防治的最佳方法，囊狀幼蟲病也會(huì)得到進(jìn)一步的防治。

五、結(jié)語(yǔ)

隨著蜜蜂幼蟲病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，植物提取物（包括植物精油）、蜂產(chǎn)品提取物（蜂膠提取物和蜂王漿提取物）、噬菌體以及分子生物學(xué)技術(shù)等新防治方法也在逐漸突破，并取得一定的成果，但距離其在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中的具體應(yīng)用還有一定的差距。但隨著養(yǎng)蜂業(yè)限制抗生素力度的加大，無(wú)毒害新方法（技術(shù)）的應(yīng)用將逐漸成為蜜蜂幼蟲病防治的主要防治手段。