米櫧人工林土壤微生物群落組成對凋落物輸入的響應(yīng)

盧勝旭， 許恩蘭， 吳東梅， 陸宇明， 郭劍芬, 楊玉盛

(1.福建師范大學(xué)濕潤亞熱帶生態(tài)地理過程教育部重點實驗室, 福建 福州 350007；2.福建師范大學(xué)地理研究所, 福建 福州 350007)

土壤微生物作為分解者，在森林生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)中扮演著重要的角色；而土壤微生物群落組成受到森林凈初級生產(chǎn)力、植物碳分配、根際活動和凋落物輸入量等的共同影響[1]。其中凋落物輸入是森林土壤碳(C)、氮(N)庫的重要來源[2]，且調(diào)控土壤微生物的生理和代謝過程[3]。因此凋落物輸入量的微小變化都會引起土壤微生物群落生物量、結(jié)構(gòu)和活性的變化[4]。

當(dāng)前不斷加劇的氣候變化對植物凈初級生產(chǎn)力產(chǎn)生了積極或消極的影響。如CO2升高[5]、氮沉降[6]和溫度增加[7]均對植物生產(chǎn)力有促進作用，而O3升高[8]、干旱[9]和酸沉降[10]普遍降低了生產(chǎn)力。初級生產(chǎn)力的變化可能會引起地上凋落物輸入的數(shù)量和質(zhì)量發(fā)生變化，從而改變凋落物層的物理、化學(xué)和生物特性，進而影響土壤微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)和活性。雖然有關(guān)凋落物變化對土壤微生物影響的研究較多，但并未能達成一致的認識。PREVOST-BOUREetal[11]研究表明凋落物輸入處理對土壤微生物生物量的影響不顯著，另外還有研究結(jié)果表明凋落物輸入處理影響土壤微生物生物量和活性，還會影響其群落組成[12-13]?？梢?，土壤微生物對凋落物輸入變化響應(yīng)仍存在不確定性，因此有必要開展更進一步的研究。

我國中亞熱帶地區(qū)常綠闊葉林是全球同緯度的“綠洲”，其生物量和生產(chǎn)力非常高，對全球陸地生態(tài)系統(tǒng)碳吸存有著極其重要的貢獻[14]。該地區(qū)常綠闊葉林年凋落量大，約可達11 t·hm-1·a-1，這為土壤微生物提供了豐富的底物來源。為了深入研究地上凋落物輸入對土壤微生物的影響，本研究以三明市格氏栲自然保護區(qū)米櫧[Castanopsiscarlesii(Hemsl.) Hayata]人工林為研究對象，通過磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid， PLFA)技術(shù)分析該人工林凋落物加倍與去除處理的土壤微生物群落組成的差異，并分析主要影響因素，有助于深入理解全球氣候變化背景下凋落物輸入變化對該地區(qū)森林土壤養(yǎng)分循環(huán)的影響機制。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于福建省三明市格氏栲自然保護區(qū)(117°28′E， 26°11′N)，海拔305～315 m，坡度15°～20°。該保護區(qū)屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，具冬冷夏熱、水熱同期、濕潤多雨等特點，年均氣溫20.1 ℃，年均降水量1 670 mm。土壤為砂巖發(fā)育的山地紅壤，表層疏松，土層深厚。本試驗研究的米櫧人工林前身為米櫧[Castanopsiscarlesii(Hemsl.) Hayata]天然林，20世紀60年代經(jīng)皆伐、火燒、挖穴后造林和幼林撫育而形成，其林下植被主要有硃砂根(ArdisiacrenataSims)、香花崖豆藤(MillettiadielsianaHarms)、狗骨柴 [Diplosporadubia(Lindl.) Masam.] 和黃楠 (MachilusgrijsiiHance) 等。

2 研究方法

2.1 土壤樣品采集

2012年6月，在亞熱帶米櫧人工林設(shè)置3個大小為20 m × 20 m的樣方，分別在各樣方內(nèi)隨機設(shè)置3個1 m × 1 m的小區(qū)，分別作如下處理，即：(1)保留凋落物(control treatment， CT)，不做任何處理；(2)去除凋落物(no litter， NL)，在小區(qū)上方0.5 m高處放置1.5 m × 1.5 m大小的正方形尼龍網(wǎng)去除小區(qū)地表全部凋落物；(3)凋落物加倍(double litter， DL)，將NL處理截留的凋落物移至添加凋落物處理的小區(qū)內(nèi)。每種處理設(shè) 3個重復(fù)，共9個小區(qū)。

2017年11用內(nèi)徑2 cm的土鉆采用“S”型混合采樣方法取樣，采集各小區(qū)0～10 cm土層土樣，5根土芯混成一個混合樣，使用塑料自封袋保存，運回福建三明生態(tài)系統(tǒng)與全球變化研究站實驗室，挑除肉眼可見的礫石和動植物殘體后充分混勻。其他原狀土樣過2 mm(孔徑)篩后再分成3部分：第一部分保存于-20 ℃環(huán)境，用于土壤微生物指標(biāo)測定；第二部分保存于4 ℃環(huán)境，用于測定土壤的基本理化性質(zhì)等；第三部分自然風(fēng)干，用于測定土壤有機碳、全氮、pH值等。

2.2 土壤理化性質(zhì)測定方法

2.3 土壤微生物生物量碳、 氮及微生物群落結(jié)構(gòu)測定

采用氯仿熏蒸-浸提法測定土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon， MBC)、微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen， MBN)[15]。簡要步驟如下：稱取兩份5 g鮮土，一份用氯仿熏蒸24 h，另一份不作處理；然后按1∶4 (土∶溶液)比例用0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提，濾液經(jīng)振蕩、離心、過濾后使用總有機碳分析儀(TOC-VCPH， Shimadzu)測定有機碳含量，使用連續(xù)流動分析儀(Skalar San++， Netherlands)測定有機氮含量。計算公式如下：

CMBC/(mg·kg-1)=EC/kEC

(1)

CMBN/(mg·kg-1)=EN/kEN

(2)

其中：EC為熏蒸和未熏蒸處理的有機碳含量的差值，kEC是MBC的浸提系數(shù)0.45；EC為熏蒸和未熏蒸處理的有機氮含量的差值，kEN是MBN的浸提系數(shù)0.54。

微生物磷脂脂肪酸(PLFA)的提取參考BUYERetal[16]的方法，調(diào)整后的簡要步驟如下：

① 取3 g凍干土置入25 mL特氟龍管，加入4 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH值=7.4)、10 mL甲醇和5 mL氯仿，室溫下超聲10 min、避光振蕩2 h、離心(2 500 r·min-1)10 min。

② 液相移入干凈的特氟龍試管，加入3 mL氯仿和3 mL磷酸緩沖液，渦旋混勻，靜置過夜分層。

③ 底部液相用N2吹干，加入適量氯仿，洗入已用5 mL氯仿潤洗后的萃取小柱中，依次加入5 mL氯仿和10 mL丙酮洗去中性脂和極性脂，收集用5 mL甲醇洗脫的磷脂，最后用N2吹干。

④樣品中加入1 mL 1∶1(甲醇∶甲苯)溶液、1 mL 0.2 mol·L-1甲基化KOH，渦旋后37 ℃水浴15 min，加入2 mL正己烷、0.3mL 1 mol·L-1冰醋酸和2 mL無菌水，渦旋后離心分層，吸取頂部液相，殘液再加2 mL色譜純正己烷提取，然后合并收集的頂部液相用N2吹干，收集N2，封口膜密封，置于-20 ℃保存。

上機測樣前，用200 μL含有19∶0甲酯的內(nèi)標(biāo)液將樣品洗入GC小瓶，用GC-MIDI系統(tǒng)進行磷脂脂肪酸的鑒定。計算采用19∶0內(nèi)標(biāo)法，每單位干土所含脂肪酸含量nmol·g-1。具體的土壤微生物種群磷脂脂肪酸標(biāo)志物及其特征比值詳見表1[17-21]。

表 1 土壤磷脂脂肪酸標(biāo)志物Table 1 Markers of PLFA in soil

2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)過Microsoft Excel 2013軟件整理后，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對土壤各指標(biāo)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗不同處理之間土壤理化性質(zhì)，土壤微生物生物量及群落組成的差異。采用Canoco Software 5.0軟件，以土壤微生物PLFA為響應(yīng)變量，以土壤理化性質(zhì)及微生物生物量為解釋變量做冗余度分析(redundancy analysis， RDA)；繪圖由Origin 9.0軟件完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤基本理化性質(zhì)

由表2可以看出，與對照處理相比(CT)，加倍凋落物處理(DL)顯著提高銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量(P<0.05)，而去除凋落物處理(NL)顯著降低了硝態(tài)氮含量(P<0.05)。DL處理土壤全氮、銨態(tài)氮和有效磷含量顯著高于NL處理(P<0.05)。不同凋落物輸入處理下土壤有機碳和可溶性有機碳含量差異不顯著。DL和NL處理下土壤pH值(表2)和土壤微生物生物量碳含量(圖1)均明顯高于CT，可溶性有機氮(表2)和微生物生物量氮含量均顯著低于CT(圖1)。而微生物生物量碳氮在DL和NL處理之間差異不顯著。

表 2 不同凋落物量輸入處理土壤基本理化性質(zhì)Table 2 General characteristics of soil under different litter input treatments

3.2 土壤微生物磷脂脂肪酸含量

DL處理不同程度增加了土壤各類微生物PLFA組成的含量，而NL處理則反之(圖2)。具體表現(xiàn)為，DL處理土壤叢枝菌根真菌(AMF)、革蘭氏陽性菌[G(+)]、革蘭氏陰性菌[G(-)]、放線菌(ACT)、真菌(F)、總磷脂脂肪酸(TPLFA)含量均顯著高于NL處理(P<0.05)，但與CT處理差異不顯著。同DL處理土壤相比，NL處理土壤顯著提高了G(+)∶G(-)比值(P<0.05)，但與CT處理差異不顯著。凋落物輸入變化中F∶B比值隨凋落物去除而升高，表現(xiàn)為NL處理明顯高于CT和DL處理的土壤F∶B比值(P<0.05)。

注： 不同小寫字母表示處理間差異顯著， P<0.05。Notes: different lowercase letters indicate significant difference among treatments， P<0.05.圖 1 不同凋落物量輸入處理土壤微生物生物量碳氮含量Figure 1 Soil microbial biomass carbon and nitrogen contents at different litter input treatments

注： 不同小寫字母表示處理間差異顯著， P<0.05。Note: different lowercase letters indicate significant difference among treatments， P<0.05.圖 2 不同凋落物量輸入處理土壤磷脂脂肪酸含量及其特征比值Figure 2 Different litter quantity input on soil phospholipid fatty acids and their characteristic ratios

3.3 土壤微生物群落組成變化的冗余度分析

圖 3 土壤微生物群落組成與環(huán)境因子的冗余度分析Figure 3 Redundancy analyses of soil microbial community composition and environmental factors

4 討論與結(jié)論

4.1 土壤理化性質(zhì)對凋落物輸入變化的響應(yīng)

凋落物輸入是土壤元素循環(huán)利用的關(guān)鍵過程[25]。本研究中加倍凋落物處理對土壤SOC和DOC含量沒有明顯影響(表1)。這可能由于凋落物加倍為微生物提供了豐富的底物來源，對土壤有機質(zhì)產(chǎn)生“正激發(fā)效應(yīng)”，從而提高了微生物對土壤SOC和DOC的分解，使加倍凋落物處理與對照處理SOC和DOC差異不顯著[26]。也可能由于土壤DOC隨季節(jié)變化較大[27-28]，而本研究取樣的季節(jié)為秋季，此時降雨較少，淋溶作用弱。不同的是，本研究凋落物加倍處理顯著提高了土壤TN、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量，而凋落物去除降低了硝態(tài)氮含量，表明凋落物增加或減少顯著影響土壤N的有效性，這與我們前期研究一致[29]。

土壤微生物在土壤養(yǎng)分的獲取和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[30]。有研究表明，凋落物添加與去除明顯改變了土壤微生物生物量碳(MBC)含量[31-32]。本研究凋落物加倍處理下土壤MBC含量增加31.44%，這與HOOKER和STARK[33]在美國懷俄明州3個不同生態(tài)系統(tǒng)的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)添加凋落物使土壤MBC含量增加13%。但亦有學(xué)者研究顯示，添加或去除凋落物對土壤MBC含量沒有顯著影響[34]。不同研究結(jié)果差異可能與所處氣候、森林類型、土壤狀況、凋落物輸入量差異等有關(guān)。其原因可能在于溫帶森林對凋落物的處理往往不如熱帶和亞熱帶森林敏感，這是由于溫帶森林土壤C循環(huán)速度較慢，導(dǎo)致微生物生物量和活性較低。也可能由于森林類型不同，對比杉木而言，本研究凋落物為米櫧葉(低C /N、 低木質(zhì)素/N、 低纖維素含量)，這些高質(zhì)量的有機質(zhì)輸入添加使土壤微生物更容易利用的植物碳來源增加[35]，從而使微生物生物量碳增加。

4.2 土壤微生物群落組成對凋落物輸入變化的響應(yīng)

F∶B和G(+)∶G(-)的比值常被用作指示微生物群落結(jié)構(gòu)變化的重要指標(biāo)，F(xiàn)∶B可表征真菌和細菌兩個種群的相對豐富程度消長狀況[39]。細菌分解主要發(fā)生在養(yǎng)分充足的土壤中，這些土壤富含容易分解的有機質(zhì)，碳周轉(zhuǎn)和養(yǎng)分循環(huán)速度較快；而真菌分解為慢周轉(zhuǎn)方式，多存在于酸性土壤中，偏好低營養(yǎng)、以及高碳氮比的有機物[40]。當(dāng)易分解有機質(zhì)輸入減少使土壤微生物更容易利用的植物碳來源減少，微生物需要轉(zhuǎn)而利用土壤中較難利用的碳組分，此時真菌相對細菌的優(yōu)勢顯著[36]。在本研究中，去除凋落物時，F(xiàn)∶B的比例顯著增加(圖2)，NL處理的F∶B為0.19，而CT和DL處理的F∶B分別為0.16和0.15，表明去除凋落物后土壤微生物由細菌分解型轉(zhuǎn)換為真菌分解型。WANGetal[41]研究表明，亞熱帶針葉林的NL處理的F∶B高于CT和DL處理。

G(-)和G(+)是微生物群落結(jié)構(gòu)變化的指示器，在不同的環(huán)境變化下，養(yǎng)分的傾向性和生長策略不同[42]。G(-)更加依賴于新鮮有機質(zhì)的輸入，而G(+)更傾向于養(yǎng)分有效性低的環(huán)境中生長[43]。在本研究中，NL處理的真菌和細菌含量顯著低于DL處理(圖2)，表明去除凋落物對微生物群落有抑制作用。但NL處理的G(+)∶G(-)的比值卻顯著上升，因為G(-)更依賴于易分解的C源，生長較快，去除凋落物減少了新鮮有機質(zhì)的輸入，為了適應(yīng)有效養(yǎng)分減少的限制，NL處理下的微生物細菌群落發(fā)生了轉(zhuǎn)移。