補腎養(yǎng)血祛濁方對腎性貧血大鼠血清及腎組織中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的作用研究*

吳心虹，李泰標，廖秋菊，何毅琪，林友益

福建省廈門市第五醫(yī)院中醫(yī)科(廈門 361101)

中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(Neutrophil gelatinase-aussociated lipocalin，NGAL)是脂籠蛋白(lipocalin)家族的新成員。筆者在前期通過對非透析腎性貧血患者進行臨床觀察[1]，證實NGAL介導的鐵代謝途徑對慢性腎臟病與貧血具有重要作用。血NGAL與尿NGAL對腎性貧血鐵代謝的診斷更有臨床應用價值，可能是反應鐵代謝的新型指標。血NGAL主要反應腎功能下降和貧血程度，而尿NGAL是血NGAL升高的結果，亦反應了腎小管的損傷情況，故血清NGAL可能是腎性貧血的潛在作用點。Kim等[2]通過臨床觀察亦證實血漿NGAL水平與慢性腎病患者透析前貧血的鐵狀態(tài)相關。

補腎養(yǎng)血祛濁中藥在臨床上治療腎性貧血取得較好的療效，聯合促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)治療更有利于腎性貧血的糾正。然而研究多圍繞療效觀察進行，具體機制研究文獻報道較少，分子生物依據少。本研究通過補腎養(yǎng)血祛濁方干預腎性貧血大鼠，觀察Scr、Hb、Fer、TAST改變，實時熒光定量 PCR (Real time，PCR) 檢測腎組織NGAL、EPOR水平，Western blot 檢測腎組織 NGAL及EPOR蛋白水平，從而闡述中藥糾正腎性貧血的作用機理。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：健康SPF級 SD雄性大鼠共70只(體重180～220 g)，由廈門大學實驗動物中心提供(許可證號：SYXK(閩)2013-0006)。

1.2 主要試劑：RNA提取試劑盒(Promega)；逆轉錄試劑盒(Promega)；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(TOYOBO)；NGAL ELISA試劑盒(Abcom)；EPO ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；EPOR ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；鐵蛋白ELISA試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；兔抗大鼠NGAL、EPOR多克隆抗體(Proteintech)；蛋白提取試劑盒(Promega)。

2 研究方法

2.1 實驗分組：將75只健康的SPF級大鼠，運用標準大鼠飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，即正常組(N組)25只、模型組(M組)25只、中藥組(Z組)25只。

2.2 模型建立及動物處理

2.2.1 造模：參照相關文獻[3]，將1.5%腺嘌呤混懸液，以腺嘌呤300 mg/(kg·d)灌胃，共6周，正常組以等容量蒸餾水灌胃。造模期間15只大鼠死亡。造模6周后，隨機選取4只大鼠，眼眶取血，檢測Hb、Scr、BUN，證實造模成功。

2.2.2 本方組成：淫羊藿、鹿角膠、熟地黃、當歸、黃芪、茯苓、大黃、補骨脂、雞血藤等組成，生藥制成濃縮湯劑。中藥制法：①稱取生藥255 g，用水浸泡30 min，煮沸后再煎30min，過濾；②得濾渣,加水，加熱(二煎)至沸騰后，再煎20 min，再過濾。每天上午灌胃給藥，用量均按臨床上成人每公斤體重用量的 6倍換算，予5 ml/(kg·d)灌胃；模型組予灌生理鹽水10 ml/(kg·d)，給藥時間為4周。

2.2.3 動物處理：采用10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，開腹開胸后，取腎臟，處死前腹主動脈采血3 ml；左腎以多聚甲醛固定，梯度脫水、透明，進行石蠟包埋，制作石蠟切片，用于免疫組化檢測；右腎用消毒錫箔紙包好速凍于液氮中，后轉至-80°C 冰箱保存，用于實時熒光定量 PCR 及 Western blot檢測。

3 指標檢測

3.1 常規(guī)實驗室法檢測血清Hb、Scr、BUN、Fe、總鐵結合力(TIBC)、血清鐵(SI)水平，TAST由TIBC、SI計算得出。

3.2 ELISA法檢測血清Fer、EPO、NGAL含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

3.3 實時熒光定量PCR檢測腎組織NGAL mRNA、EPOR mRNA表達變化：取腎組織依照TRIzol(invitrogen)法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，使用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(TOYOBO)以7500Software進行熒光擴增，檢測基因序列詳見表1，GAPDH作為內參照;以正常組 mRNA 的表達量作為“1”，再根據校正值計算出模型組及中藥組mRNA相對含量，進行比較。見表1。

3.4 Western blot 檢測腎組織NGAL、EPOR蛋白表達：組織稱重，按比例加入相應裂解液，勻漿離心，抽取上清，BCA 法測定蛋白濃度。加入buffer，100°C 使蛋白變性利于保存。電泳分離，切膠，轉膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉1h，加入1∶1000一抗(NGAL、EPOR，Proteintech公司)，4°C搖床孵育過夜，次日TBST洗滌后，加入過氧化氫物酶標記的二抗，室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次后，使用化學發(fā)光系統(tǒng)(ECL)檢測標本膜上信號。

表1 檢測基因引物序列和產物長度

結 果

1 各組大鼠血清指標比較 與正常組比較，模型組Hb、EPO均明顯降低(P<0.01)，TAST降低(P<0.05)，NGAL水平升高(P<0.05)，Scr、BUN、Fer均明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，中藥組Hb、TAST、EPO水平明顯升高(P<0.01)，Scr、NGAL水平明顯降低(P<0.01)，Fer、BUN水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清指標表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

2 各組大鼠PCR表達情況 與正常組比，模型組腎臟NGAL mRNA明顯升高(P<0.01)，EPOR mRNA明顯降低(P<0.01)，中藥組腎臟NGAL mRNA升高(P<0.05)，EPOR mRNA升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組腎臟NGAL mRNA減少(P<0.05)，EPOR mRNA明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠PCR表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

3 各組大鼠Western blot檢測水平 模型組較正常組腎臟NGAL 蛋白水平升高(P<0.05)，中藥組較模型組腎臟NGAL 蛋白水平減少(P<0.05)；模型組較正常組EPOR蛋白水平降低(P<0.05)，中藥組較模型組EPOR蛋白水平明顯升高(P<0.01)。見表4及圖1-2。

表4 各組大鼠各蛋白表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，▲P<0.01

討 論

CKD發(fā)生的貧血是由于促紅細胞生成素和鐵缺乏、慢性炎癥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進和紅細胞縮短半衰期[4-5]。鐵缺乏是CKD患者貧血的第二大原因，首要原因是促紅細胞生成素缺乏。EPO 是紅細胞生成的主要調控因子，通過和EPOR 結合發(fā)揮其促進紅系祖細胞的增殖、分化與成熟的生物學效應[6-7]。在本實驗中，模型組大鼠血清中Scr、BUN、Fer升高，Hb、血清EPO及腎臟EPOR水平降低，腎性貧血模型成立，但在造模過程中，大鼠死亡15只，考慮與該造模方法腺嘌呤用量較大有關。

NGAL是一個25kDa的中性粒細胞明膠酶單體，循環(huán)的NGAL可透過腎小球濾過膜。NGAL與腎臟病關系的相關研究報道已有不少，其水平與腎損害程度相關[8-9]，而NGAL亦參與貧血的發(fā)生發(fā)展，早期研究認為NGAL可通過Tf轉鐵途徑參與慢性病貧血[10]，隨著研究的進展，人們通過體外實驗發(fā)現NGAL

也是調節(jié)紅細胞生長機制的重要因素[11-12]。我們前期研究[1]，觀察透析前CKD貧血患者NGAL與鐵狀態(tài)指數之間的關系，結果支持血漿NGAL與CKD貧血患者的鐵狀態(tài)有關，與Fer、TAST呈正相關，且特異性及敏感性均高于Fer。本實驗中，模型組血漿及腎臟NGAL均升高，故考慮血漿NGAL升高與腎臟NGAL升高有關。

腎性貧血有關的病名如“虛勞”、“腎勞”、“血虛”等病名[13]。歷代醫(yī)家多認為本病病機為：腎精虧虛，脾氣衰憊，后天無以滋養(yǎng)先天，脾腎俱虛，氣血生化不足，濁邪內蘊，瘀血阻滯，可將其概括為正虛邪實?！稄埵厢t(yī)通》曰“血之源頭在乎腎”而《侶山堂類辨》云“腎為水臟，主藏精而化血”。腎藏精，腎虛精虧，精不生血，則致血虛。《宣明論方》謂：“濕氣先傷人之陽氣，陽氣傷不能調通水道，亦使人真陰不能生長而耗陰液?！苯蜓?，陰液耗則陰血生化乏源。治療多以補腎填精，健脾益氣，養(yǎng)血瀉濁為主。本方以補腎養(yǎng)血瀉濁法為主，選用淫羊藿、阿膠、熟地黃、當歸、黃芪、茯苓、大黃等藥物組成方。方中藥物有以下特點：淫羊藿溫腎陽而不燥；淫羊藿、阿膠配合使用，意在陰中求陽，陽中生陰，陰陽生化無窮，以期陰平陽秘、腎元充裕之功。熟地黃味甘微溫質潤，既補血滋陰，又能補精益髓；當歸多糖能提高動物白細胞和網織紅細胞水平，促進紅細胞及血紅蛋白的生成，療效優(yōu)于鐵劑。黃芪、茯苓健脾益氣升清、補后天以助先天，生化有源，佐以大黃通腑降濁。全方共奏益精補血之功，更添溫腎降濁之效，對腎性貧血有好的治療作用。

包曉星等[14]運用健脾益腎瀉濁方配合EPO治療腎性貧血，結果表明能有利于體內肌酐、尿素氮等代謝產物的排除，減少毒素對造血細胞的抑制和破壞，改善貧血程度。范軍等[6]研究發(fā)現補腎生血方可通過提高骨髓有核細胞 EPOR mRNA 表達量達到治療腎性貧血的作用。有許多實驗證明[15]，中醫(yī)藥可通過降低NGAL水平減少相關炎癥細胞因子表達、抑制炎癥反應、減輕氧化應激、抗細胞凋亡、誘導細胞自噬、抗腎間質纖維化等方式減輕腎小管損傷、腎小球硬化，抑制腎小球系膜細胞的增殖，保護腎組織，然而未見對腎性貧血的治療作用。本實驗中，中藥組較模型組Scr、BUN明顯降低，Hb、血清EPO明顯升高，說明補腎養(yǎng)血祛濁方對腎性貧血有治療作用。同時，與模型組比較，中藥組Fer降低，TAST升高，血清NGAL、腎臟NGAL mRNA及蛋白水平均降低，說明該方可降低NGAL水平，改善腎性貧血鐵代謝情況。

實驗表明，補腎養(yǎng)血祛濁方能降低血清及腎臟NGAL水平，改善鐵代謝情況，從而保護腎功能，糾正腎性貧血。為進一步了解NGAL在腎性貧血中的變化意義，今后將從細胞分子水平進一步研究。