針刺療法對(duì)帕金森病大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡蛋白bcl-2、bax的影響*

吳成舉，英錫相，陳 靖，謝 鑫，劉文俊，張小卿，吳景東，馬鐵明，馬賢德

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)(沈陽(yáng) 110847)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見(jiàn)的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)異常和肌強(qiáng)直[1]為臨床主要特征。紋狀體多巴胺(DA)含量下降、中腦黑質(zhì) DA 能神經(jīng)元逐漸變性死亡為主要病理改變。在我國(guó)65歲以上人群患病率為2.05%。人類平均壽命的延長(zhǎng)和社會(huì)老齡化的到來(lái)，發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為影響人類身體健康和生活質(zhì)量的重要疾病。

針灸在臨床治療PD的應(yīng)用中療效可靠、無(wú)毒副作用、并且可以減少多巴胺毒副反應(yīng)和用藥量，極大的體現(xiàn)了針灸治療PD的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)[2]。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)觀察不同方法針灸對(duì)PD模型大鼠腦細(xì)胞神經(jīng)元代謝的影響，可以提高PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元合成多巴胺的功能,改善大鼠的行為學(xué)，各針刺組可上調(diào)bcl-2表達(dá)，抑制bax表達(dá)，為針灸治療PD提供了理論支持。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性大鼠60只(Wistar)，體重(250±50) g，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供。大鼠購(gòu)入后飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

將60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組(每組12只)，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(帕金森動(dòng)物模型)、電針組(帕金森動(dòng)物模型+電針治療)、頭針組(帕金森動(dòng)物模型+頭針治療)、電針+頭針組(帕金森動(dòng)物模型+電針+頭針治療)。

2 主要試劑與儀器 魚藤酮(SigmaAldrich，cas:83-79-4)；anti-bax(abcam，貨號(hào)：ab53154)；anti-bcl-2(abcam，貨號(hào)：ab196495)；SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，編號(hào)：KIT-0105R)；DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，編號(hào)：DAB-0031)；TUNEL試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，目錄號(hào)：KGA7073)；烏拉坦、戊二醛等化學(xué)試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽(yáng)有限公司。

華佗牌針灸針：貴州安迪藥械有限公司；G6805-2型電針治療儀： 示波器照相機(jī)(日本)、SW-CJ-IF凈化工作臺(tái)(國(guó)產(chǎn))、CK-2倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS)； PROTEANTMⅡ聚丙烯凝膠電泳(美國(guó)，LTI)、凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能)；XE380超低溫冰箱(法國(guó))；KOHTRON高速低溫離心機(jī)(瑞典)；DU640核酸蛋白分析儀(美國(guó))；Bio-Rad550型酶標(biāo)儀(美國(guó))；BT-31恒溫水浴振蕩儀(日本， KAMAMOTO)、PCS-SP2激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)，Leica公司)。

3 模型建立 除空白對(duì)照組外，其余大鼠皮下注射魚藤酮(油溶液配成1.5 mg/ml)，1.5 mg/(kg·d),持續(xù)給藥3周,按照所建立的模型神經(jīng)行為學(xué)記分標(biāo)準(zhǔn)記分，如果達(dá)到相應(yīng)記分后就停止給藥。

帕金森大鼠行為學(xué)記分標(biāo)準(zhǔn)：在1周末、2周末及3周末分別觀察魚藤酮1周、2周及3周的所有大鼠的行為學(xué)變化并對(duì)其進(jìn)行mNSS評(píng)分，將結(jié)果與兩個(gè)對(duì)照組比較；應(yīng)用mNSS評(píng)分表可綜合評(píng)價(jià)大鼠的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡功能的改變，其總分為18分，0分為沒(méi)有任何傷害，1～6分為輕度損害，7～12分為中度損害，13～18分為重度損害。mNSS評(píng)分1～18分的大鼠均納入帕金森模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4 治療方法 針灸處理方法：以養(yǎng)血祛風(fēng)、鎮(zhèn)靜安神為治療原則。按照全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》取穴。

電針組處方：采用王彥春近年來(lái)提出的“雙固一通” 法，關(guān)元、足三里、太沖、風(fēng)府。頭針處方：舞蹈震顫控制區(qū)、運(yùn)動(dòng)區(qū)、足運(yùn)感區(qū)。 采用“華佗牌”38號(hào)針灸針(0.18 mm×25 mm)，電針組接6805-D型電針儀，施以疏密波，疏波頻率2 Hz，密波頻率6 Hz,強(qiáng)度2～4 mA，留針20 min；頭針組進(jìn)針時(shí)針身與頭皮呈30°，在帽狀腱膜下將針身進(jìn)到2/3后快速平穩(wěn)捻針，每隔5～10 min 行針1次，留針20 min。所有治療組于造模成功后每日治療1次，7次為1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程，療程間休息1 d。

5 觀察指標(biāo)

5.1 魚藤酮致帕金森大鼠行為學(xué)記分：末次針刺后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，按照“材料與方法中模型建立”行為學(xué)記分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5.2 HPLC法測(cè)定黑質(zhì)紋狀體中DA含量：末次針刺后1 h，各組大鼠隨機(jī)抽取6只，過(guò)量麻醉處死，立即置于冰臺(tái)上，迅速分離出紋狀體腦組織，稱重，作為實(shí)驗(yàn)樣品將其低溫保存。制備組織勻漿，加入正丁醇2.0 ml，混和均勻，在4℃下，離心15 min(10000 r/min)。抽取上清液，加入正庚烷2.0 ml、0.50 ml(0.1 mol/L HClO4)、進(jìn)行3 min旋渦振蕩，然后低速離心3 min(3000 r/min)。將有機(jī)相除去，加2.0 ml CHCl3在下層的水相中，經(jīng)過(guò)3 min旋渦振蕩、3 min低速離心后，直接進(jìn)樣上層水樣。進(jìn)樣量為20 μl。緩沖液作為流動(dòng)相(磷酸氫二鈉0.05 mol/L和檸檬酸三鈉0.02 mol/L)∶甲醇溶液=90∶10，經(jīng)濾膜(0.45 μm)過(guò)濾并且超聲脫氣后使用。

5.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：末次針刺后1 h，各組剩余的6只大鼠，采用10%水合氯醛麻醉,開(kāi)胸行主動(dòng)脈插管,剪開(kāi)右心房,以100 ml生理鹽水經(jīng)升主動(dòng)脈快速?zèng)_洗,隨后灌注(4℃)冷的400 ml，包含0.1 mol/L戊二醛(0.05%)、多聚甲醛(4%)、pH 7.4磷酸緩沖液,開(kāi)顱取中腦,在不含戊二醛的上述灌注液中固定過(guò)夜(4℃),注入25%蔗糖促使組織塊沉底。連續(xù)冠狀切片,使用冷凍切片機(jī)，切片厚40 μm，涂有多聚賴氨酸的載玻片撈片。采用原位末端標(biāo)記染色(TUNEL)法檢測(cè)各組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡情況。常規(guī)制備石蠟切片，并采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫二甲苯至水。然后將組織薄膜以免疫組化筆圈涂，于圈內(nèi)滴加50 μl TdT酶反應(yīng)液(TdT酶反應(yīng)液：45 μl Equilibration Buffer+1 μl FITC-12-Dutp+4 μl TdT Enzyme，需新鮮配制)(陰性對(duì)照片不加TdT酶)， 37攝氏度避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min，PBS漂洗三次，防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，每張切片選取5個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并以平均值作為該例大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5.4 免疫組化法檢測(cè)bcl-2、bax蛋白表達(dá)：切片制備同 “TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡”中的步驟，然后采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)bax、bcl-2表達(dá)水平測(cè)定。常規(guī)制備石蠟切片，并采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫二甲苯至水。然后將組織薄膜以免疫組化筆圈涂，于圈內(nèi)滴加bax/bcl-2一抗工作液，bax一抗稀釋比為1∶300；bcl-2一抗稀釋比為1∶500，4℃孵育過(guò)夜，次日取出后，PBS緩沖液洗片3次，滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)，室溫孵育2 h，PBS緩沖液洗片3次，DAB顯示10 min，蘇木素復(fù)染1 min，1% 鹽酸乙醇分化后，中性樹膠封片，數(shù)碼顯微鏡下觀察，選取染色良好區(qū)域，測(cè)定5個(gè)隨機(jī)視野的平均光密度值，取其平均值作為該例大鼠腦組織中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組及以上組間比較采用單因素方差分析，兩組組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 魚藤酮致帕金森大鼠行為學(xué)記分 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較，頭針組、電針組、頭針+電針組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與頭針組比較，頭針+電針組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與電針組比較，頭針+電針組大鼠行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2 各組大鼠黑質(zhì)紋狀體中多巴胺含量、腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)、黑質(zhì)中bax、bcl-2表達(dá)

2.1 各組大鼠腦黑質(zhì)紋狀體組織中DA含量測(cè)定結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠黑質(zhì)紋狀體腦組中DA含量顯著降低(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較，頭針組、電針組、頭針+電針組大鼠黑質(zhì)紋狀體腦組中DA含量顯著升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與頭針組比較，頭針+電針組大鼠黑質(zhì)紋狀體腦組中DA含量顯著升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與電針組比較，頭針+電針組大鼠黑質(zhì)紋狀體腦組中DA含量顯著升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較，頭針組、電針組、頭針+電針組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與頭針組比較，頭針+電針組大鼠大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與電針組比較，頭針+電針組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.3 腦組織中bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平：各組大鼠腦組織中bcl-2、bax蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腦組中bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對(duì)照組比較，頭針組、電針組、頭針+電針組大鼠腦組中bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與頭針組比較，頭針+電針組大鼠腦組中bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與電針組比較，頭針+電針組大鼠腦組中bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠mNSS評(píng)分比較(分)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.01；與頭針組比較，△P<0.01；與電針組比較，☆P<0.01

表2 各組大鼠黑質(zhì)紋狀體中多巴胺含量、各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)、各組大鼠黑質(zhì)中bax、bcl-2表達(dá)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.01；與頭針組比較，△P<0.01；與電針組比較，☆P<0.01

討 論

黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失是PD的病理變化，以壞死為主是PD中多巴胺神經(jīng)元丟失的主要方式，多巴胺神經(jīng)元的死亡過(guò)程是由細(xì)胞凋亡參與的[3-4]，黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元丟失的主要途徑之一可能是細(xì)胞凋亡。目前可用于PD的治療有多種方法，可是長(zhǎng)期應(yīng)用西藥療效較差，有時(shí)出現(xiàn)毒副作用，臨床針灸治療PD已取得一定的成效，根據(jù)中醫(yī)理論和臨床經(jīng)驗(yàn)針灸具有一定抗PD作用[5]。

PD的發(fā)病機(jī)制及病因尚不清楚[6]，最近科研[7-10]表明，在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病中起重要作用可能線粒體功能障礙。黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的凋亡在不同因素引起的PD最終都有表現(xiàn)，在PD的發(fā)病過(guò)程中有一條共同的通道——細(xì)胞凋亡。激發(fā)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡的決定因素是bax與bcl-2的比率，各種神經(jīng)細(xì)胞損傷的啟動(dòng)子是bax(包含DA能神經(jīng)細(xì)胞損傷由6-OHDA所致的)，作為前凋亡蛋白在誘導(dǎo)和啟動(dòng)黑質(zhì)細(xì)胞凋亡方面，它起著關(guān)鍵性的作用。綜上所述bcl-2在抗凋亡中的存在積極的影響，它在治療PD上存在潛在的優(yōu)勢(shì)[11]。

Mochizuki 等[12]經(jīng)過(guò) TUNEL檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡，前人研究表明，細(xì)胞凋亡參與了帕金森病的發(fā)病過(guò)程，曹非等[13]的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。采用TUNEL的方法，證明 PD 大鼠模型黑質(zhì)損傷側(cè)呈現(xiàn)典型的黑質(zhì)凋亡細(xì)胞的存在[14]，證實(shí)了細(xì)胞凋亡參與大鼠帕金森病的發(fā)病。

電針主要是通過(guò)電針儀持續(xù)刺激穴位,來(lái)代替行針過(guò)程以提高臨床療效。Toosizadeh[15]、王曉穎[16]、楊秀毅[17]等發(fā)現(xiàn)電針能夠使帕金森病患者姿態(tài)得到平衡,整體癥狀得到緩減?，F(xiàn)代醫(yī)家張繼海[18]、楊焱[19]、姜雪梅[20]等用頭皮穴療法對(duì)帕金森病患者進(jìn)行臨床觀察,經(jīng)治療四肢震顫幅度顯著降低,下頜顫動(dòng)基本消失，活動(dòng)更加自如,睡眠障礙得到很好的改善。電針頭皮穴在治療帕金森病也有很好的療效，王淑杰[21]，錢浩[22]，梁昕[23]等結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針頭皮穴可以減少PD患者黑質(zhì)紋狀體多巴胺的丟失[24],保護(hù)多巴胺神經(jīng)元延緩PD患者疾病的進(jìn)程,減輕臨床癥狀。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組黑質(zhì)紋狀體中DA含量減少，細(xì)胞凋亡數(shù)增多，大鼠中腦黑質(zhì)bcl-2表達(dá)顯著減少，bax表達(dá)顯著增加；各針刺組大鼠黑質(zhì)紋狀體中DA含量增多，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，bcl-2表達(dá)水平上調(diào)，bax表達(dá)水平下調(diào)，其中尤以頭針+電針組變化最為明顯。提示：電針及頭針干預(yù)措施均可提高PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元合成多巴胺的功能,減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，改善大鼠大鼠的行為學(xué)，上調(diào)bcl-2表達(dá)，抑制bax表達(dá)。而電針、頭針聯(lián)合針刺方案對(duì)多巴胺、細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控作用更為顯著。由此我們推測(cè)，電針和頭針療法治療PD的療效與抗黑質(zhì)紋狀體細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其抗凋亡作用可能是通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的，二者聯(lián)用作用更為顯著。該結(jié)論為電針與頭針聯(lián)用治療帕金森的臨床應(yīng)用提供了理論支持。