外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’柑橘品質(zhì)和乙醇代謝的影響

王晶，洪敏，馮雨,2，賀明陽(yáng),3，王日葵,2*，喻最新，周煉

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 柑桔研究所，重慶，400712) 2(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)3(中國(guó)科學(xué)院 華南植物園，植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州, 510650)

柑橘是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，因其味道酸甜可口、風(fēng)味濃郁且營(yíng)養(yǎng)充分，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。然而柑橘經(jīng)采摘后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)果實(shí)失去水分，風(fēng)味逐漸變淡，通常還積累異味物質(zhì)。乙醇是柑橘在貯藏期間積累的主要異味物質(zhì)之一[1]，果實(shí)產(chǎn)生褐斑、浮皮枯水和水腫等生理病害與其有密切聯(lián)系[2]，因此乙醇的積累是決定果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)好壞的重要因素之一。經(jīng)研究表明，柑橘果實(shí)中乙醇的積累情況受果皮厚度[3]、貯藏溫度[4]與涂膜處理[5]等因素的影響，同時(shí)這些因素也會(huì)使其他風(fēng)味物質(zhì)和果實(shí)基本品質(zhì)發(fā)生變化。近些年來(lái)，學(xué)者們通過(guò)不同調(diào)控方式改善果實(shí)的風(fēng)味與品質(zhì)，這些研究已經(jīng)在獼猴桃[6]、番茄[7]和梨[8]等果實(shí)上實(shí)現(xiàn)。

褪黑素(melatonin，MT)是一種吲哚胺類物質(zhì)，是多數(shù)動(dòng)植物體內(nèi)合成的天然抗氧化劑，對(duì)人體有促進(jìn)睡眠、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效[9]，在植物中其能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)衰老，增強(qiáng)植物對(duì)脅迫的耐受性，提高果實(shí)的抗逆性[10]。目前褪黑素在果實(shí)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[11]、貯藏品質(zhì)[12]與抗性研究[13]方面已有一定進(jìn)展，但是褪黑素對(duì)柑橘采后品質(zhì)和風(fēng)味的研究還比較少。

‘愛(ài)媛38號(hào)’是南香與西子香雜交選育出的新興品種，成熟期較早，由于其果面光滑美觀，口感細(xì)膩化渣、清香爽口、風(fēng)味極佳，市場(chǎng)需求前景廣闊[14]。本文通過(guò)研究褪黑素對(duì)柑橘果實(shí)品質(zhì)與乙醇代謝的影響，為柑橘果實(shí)貯藏品質(zhì)與風(fēng)味調(diào)控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用‘愛(ài)媛38號(hào)’柑橘果實(shí)，于2018年10月30日采自四川資陽(yáng)，采收時(shí)選擇成熟度一致(八成熟)、大小一致并且無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，采后將果實(shí)隨機(jī)分成CK、MT 2組，MT組果實(shí)經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0 g/L的褪黑素溶液浸泡10 min，CK組用清水浸泡作為對(duì)照組。晾干后單果薄膜套袋，置于6～8 ℃環(huán)境中貯藏。入庫(kù)貯藏后分別于貯藏0、10、20、40、60 d時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定分析。

2,4-二硝基苯肼，上海滬試；三氯乙酸(TCA)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、無(wú)水乙醇(色譜級(jí))、乙醛(色譜級(jí))，Aladdin；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone, PVPP)、2-嗎啉乙磺酸、丙酮酸鈉，Adamas；丙酮酸脫羧酶(PDC)ELISA試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)ELISA試劑盒，南京草本源生物科技有限公司；植物多糖多酚總RNA提取試劑盒、SYBR?PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑，日本TaKaRa公司；草酸、NaCl、BaCl2、NaOH、酚酞、2,6-二氯靛酚鈉等,成都市科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pocket Brix-Acidity Meter Master kit手持式折光儀，日本愛(ài)拓公司；CFX98TM Real-Time熒光定量?jī)x,Bio-Rad ；TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Agilent 5977 MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；Varioskan LUX酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛公司。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 感官評(píng)定

感官評(píng)價(jià)采用描述測(cè)試法，參考OBENLAND等[15]的方法，稍作改動(dòng)。選擇12名20～25歲的評(píng)定人員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，12名評(píng)定人員分別為6男6女，評(píng)價(jià)項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。評(píng)定人員于相同評(píng)鑒環(huán)境不同品評(píng)間，對(duì)貯藏60 d后的果實(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo)有新鮮度、水分含量、果面缺陷、氣味和口感，記錄各項(xiàng)目的評(píng)分值，收集評(píng)分表，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 感官評(píng)價(jià)項(xiàng)目及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation items and scoring standards

1.3.2 可溶性固形物與可滴定酸含量測(cè)定

取10個(gè)果實(shí)榨汁后，用手持式折光儀測(cè)定可溶性固形物和可滴定酸含量，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.3 抗壞血酸含量測(cè)定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[16]，單位g/100 mL。取10個(gè)果實(shí)榨汁后，吸取5 mL原果汁用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%草酸定容至100 mL，取2 mL置于燒瓶中，用2,6-二氯靛酚滴定，使稀釋果汁變成淡粉色，30 s不褪色為滴定終點(diǎn)，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4 呼吸強(qiáng)度測(cè)定

采用靜置堿液吸收法[17]。玻璃干燥器清洗干凈，晾干后下面放入培養(yǎng)皿，用移液管吸取10 mL摩爾濃度0.4 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液放入培養(yǎng)皿中，放置隔板，裝入10個(gè)果子，蓋好干燥器，于6～8 ℃下靜置2 h，隨后將堿液轉(zhuǎn)移到三角瓶中(沖洗3次)，加飽和BaCl2溶液5 mL和2滴酚酞指示劑，用摩爾濃度0.2 mol/L草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，粉色沉淀變成白色為滴定終點(diǎn)，記錄草酸用量，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.5 Real-time qRCR測(cè)定

果肉總RNA提?。簠⒄罩参锒嗵嵌喾涌俁NA提取試劑盒操作，然后檢測(cè)其完整性和純度。使用兩步法進(jìn)行cDNA合成。采用SYBR染料法測(cè)定乙醇代謝相關(guān)基因在不同貯藏期的轉(zhuǎn)錄水平，參照SYBR?PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作，PCR擴(kuò)增在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，以ddH2O為陰性對(duì)照，采用2-ΔΔct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物：ACTIN-F：CATCCCTCTCAGCACCTTCC，ACTIN-R：CCAACCTTAAGCACTTCTCC；ADH-F：GCTGGAGGGATTGTAGAAAGTGTAG，ADH-R：CCTGAGGAGGTCACACATATTGCTT；PDC-F：GC AAACGCAATGGGCTCAACGGGTC，PDC-R：CGGCTCCGCT ATGAGATGATCCAAG。

1.3.6 PDC、ADH酶活性檢測(cè)

將果肉凍樣用液氮研磨成粉末，稱取8.00 g果肉后加入5 mL 0.1 mol/L MES-Tris提取緩沖液(含2 mmol/L DTT，4% PVPP，pH 6.5)，冰浴研磨成勻漿，于10 000 r/min，4 ℃條件下離心30 min，收集上清液冰浴保存?zhèn)溆?。PDC與ADH酶活性測(cè)定參照試劑盒操作，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.7 丙酮酸、乙醇、乙醛含量測(cè)定

丙酮酸含量采用2,4-二硝基苯肼法測(cè)定[18]，略微改動(dòng)：將果肉凍樣用液氮研磨成粉末，稱取8.00 g果肉后加入18 mL體積分?jǐn)?shù)5%TCA，在冰上孵育20 min，隨后于4 ℃，10 000 r/min離心15 min，上清液即為提取液。取酶提取物(400 μL)于試管中，加入2 mL DNPH(0.25 g 2,4-二硝基苯肼溶于1 mol/L HCl中)。將試管在37 ℃的水浴中溫育10 min。然后加入2 mL 1.5 mol/L NaOH，通過(guò)渦旋混合，1 min后立即測(cè)定混合液在515 nm處的吸光度。

乙醇、乙醛含量參考OLIVEIRA[19]的方法測(cè)定，略有改動(dòng)，取待測(cè)果肉用液氮研磨成粉末，精準(zhǔn)稱取3.00 g，加入2 mL飽和NaCl溶液，在40 ℃、200 r/min下溫育10 min后，頂空萃取20 min(fibre：CAR/PDMS)，上機(jī)分析。色譜柱：DB-WAX；進(jìn)樣溫度240 ℃，氦氣(He)流速1 mL/min，柱溫30 ℃，保持7 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)譜29～500 amu。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用SPSS 25.0軟件的Duncan法進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’感官品質(zhì)的影響

‘愛(ài)媛38號(hào)’果實(shí)在采摘后普遍果面明亮飽滿、柑橘氣味純正、且酸甜可口、汁胞飽滿、口感良好，經(jīng)過(guò)60 d貯藏后，果實(shí)均明顯出現(xiàn)果面微皺、果香減少、風(fēng)味寡淡、口感下降、并伴隨著枯水的現(xiàn)象。由表2可知，在貯藏結(jié)束時(shí)，MT組果實(shí)的新鮮度顯著高于CK組(P<0.05)，果實(shí)氣味、水分含量、風(fēng)味和口感與CK組無(wú)顯著差異，其中MT組果實(shí)風(fēng)味好于CK組?？梢?jiàn)褪黑素處理‘愛(ài)媛38號(hào)’果實(shí)后，能夠提高其風(fēng)味并顯著提高新鮮度，這可能是因?yàn)椴珊笸屎谒靥幚硌泳徚斯麑?shí)的衰老[10]。

表2 貯藏結(jié)束時(shí)感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results at the end of storage

注：不同字母表示在P<0.05的水平上存在顯著性差異。

2.2 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’基本品質(zhì)的影響

2.2.1 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’可溶性固形物和可滴定酸的影響

可溶性固形物(total soluble solids，TSS)與可滴定酸(titratable acids，TA)是衡量果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[20]。如圖1-A所示，在貯藏期間，果實(shí)TSS含量基本呈上升趨勢(shì)，后期略有下調(diào)。CK組果實(shí)在貯藏前40 d時(shí)由初始8.9%上升至9.4%，在貯藏結(jié)束時(shí)降至9.05%。MT組果實(shí)在貯藏20 d時(shí)TSS含量最高，在貯藏20～60 d期間緩慢下降，貯藏60 d時(shí)，MT組果實(shí)的TSS含量為9.5%，在貯藏期間，MT組的TSS含量始終高于CK組，差異不顯著(P>0.05)。

根據(jù)圖1-B可知，果實(shí)的TA含量整體呈下降趨勢(shì)。2組果實(shí)在貯藏10 d時(shí)的TA含量均有少許下降，隨后在20 d時(shí)達(dá)到峰值后又逐漸降低。貯藏結(jié)束時(shí)，CK、MT組的TA含量分別為0.62%和0.56%，在整個(gè)貯藏期間，2組果實(shí)的TA含量變化趨勢(shì)大致相同，且MT組的TA含量始終顯著低于CK組。LIU等[21]用褪黑素營(yíng)養(yǎng)液培育番茄后會(huì)提高番茄果實(shí)的TSS、TA含量，但在本次試驗(yàn)中外源褪黑素雖然可以提高‘愛(ài)媛38號(hào)’果實(shí)的TSS含量，TA含量卻顯著降低。杜天浩等[22]用褪黑素處理鹽脅迫下的番茄后發(fā)現(xiàn)外源褪黑素可以顯著提高果實(shí)TSS含量，但TA含量會(huì)因?yàn)橥屎谒靥幚淼臐舛扔兴町?，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中所用的褪黑素濃度不宜用于提高果實(shí)的TA含量。

圖1 貯藏期間果實(shí)可溶性固形物含量(A)和可滴定酸含量(B)Fig.1 Fruit soluble solid content (A) and titratable acidcontent (B) during storage注：不同字母表示在同一時(shí)期2組果實(shí)在P<0.05的水平上存在顯著性差異。下同。

2.2.2 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’Vc含量的影響

柑橘類水果是維生素C(Vitamin C，Vc)的重要供應(yīng)來(lái)源，Vc能防止自由基的傷害，可提高人體免疫能力、防癌和機(jī)體應(yīng)急能力，果實(shí)中的Vc含量是評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)之一[23]。如圖2所示，在貯藏期間Vc含量整體呈下降趨勢(shì)，在貯藏10 d時(shí)，CK組的Vc含量高于MT組，隨后CK組Vc含量迅速降低，而MT組緩慢增長(zhǎng)，貯藏20 d時(shí)，CK組和MT組Vc含量為10.70、11.96 mg/100 mL。2組果實(shí)在貯藏40 d時(shí)Vc含量皆有所上升，在40～60 d時(shí)含量下降，至貯藏60 d時(shí)，CK組和MT組果實(shí)Vc含量分別為11.63、12.66 mg/100 mL，在貯藏20～60 d時(shí)，MT組果實(shí)顯著高于CK組(P<0.05)。Vc是柑橘中主要的抗氧化物質(zhì)之一[24-25]，當(dāng)果實(shí)內(nèi)部氧化脅迫加強(qiáng)而Vc合成相關(guān)酶活性減弱時(shí)，Vc與活性氧離子發(fā)生反應(yīng)后其含量也會(huì)有所下降，褪黑素同樣具有清除活性氧自由基的作用[26]。所以推測(cè)可能是外源褪黑素參與了與活性氧之間的反應(yīng)后減少了Vc的損耗，從而提高了果實(shí)的Vc含量。

圖2 貯藏期間果實(shí)Vc含量Fig.2 Fruit ascorbic acid content during storage

2.2.3 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’呼吸強(qiáng)度的影響

呼吸強(qiáng)度反映果實(shí)內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗與果實(shí)整體的衰老情況，果實(shí)在貯藏期間呼吸強(qiáng)度隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降，并且果實(shí)的呼吸作用是影響柑橘風(fēng)味劣變的原因之一[27]。如圖3所示，果實(shí)呼吸強(qiáng)度整體呈下降趨勢(shì)。在貯藏10 d時(shí)，果實(shí)呼吸強(qiáng)度下降明顯，CK組果實(shí)呼吸強(qiáng)度低于MT組，貯藏20 d時(shí)，CK組果實(shí)呼吸強(qiáng)度上升至9.17 CO2mg/(kg·h)，MT組下降至8.69 CO2mg/(kg·h)，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，果實(shí)呼吸強(qiáng)度在40 d時(shí)有1個(gè)明顯的減弱，隨后在60 d時(shí)趨向平緩，在貯藏20～60 d期間，MT組呼吸強(qiáng)度一直低于CK組，在貯藏結(jié)束時(shí)，果實(shí)呼吸強(qiáng)度最低，此時(shí)CK組、MT組果實(shí)呼吸強(qiáng)度分別為5.86、4.49 CO2·mg/(kg·h)，貯藏期間2組果實(shí)的呼吸強(qiáng)度始終無(wú)明顯差異(P>0.05)。辛丹丹等[28]報(bào)道了外源褪黑素處理可以抑制黃瓜貯藏過(guò)程中的呼吸速率，從而減少有機(jī)干物質(zhì)的消耗，維護(hù)細(xì)胞膜的完整性，減緩了果實(shí)的衰老，褪黑素處理降低了‘愛(ài)媛38號(hào)’的呼吸強(qiáng)度，因此果實(shí)的衰老得以延緩，MT組果實(shí)在貯藏后仍維持了較好的新鮮度。

圖3 貯藏期間果實(shí)呼吸強(qiáng)度Fig.3 Fruit respiration intensity during storage

2.3 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’乙醇代謝的影響

2.3.1 Real-Time qPCR測(cè)定

果實(shí)采后進(jìn)行無(wú)氧呼吸時(shí)會(huì)促進(jìn)內(nèi)部乙醇的積累，乙醇生成的反應(yīng)主要有兩步[29]：丙酮酸作為底物經(jīng)過(guò)丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化生成乙醛，乙醛再經(jīng)過(guò)乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化生成乙醇[6]。當(dāng)PDC、ADH的基因表達(dá)量比較低時(shí)，果實(shí)采后的乙醇、乙醛含量積累也會(huì)受到抑制[30]。由圖4-A可知，在貯藏期間果實(shí)中PDC基因相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，CK組果實(shí)在貯藏前20 d時(shí)，PDC基因相對(duì)基因表達(dá)量趨于平穩(wěn)狀態(tài)，在貯藏20 d后CK組的PDC基因相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，在60 d時(shí)CK組的PDC基因相對(duì)表達(dá)量是初始的2.70倍。而MT組在貯藏前40 d時(shí)的PDC基因相對(duì)表達(dá)量都比較穩(wěn)定，在40 d時(shí)劇增，貯藏結(jié)束時(shí)MT組果實(shí)的PDC基因相對(duì)表達(dá)水平是初始的2.37倍，在40、60 d時(shí)，CK組的PDC基因相對(duì)表達(dá)水平顯著高于MT組(P<0.05)。圖4-B表明，在貯藏20 d時(shí)CK組果實(shí)ADH基因表達(dá)量最低，在20 d后ADH基因相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)達(dá)到峰值，為初始的3.13倍，在貯藏結(jié)束時(shí)降至1.74倍。MT組果實(shí)在貯藏10 d時(shí)ADH基因相對(duì)表達(dá)量有所減少，隨后在20 d時(shí)上升至1.05，顯著高于CK組(P<0.05)，而后波動(dòng)性上升，60 d時(shí)ADH基因相對(duì)表達(dá)量為初始的1.35倍，在40、60 d時(shí)，MT組果實(shí)的ADH基因相對(duì)表達(dá)量顯著低于CK組(P<0.05)。SUN等[31]報(bào)道了褪黑素在番茄的花青素合成期間會(huì)促進(jìn)PDC基因表達(dá)與果實(shí)成熟，同時(shí)也有研究[32]表明番茄采后用50 μmol/L褪黑素處理會(huì)使ADH基因表達(dá)上調(diào)，這可能是由于褪黑素在植物不同階段起的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用不同，同時(shí)推測(cè)不同植物對(duì)褪黑素的感受機(jī)制可能存在差異性。

圖4 貯藏期間PDC(A)、ADH(B)的基因表達(dá)量Fig.4 Relative expression of PDC(A) andADH (B) during storage

2.3.2 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’PDC、ADH酶活性的影響

PDC、ADH的酶活性升高會(huì)促進(jìn)乙醛、乙醇的生成[33]。由圖5-A可知，果實(shí)的PDC酶活性在貯藏期間先下降后上升，在貯藏40 d后趨向平緩。在貯藏20 d時(shí),CK組、MT組果實(shí)PDC酶活性最低，分別為9.02、8.08×10-3U/(g·FW)，隨后二者酶活性差距逐漸縮小，在60 d時(shí)，PDC酶活性基本相同。貯藏期間，MT組果實(shí)PDC酶活性始終低于CK組，差異不顯著。由圖5-B可知，在貯藏期間CK組果實(shí)ADH酶活性呈波動(dòng)性下降趨勢(shì)，MT組果實(shí)在貯藏前20 d酶活性下降迅速，隨后逐漸趨向平穩(wěn)。在貯藏10 d時(shí)CK組果實(shí)ADH酶活性顯著高于MT組，隨后CK組和MT組果實(shí)ADH酶活性下降，在20 d時(shí)2組果實(shí)ADH酶活性最低。在20～60 d，CK組先上升隨后下降，而MT組果實(shí)ADH酶活性緩慢上升，在貯藏期間CK組果實(shí)的ADH酶活性始終高于MT組，并在10、40 d時(shí)差異顯著(P<0.05)。乙醛、乙醇積累時(shí)通常伴隨著PDC、ADH酶活性的提高[34]，而外源褪黑素處理可以使果實(shí)的PDC、ADH酶活性降低，可以抑制丙酮酸向乙醛、乙醇轉(zhuǎn)化。

圖5 貯藏期間PDC酶活性(A)、ADH酶活性(B)變化Fig.5 Changes in PDC enzyme activity (A) and ADHenzyme activity (B) during storage

2.3.3 外源褪黑素對(duì)‘愛(ài)媛38號(hào)’丙酮酸、乙醛和乙醇含量的影響

植物在呼吸作用時(shí)會(huì)先通過(guò)糖酵解將糖氧化分解生成丙酮酸[35]，在無(wú)氧呼吸作用下，丙酮酸會(huì)向乙醛、乙醇轉(zhuǎn)化而減少其含量。由圖6-A可知，2組果實(shí)的丙酮酸含量一直處于波動(dòng)狀態(tài)，并且在0～20 d時(shí)波動(dòng)最大。CK組與MT組果實(shí)丙酮酸含量在貯藏10 d時(shí)最低，分別為31.08、33.04 μg/g，在20 d時(shí)劇烈增長(zhǎng)至50.04、60.60 μg/g，此時(shí)果實(shí)丙酮酸含量達(dá)到最高值，2組間差異顯著(P<0.05)。在20～60 d果實(shí)丙酮酸含量先減少后增加，40 d時(shí)MT組果實(shí)丙酮酸含量顯著高于CK組(P<0.05)，在貯藏結(jié)束時(shí)丙酮酸含量上調(diào)，2組間差異不顯著，且貯藏期間MT組果實(shí)丙酮酸含量始終高于CK組。推測(cè)可能是因?yàn)镻DC、ADH基因表達(dá)受到抑制后，酶活性降低，丙酮酸向乙醛、乙醇的轉(zhuǎn)化受到抑制，導(dǎo)致丙酮酸含量上調(diào)。

果實(shí)內(nèi)部的乙醇代謝直接影響乙醇和乙醛的積累水平，而且柑橘在貯藏期間，果實(shí)中的乙醇、乙醛濃度會(huì)隨貯藏期延長(zhǎng)而不斷變化[36]。如圖6-B可知，貯藏期間果實(shí)中的乙醛含量整體呈上升趨勢(shì)。在10～20 d時(shí)CK組果實(shí)乙醛含量先上升后下降，在20 d時(shí)為0.03 mg/g，隨后乙醛含量持續(xù)上升，至貯藏結(jié)束時(shí)，達(dá)到0.10 mg/g；貯藏前40 d時(shí)MT組果實(shí)乙醛含量一直增加，貯藏結(jié)束時(shí)緩慢降至0.06 mg/g，40 d時(shí)，MT組果實(shí)乙醛含量顯著高于CK組(P<0.05)，但CK組在貯藏后期增長(zhǎng)劇烈，貯藏60 d時(shí)，CK組果實(shí)乙醛含量是MT組的1.58倍。如圖6-C所示，貯藏期間果實(shí)的乙醇含量先上升隨后下降，隨后持續(xù)上升，總體呈波動(dòng)上升的狀態(tài)。貯藏10 d時(shí)，CK組、MT組果實(shí)乙醇含量分別0.47、0.28 mg/g，在20 d時(shí)下降至0.33、0.25 mg/g，在20～40 d時(shí)2組乙醇含量均增長(zhǎng)了約0.1 mg/g，在貯藏40 d后，CK組果實(shí)乙醇含量增長(zhǎng)劇烈，在貯藏結(jié)束時(shí)達(dá)到0.89 mg/g，約為MT組的2.09倍，在貯藏期間，2組果實(shí)間的乙醇含量均有顯著差異(P<0.05)。研究表明，與常溫貯藏相比，低溫貯藏能夠顯著減少柑橘果實(shí)中乙醇的積累量[37]，而在本研究中，采后褪黑素處理能夠進(jìn)一步減少柑橘在低溫貯藏過(guò)程中乙醇的積累。

圖6 貯藏期間果實(shí)的丙酮酸(A)、乙醛(B)和乙醇(C)含量Fig.6 Contents of pyruvate (A), acetaldehyde (B) and ethanol (C) during storage time

3 結(jié)論

綜合以上結(jié)果表明，‘愛(ài)媛38號(hào)’果實(shí)經(jīng)過(guò)褪黑素處理后，能夠顯著提高貯藏期果實(shí)的新鮮度，果實(shí)風(fēng)味也得到一定改善。在貯藏結(jié)束時(shí)，經(jīng)褪黑素處理后的果實(shí)與對(duì)照組相比,可溶性固形物含量提高了0.45%，Vc含量提高了1.37 mg/100 mL，并且褪黑素處理果實(shí)后可以抑制果實(shí)的呼吸強(qiáng)度，減少可滴定酸含量從而提高果實(shí)的固酸比。測(cè)定發(fā)現(xiàn)‘愛(ài)媛38號(hào)’經(jīng)褪黑素處理后果實(shí)中PDC、ADH的酶活性和基因相對(duì)表達(dá)量會(huì)受到抑制，導(dǎo)致丙酮酸含量累積，乙醛、乙醇含量減少。在貯藏60 d后，經(jīng)褪黑素處理過(guò)的果實(shí)與對(duì)照組相比乙醇含量減少了52.21%，乙醛含量減少了36.85%。由此可見(jiàn)，使用質(zhì)量濃度為1.0 g/L的褪黑素溶液處理‘愛(ài)媛38號(hào)’可以延緩果實(shí)衰老，提高果實(shí)貯藏期品質(zhì)，并通過(guò)抑制PDC和ADH兩個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)而降低酶活性,最終減少乙醛、乙醇的積累，延緩貯藏期間柑橘果實(shí)異味的產(chǎn)生。