水解制備細(xì)菌纖維素納米纖維及納米纖維穩(wěn)定的Pickering乳液特性

劉子菲，路蘋(píng)，高子喬，賈梅杰，翟希川，林德慧，楊興斌

(陜西師范大學(xué)，陜西省食品綠色加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安，710119)

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是一類由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖，屬納米級(jí)纖維，已被世界公認(rèn)為性能最好、實(shí)用價(jià)值較好的纖維素。細(xì)菌纖維素具有許多優(yōu)良的特性：超細(xì)超純；高持水和保水性，具有極強(qiáng)的水結(jié)合性；高抗張強(qiáng)度和彈性模量；比表面積大；生物適應(yīng)性和生物可降解性等[1-3]。加之其安全性在1992年已被美國(guó)食品與藥品管理局接受和認(rèn)可，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、造紙、納米材料等領(lǐng)域[4-9]。近年來(lái)，細(xì)菌纖維素在食品領(lǐng)域作為增稠劑、填充劑、脂肪替代品等也備受關(guān)注，但細(xì)菌纖維素在食品乳化劑方面的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道。

乳液是由兩種不相溶的液體通過(guò)添加乳化劑或穩(wěn)定劑所形成的，廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品和食品等行業(yè)中。20世紀(jì)初，皮克林(Pickering)對(duì)由固體顆粒穩(wěn)定的乳液進(jìn)行了系統(tǒng)研究。因此，在溶液中以固體膠?；蚣{米顆粒作為乳化劑形成的乳液稱作Pickering乳液[10-12]。固體顆粒與表面活性劑均具有乳化作用，但其作用機(jī)理及乳化方式卻不相同，表面活性劑乳化體系是亞穩(wěn)定體系，屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，表面活性劑在油/水界面上的吸附是一種動(dòng)態(tài)平衡，在一定的條件下可以快速吸附與脫附[13-14]。以表面活性劑為乳化劑時(shí)，油相的不同會(huì)影響形成乳液的類型，在某些條件下，表面活性劑乳化體系還容易發(fā)生轉(zhuǎn)相，而運(yùn)用固體顆粒乳化可以制得動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)均非常穩(wěn)定的油/水分散體系[15]。因此，Pickering乳液成為當(dāng)前食品行業(yè)的研究熱點(diǎn)[16-18]。目前，多糖是乳化劑的研究熱點(diǎn)，動(dòng)植物多糖因生產(chǎn)周期較長(zhǎng)和提取純化過(guò)程復(fù)雜而受到限制，因此，來(lái)源廣泛、易于提取純化的微生物多糖成為乳化劑的研發(fā)熱點(diǎn)[19-21]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，對(duì)影響納米纖維粒徑的4個(gè)主要影響因素(鹽酸濃度、水解溫度、水解時(shí)間、料液比)進(jìn)行優(yōu)化。利用Design-Expert軟件的Box-Benhnken design(BBD)模式建立試驗(yàn)數(shù)學(xué)模型[22-24]，確定最佳水解條件。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用水解所得的納米纖維制備Pickering乳液，并對(duì)Pickering乳液的特性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸(分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；菌株KomagataeibacterxylinusCGMCC 3917：中國(guó)菌種保藏中心，純水：實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器公司；101-2AB電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器公司；SHA-C/SHA-B/THZ-82水浴恒溫振蕩器，華普達(dá)儀器公司；PHSJ-3F pH計(jì)，雷磁儀器廠；99-1磁力攪拌器，常州國(guó)華電器公司；TD5A-WS離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PA-200X馬爾文激光粒度分析儀，孚光精儀公司；LVEM5透射電子顯微鏡，北京昊諾斯科技有限公司；Milli-Q Integral 15 型純水/超純水一體機(jī)，上海金甚生物科技有限公司；F6/10-10G高速剪切攪拌機(jī)，德國(guó)IKA公司；Panda Plus高壓均質(zhì)機(jī)，意大利帕爾瑪公司；milli-Q Integral 15型純水-超純水-體機(jī)，德國(guó)密理博；F6/10-10G高速剪切攪拌機(jī)，德國(guó)Fluco；Panda Plus高壓均質(zhì)機(jī)，意大利Parna。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌纖維素的制備

菌株KomagataeibacterxylinusCGMCC3917接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中(pH 5.0)(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物5，K2HPO410，MgSO415，乙醇20[25]，30 ℃靜態(tài)培養(yǎng)14 d。將收獲的纖維素膜用自來(lái)水過(guò)夜沖洗后，浸泡于0.1 mol/L NaOH溶液(80℃)，30 min后用去離子水沖洗纖維素膜至中性。把純化后的纖維素膜放入無(wú)菌水中，并儲(chǔ)存于4℃的冰箱[26]。

1.3.2 納米纖維素的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[27]的方法制備納米纖維素。將純化后的細(xì)菌纖維素濕膜在粉碎機(jī)中粉碎5 min(15 000 r/min)，得到纖維素懸浮液。然后將纖維素懸浮液離心(3 040 ×g) 10 min去除游離水，將所得的纖維用鹽酸進(jìn)行水解。水解后，懸浮液用去離子水洗滌并離心(10 000 ×g)至pH為中性并儲(chǔ)存在4℃冰箱里[28]。

(1)細(xì)菌纖維素水解單因素實(shí)驗(yàn)

將5 g細(xì)菌纖維素用不同梯度濃度鹽酸配置成不同梯度的料液比，于沸水浴處理一定時(shí)間后終止反應(yīng)，加超純水洗滌并離心至中性，得到細(xì)菌纖維素樣品，測(cè)定該樣品粒徑，選取最接近的水平作為最優(yōu)水平。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。

選取水解時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)，料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)(g∶mL)，水解溫度(60、70、80、90、100℃)，鹽酸濃度(2、3、4、5、6 mol/L)

(2)細(xì)菌纖維素水解條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 7.0.0 Trial中Box-behnken設(shè)計(jì)模式來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。以鹽酸濃度、溫度、時(shí)間、料液比4個(gè)因素為自變量，分別以X1、X2、X3、X4表示，并根據(jù)現(xiàn)有試驗(yàn)條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了各影響因素合適的條件范圍，分別為2～4 mol/L、60～80 ℃、3～5 h、1∶5～1∶15，以納米纖維素的得率作為響應(yīng)值Y，試驗(yàn)自變量因素編碼及水平見(jiàn)表1。

1.3.3 納米細(xì)菌纖維素粒徑的測(cè)量

將水解后的細(xì)菌纖維素納米纖維的粒徑大小按照參考文獻(xiàn)YAN等的方法[29]，做了一定修改，將水解后的納米纖維分散在PBS溶液中，利用馬爾文激光粒度儀對(duì)其粒徑大小進(jìn)行測(cè)量分析。馬爾文激光粒度儀測(cè)定的粒徑是粒子的等效體積直徑，其粒徑大小根據(jù)公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：ni表示相似粒徑大小的粒子數(shù)量，di表示粒子大小。

表1 實(shí)驗(yàn)自變量水平及編碼水平Table 1 Experimental variable level and encoding level

1.3.4 制備Pickering乳液

用上述所制備的細(xì)菌纖維素納米纖維作為Pickering乳液穩(wěn)定的固體顆粒，添加0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的納米纖維在20/80的油/水體系中，該研究中的油相是花生油，水相是10 mmol/L的磷酸緩沖溶液(pH=7)。將上述制備好的樣品在高速剪切攪拌機(jī)中攪拌1 min(15 000 r/min)，然后進(jìn)行高壓均質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1-A可知，在鹽酸濃度為1～3 mol/L時(shí)，細(xì)菌纖維素納米纖維的粒徑顯著減小，且鹽酸濃度為3 mol/L時(shí)，細(xì)菌纖維素納米纖維的粒徑最小。由圖1-B可知，溫度在60～70℃，納米纖維的粒徑顯著減小，在70℃時(shí)，納米纖維的粒徑達(dá)到最小；溫度在70～100℃，納米纖維的粒徑隨著溫度升高變化不明顯。由此可知，細(xì)菌纖維素最適水解溫度為70℃。由圖1-C可知，水解時(shí)間在1～3 h，納米纖維的粒徑顯著減小，水解3 h粒徑達(dá)到最小，之后粒徑變化不明顯。可見(jiàn)，細(xì)菌纖維素的最適水解時(shí)間為3 h。由圖1-D可知，隨著料液比的減小，納米纖維的粒徑顯著減小，在料液比達(dá)到1∶10時(shí)，納米纖維的粒徑最小，之后變化不明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)選取液料比為1∶10。

A-鹽酸濃度;B-水解溫度;C-水解時(shí)間;D-料液比圖1 單因素條件對(duì)納米纖維粒徑的影響Fig.1 Effects of single factor condition on the particle size of nanofibers

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，鹽酸水解細(xì)菌纖維素的工藝參數(shù)中，影響細(xì)菌纖維素粒徑的主要因素按照主次順序排列為鹽酸濃度(X1)=水解溫度(X2)>料液比(X4)>水解時(shí)間(X3)，在所選各因素水平范圍X1、X2、X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X12、X22、X32、X42對(duì)Y的影響顯著。由此可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不呈簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有較大的影響作用。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 納米纖維粒徑的多元二次方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model of the particle sizes of the nano fibers

表4 回歸模型方差結(jié)果Table 4 Variance result of regression model

2.3 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

利用Design-Expert軟件可以做出兩兩自變量為坐標(biāo)的三維解析表面和二維等高線圖，這些圖不僅可以直觀地反映每個(gè)變量對(duì)響應(yīng)量的影響程度，還能很好地揭示因素之間的交互作用。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強(qiáng)，而圓形則相反[30]。

圖2顯示了料液比和溫度處于中心水平時(shí)，水解時(shí)間和鹽酸濃度的交互作用對(duì)納米纖維粒徑的影響。從其等高線可直觀地看出，水解時(shí)間和鹽酸濃度的交互作用顯著。由圖可知，隨著水解時(shí)間的增加，納米纖維的粒徑減小。隨著鹽酸濃度的增加，納米纖維的粒徑迅速減小后呈緩慢減小，因此，在鹽酸濃度為3 mol/L，水解時(shí)間為4 h時(shí)，納米纖維的粒徑達(dá)到最小值。

A-響應(yīng)曲面圖；B-等高線圖圖2 時(shí)間和鹽酸濃度交互作用納米纖維粒徑的影響Fig.2 Interaction effects of hydrochloric acid concentraonand hydrolysis time on the paticle sizes of nano-fibers

圖3顯示了水解時(shí)間和溫度處于中心水平時(shí)，鹽酸濃度和料液比的交互作用對(duì)納米纖維粒徑的影響。由圖可知，此兩因素的交互作用顯著。隨著料液比的增加，納米纖維的粒徑先減小后升高，隨著鹽酸濃度的增加，納米纖維粒徑緩慢減小。

A-響應(yīng)曲面圖；B-等高線圖圖3 料液比和鹽酸濃度交互作用對(duì)納米纖維粒徑Fig.3 Interaction effects of hydrochloric acid concentraon and material ratio on the paticle sizes of nano-fibers

圖4顯示了料液比和鹽酸濃度處于中心水平時(shí)，時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)納米纖維粒徑的影響。由圖4可知，水解時(shí)間和溫度的交互作用顯著。隨著水解時(shí)間的增加，細(xì)菌纖維素納米纖維的粒徑減小，隨著水解溫度的增加，納米纖維的粒徑減小，當(dāng)水解時(shí)間為4 h，水解溫度為70℃時(shí)，納米纖維的粒徑達(dá)到最小值。

A-響應(yīng)曲面圖；B-等高線圖圖4 時(shí)間和溫度的交互作用對(duì)納米纖維粒徑的影響Fig.4 Interaction effects of hydrochloric acid concentraon and material ratio on the paticle sizes of nano-fibers

2.4 細(xì)菌纖維素納米纖維的Pickering乳液制備及特性

圖5是細(xì)菌纖維素水解前和水解后的透射電鏡圖，由圖5-A可知，水解前細(xì)菌纖維素由納米纖維絲聚合在一起形成較粗的纖維絲帶，纖維絲帶通過(guò)氫鍵相互的交織纏繞在一起形成多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由圖5-B可知，水解后纖維絲帶被水解成納米纖維絲，破壞了微纖維絲之間的氫鍵作用力。水解后的納米纖維絲的直徑為30～80 nm,纖維絲的長(zhǎng)度為0.5～2 μm。

A-水解前；B-水解后；C-Pickering乳液圖5 細(xì)菌纖維素纖維水解前后及Pickering乳液的透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopy (TEM) images of bacterial cellulose fibers before hydrolysis and after hydrolysis, and TEM image of Pickering emulsions stabilized by nano-fibers

已有研究報(bào)道，納米纖維具有一定親水及親油特性，從而能夠降低油/水界面的張力起到乳化作用[31]。本課題組在前面研究中也已經(jīng)證明細(xì)菌纖維素納米纖維具有一定的親水和親油特性[32]，因此，利用上述制備的納米纖維來(lái)制備Pickering乳液，添加0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))細(xì)菌纖維素納米纖維的油/水體系呈現(xiàn)出均勻的乳狀液。用透射電鏡觀察到乳液液滴呈均勻的球形，大小約為10～30 nm(圖5-C)。

乳液的穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)乳液的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)考察了在常溫下，儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。如圖6所示，在常溫下放置4周的Pickering乳液的粒徑?jīng)]有顯著的變化，表明所制備的乳液穩(wěn)定性較好。同時(shí)，又考察了溫度對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響。由圖7-A可知，在溫度30～90℃乳液的粒徑分布均在100 nm以內(nèi)，在100℃，乳液的粒徑大于100 nm。根據(jù)計(jì)算得到乳液的平均粒徑(圖7-B)，30～80℃，隨著溫度的升高，乳液的平均粒徑?jīng)]有顯著增大，在80～100℃時(shí)乳液的粒徑顯著增大，但也均小于100 nm。乳液的電位也受溫度的影響較小(圖7-C)，沒(méi)有顯著變化。綜上所述，表明該乳液的熱穩(wěn)定性較好，在30～100℃都呈現(xiàn)均勻的乳液(圖7-D)。

3 結(jié)論

利用Design-Expert軟件對(duì)影響納米纖維素粒徑的4個(gè)關(guān)鍵參數(shù)作了考察，研究表明鹽酸濃度、溫度與時(shí)間之間的關(guān)系更接近于二次多項(xiàng)式模型。模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)真實(shí)值之間的相關(guān)性達(dá)93.53%，模型能夠解釋83.75%響應(yīng)值的變化，說(shuō)明該模型擬合程度良好。通過(guò)響應(yīng)面等高線圖，直觀地反映了各影響因素之間交互作用的顯著程度。響應(yīng)面分析表明，

A-乳液粒徑分布；B-乳液平均粒徑圖6 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)Pickering乳液粒徑的影響Fig.6 Effect of storage time on the particle sizes of Pickering emulsion

各因素間均具有較強(qiáng)的交互作用。通過(guò)工藝條件的優(yōu)化得出的最佳工藝條件為:鹽酸濃度為2.87 mol/L、料液比為1∶7.51 (g∶mL)、水解時(shí)間3.50 h、溫度61.72℃。在優(yōu)化條件下得到納米纖維素的粒徑為520 nm，與理論預(yù)測(cè)值508 nm較好吻合，表明模型合理有效。

利用水解所得的納米纖維制備Pickering乳液，研究發(fā)現(xiàn)，0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的納米纖維可穩(wěn)定20/80的油/水體系，乳液的平均粒徑為30 nm。且在常溫下放置4周后，乳液的粒徑無(wú)顯著變化。另外，隨著溫度的升高(30～80℃)，乳液的粒徑也無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明細(xì)菌纖維素納米纖維穩(wěn)定的Pickering乳液顯示出良好的熱穩(wěn)定性。

A-乳液的粒徑分布；B-乳液的平均粒徑；C-乳液的電位；D-乳液的外觀圖7 溫度對(duì)Pickering乳液的特性影響Fig.7 Influence of temperature on properties of Pickering emulsion