乳清蛋白源抗氧化肽的酶法制備及評價方法的研究進展

劉振民，龐佳坤，鄭遠榮

1(乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

人體內細胞在代謝過程中產生大量自由基和活性氧，而抗氧化系統(tǒng)可以有效地清除自由基。當自由基產生過多或抗氧化系統(tǒng)失效時，這種平衡就會被打破，機體將處于氧化應激狀態(tài)，這種情況會導致細胞損傷[1]。已有研究認為持續(xù)的氧化應激反應是神經退行性疾病[2-3]、癌癥[4]、肝損傷[1]、衰老[5]、心血管疾病[6-7]、慢性胰腺炎[8]等疾病的誘因。細胞一般通過預防、修復、產生抗氧化劑或攝入膳食中的抗氧化劑[9-10]來保護自己免受氧化損傷。內源性抗氧化劑包括細胞內酶——過氧化物歧化酶和過氧化氫酶。已知的膳食抗氧化劑包括抗壞血酸,VE,多酚類物質和類胡蘿卜素等。

人工合成的抗氧化劑雖然具有很強的抗氧化活性，但在機體內存在潛在的風險，于是人們把目光轉向了天然的抗氧化劑。其中乳清蛋白因其較強的抗氧化活性而備受關注，乳清是在干酪和干酪素的生產過程中產生的副產品。一般10 kg牛奶可以生產1～3 kg干酪，排出7～9 kg乳清。而乳清蛋白是乳清的主要成分之一，具有較高的營養(yǎng)價值和功能特性，被廣泛的應用于各種食品中。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白以及其他多種活性成分組成。其中，β-乳球蛋白、α-乳白蛋白分別約占乳清蛋白的43.6%、19.7%，氨基酸序列見圖1。乳清蛋白富含的必需支鏈氨基酸，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，在代謝、血糖穩(wěn)態(tài)和神經功能中發(fā)揮著重要作用。乳清蛋白產品可以分為乳清濃縮蛋白(whey protein concentration，WPC)，乳清分離蛋白(whey protein isolates，WPI)等。乳清蛋白是制備抗氧化肽的良好來源，本文對乳清蛋白源抗氧化肽的酶法制備及抗氧化活性的評價方法進行了綜述，以期為進一步綜合利用乳清蛋白產品提供思路。

圖1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白氨基酸序列Fig.1 Amino acid sequence of α-lactalbumin and β-lactoglobulin

1 乳清蛋白源抗氧化肽的酶法制備

酶解是從完整的蛋白質序列中釋放生物活性肽的有效途徑，可以使肽鍵斷裂形成更小的肽或游離氨基酸。具有水解條件溫和、對蛋白質底物破壞較小等優(yōu)點，是生產食品級蛋白質水解物的理想方法。

1.1 酶法制備

不同的蛋白酶和反應條件(pH、溫度、時間、酶底比)會產生含有不同肽段和不同抗氧化活性的水解產物。目前制備乳清蛋白源抗氧化肽多選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶等內切酶(表1)。GAD等[11]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的抗氧化活性與濃度有關。為了提高乳清蛋白水解產物的抗氧化活性，MAUX等[12]發(fā)現(xiàn)用木瓜蛋白酶水解WPC時，將pH控制在7時的水解產物抗氧化活性明顯高于不控制pH條件的水解產物抗氧化活性。這是由于pH值影響酶的三級結構，因此pH值的微小變化也可能影響酶的構象。許多研究表明，堿性蛋白酶水解WPC得到的水解產物比其他蛋白酶水解的乳清蛋白水解產物(whey protein hydrolysates，WPH)具有更強的抗氧化活性[13-15]。這是由于蛋白酶酶切位點的不同造成了抗氧化肽結構和活性的差異。并且水解WPC前在95 ℃條件下預熱5～10 min，有助于蛋白質球狀結構的展開，使疏水區(qū)域更容易被酶利用[16-17]。PENG等[18]研究了不同水解時間對堿性蛋白酶WPH抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)過長的水解時間會導致水解出過多的游離氨基酸，從而導致抗氧化活性降低。水解是一個動態(tài)的過程，肽段不斷地形成和降解，因此如何選擇和優(yōu)化水解條件以最大程度釋放出抗氧化肽是至關重要的。

表1 酶法制備乳清蛋白源抗氧化肽Table 1 Preparation of whey protein source antioxidant peptides by enzymatic method

注：WPI，乳清分離蛋白；WPC，乳清濃縮蛋白；WPH，乳清蛋白水解物；TE，Trolox等價物；“—”表示所引文獻的研究中未鑒定具體多肽序列；RP-HPLC，反相高效液相色譜；Q-TOF MS，三重四級桿-飛行時間質譜；MALDI-TOF MS，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜；LC-MS/MS，液相色譜質譜/質譜聯(lián)用。

據報道，抗氧化肽都是一些分子質量比較小的肽，并且WPH中得到的肽的種類比較多，肽的分子質量比較接近，因此分離純化較困難，一般將多種分離技術連用進行分離?？寡趸牡拇址蛛x一般使用超濾技術，按照分子質量的大小進行膜過濾，從而實現(xiàn)分離。有研究者[14,19]發(fā)現(xiàn)含有小分子質量肽段的水解產物(<3 kDa)比那些含有大分子質量肽段的水解產物具有更高的抗氧化活性。但超濾技術僅僅是按照分子質量的大小進行分離，如果需要純度更高的肽，需要進一步采用柱層析結合高效液相色譜等手段進行分離，得到純度比較高的抗氧化肽后，再通過質譜鑒定其氨基酸序列(表1)。部分研究者在酶解乳清蛋白水解產物中鑒定出了幾種來自于β-乳球蛋白的抗氧化肽，其中大部分肽都在f(42-61)、f(77-110)和f(123-135)范圍內[20-21]。HERNANDEZLEDESMA等[22]用Corolase PP酶水解β-乳球蛋白，在水解產物3 kDa的組分中鑒定出了幾種肽和氨基酸。合成了MHIRL, YVEEL,和WYSLAMAASDI 3種多肽，分別測定其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)3種合成肽的抗氧化活性高于等摩爾對應游離氨基酸的混合物，其中WYSLAMAASDI的抗氧化活性與合成的抗氧化劑丁基羥基乙醚相當，約是植物多酚兒茶素和槲皮素的1/4左右。NONGONIERMA等[23]在α-乳白蛋白和乳鐵蛋白中發(fā)現(xiàn)了一種合成二肽WC，其IC50值為0.26 mmol/L，相當于17.2 nmol/L的Trolox。此外，SADAT等[24]用嗜熱芽孢桿菌蛋白酶水解α-乳白蛋白得到純化肽LDQW、INYW，抗氧化活性分別為相同條件下Trolox的5和10倍。

1.2 抗氧化肽作用機理

目前，抗氧化肽的構效關系及其機理尚未完全闡明。但已有的研究表明，抗氧化肽的活性與肽的氨基酸組成、序列、結構和疏水性有關。抗氧化肽中的疏水性氨基酸如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等的非極性脂肪烴側鏈能夠加強抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸互作，使肽與氧結合或抑制脂質中氫的釋放，從而保護脂質體系、膜質的完整性，起到抗氧化作用[25]。而抗氧化肽中帶有芳香環(huán)結構的殘基如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸由于酚羥基和吲哚基團可以作為氫供體而具有較強的抗氧化活性，因為酚羥基和吲哚基團的自由基與簡單的過氧自由基相比，具有穩(wěn)定性更高，壽命更長的特點。其中酪氨酸的苯環(huán)是共軛體系，鄰、對位基團易受側鏈基團影響，是典型的氫供體。酪氨酸的誘導效應是給電子，使酚羥基的密度進一步增大，并使其脫掉質子后形成更穩(wěn)定的自由基中間體[26]。

單純的氨基酸也有某些抗氧化活性，但大多數(shù)情況下低于其組成的抗氧化肽的活性。因此，可以認為抗氧化肽的高生物活性源于肽鏈內氨基酸之間的短程相互作用。含巰基的半胱氨酸作為抗氧化劑能夠和自由基直接作用，對肽的抗氧化活性具有重要貢獻。組氨酸的咪唑基團與其金屬螯合、供氫和脂質過氧化能力有關，含組氨酸的抗氧化肽的活性受物理環(huán)境的影響，特別是疏水化合物的存在可以增加對疏水自由基的接近性[27]。CHEN等[25]發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的活性依賴于肽段His-His，去除C端His殘基，使得抗氧化活性降低約50%，而去除N端Leu則對抗氧化活性無影響。有研究[28]用統(tǒng)計建模方法對抗氧化肽的結構特征進行分析，發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的N和C端氨基酸是抗氧化活性的重要預測因子，N末端氨基酸的疏水性對肽段的抗氧化活性有重要影響，迄今發(fā)現(xiàn)的抗氧化肽中有一半以上在N端有疏水殘基。C末端氨基酸的電荷性質(即凈電荷、分子極性)也是抗氧化活性的重要預測因子。這個位置是一個極性區(qū)域，受其靜電勢的影響，色氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸和酪氨酸經常出現(xiàn)。與C端相鄰的第二個氨基酸被認為是抗氧化活性的主要貢獻者，如果該氨基酸具有較大的氫鍵和空間性質，疏水性較低，則將增加潛在的抗氧化活性。乳清蛋白肽在這個位置通常是谷氨酸、精氨酸或天門冬氨酸。根據氨基酸的理化性質可以對其活性機制進行分類，如圖2所示[29]，抗氧化劑通過提供氫原子和提供電子兩種途徑清除自由基。在提供氫原子途徑中，抗氧化劑脫去一個H·給自由基A·，生成穩(wěn)定化合物AH，而抗氧化劑轉變?yōu)楸容^穩(wěn)定的自由基B·，不易引發(fā)新的自由基鏈式反應，從而使鏈反應終止。而在提供電子的途徑中，則需要進行電子轉移和質子轉移兩步反應[29]。

圖2 抗氧化劑與自由基反應機制Fig.2 Mechanisms of antioxidant reacting with free radical

總體來說，乳清蛋白源抗氧化肽的活性可能是由上述部分或全部機制的聯(lián)合作用或者協(xié)同作用決定的。因此，在進行活性評價時，評估每種類型的活性對于更好的理解相關機制至關重要。

2 評價方法

乳清蛋白/肽的抗氧化活性，需要用不同的方法進行評估。目前常用的方法主要有體外化學法、體外細胞培養(yǎng)法和體內動物實驗法(表2)。

表2 不同評價方法的對比Table 2 Comparison of different evaluation methods

2.1 體外化學法

體外測定抗氧化活性是評價水解蛋白或多肽制劑抗氧化潛力的關鍵。由于抗氧化劑的復雜性，沒有一種單一的方法可以測量一種物質的總抗氧化活性。因此，在進行體外活性評價時應盡可能的全面，或著重評價實驗重點關注的抗氧化指標，選擇合適的試驗方法。目前測定乳清蛋白/肽的體外抗氧化活性的方法主要有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力, 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)自由基清除能力,鐵離子還原能力(ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)，氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)等。其中，DPPH和ABTS方法的機理是抗氧化化合物與自由基之間發(fā)生電子轉移。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在氮橋的一個原子上有一個不成對電子。溶液呈深紫色，樣品中的抗氧化化合物通過與孤電子配對，使得深紫色的DPPH自由基被還原成黃色。并且DPPH的褪色程度與其所接受的電子數(shù)量呈定量關系。因此較高的DPPH值代表著較高的抗氧化活性[30]。ABTS經活性氧氧化后可以生成穩(wěn)定的藍綠色的陽離子ABTS+·，樣品中的抗氧化化合物可以與ABTS+·反應，從而使體系褪色。ABTS自由基清除活性可以體現(xiàn)在將ABTS轉化為無色產物的能力，這與氫供體或鏈斷裂性能有關[29]。FRAP法的原理是基于氧化還原的比色法，屬于電子轉移途徑。Fe3+-TPTZ(三吡啶三嗪)在酸性條件下被樣品中的抗氧化化合物還原成Fe2+-TPTZ，溶液變成深藍色。其變色程度與還原能力呈定量關系[31]。ORAC法屬于氫原子轉移途徑，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽分解生成的過氧自由基與熒光探針反應生成非熒光產物。而樣品中的抗氧化化合物可以抑制探針氧化，從而保持熒光。隨著時間的推移，熒光產物的形成速率和數(shù)量決定了抗氧化化合物的能力，ORAC值表示為熒光衰減曲線的凈面積[32]。

2.2 體外細胞培養(yǎng)法

體外抗氧化活性分析的結果具有一定的局限性，因為這些分析不能反應細胞的生理條件。因此，越來越多的研究者使用體外細胞培養(yǎng)法評估乳清蛋白/肽。其中體外細胞一般選擇經常暴露于氧化應激的靶器官(如肝臟、大腦或肌肉)細胞。據報道，機體的抗氧化防御系統(tǒng)主要依賴于細胞中抗氧化劑的含量(谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD))，這些抗氧化劑具有許多預防氧化的功能。通過飲食提高細胞中GSH、CAT、SOD的含量有助于健康和長壽。

2.2.1 谷胱甘肽活性

GSH在細胞水平上可以通過氫原子轉移直接作用于自由基，并且可以促進氨基酸的運輸，通過減少細胞內的一些活性氧自由基使抗氧化劑(如VC和VE)恢復其功能形式。為了證明乳清蛋白/肽對細胞的影響，最近的研究中，TSENG等[33]用WPC預處理大鼠腎細胞PC12，之后用乙醇刺激細胞，每毫克蛋白產生了59.4 mmol/L GSH，未預處理的細胞則每毫克蛋白產生29.9 mmol/L GSH(P<0.05)差異顯著。這表明，當受到氧化應激刺激時，乳清蛋白可以為細胞提供保護。PYO等[34]用WPC預處理人類肝細胞HepG2，之后用叔丁基過氧化氫刺激細胞，發(fā)現(xiàn)WPC預處理增加了未受刺激細胞的GSH水平，并將受刺激細胞的GSH水平恢復了80%。為了鑒定出乳清蛋白中增加GSH的具體片段OKEEFFE等[14]用3種酶水解的WPH處理人臍靜脈內皮細胞HUVEC，并監(jiān)控GSH水平，將水解產物用不同孔徑大小的膜進行分離。與未處理的細胞相比，用WPH處理細胞后，細胞內GSH水平顯著增加，其中枯草桿菌蛋白酶水解產物中的1 kDa組分使HUVEC細胞中GSH含量比未處理細胞提高了153%。

2.2.2 過氧化氫酶活性和過氧化物歧化酶活性

為了研究乳清蛋白是否能增加細胞中的CAT活性和SOD活性，XU等[35]用WPC80處理H2O2氧化誘導損傷的C2C12肌肉細胞發(fā)現(xiàn)WPC80可以使細胞CAT活性和SOD活性顯著提高，此外，還使未受H2O2刺激的細胞的SOD活性明顯提高。OKEEFFE等[14]用Corolase PP水解的WPH中1 kDa組分處理H2O2氧化誘導損傷的HUVEC細胞，與未處理的細胞相比，CAT活性增加了141%，差異極顯著。KONG等[36]用枯草桿菌蛋白酶水解的WPH處理H2O2氧化誘導損傷的肺成纖維細胞MRC-5后，細胞CAT活性從每毫克蛋白25 U增長到65 U，細胞SOD活性增加了248%。

PURPURA等[37]發(fā)現(xiàn)在攝入WPI后，血漿中氨基酸濃度最高，表明乳清蛋白在胃腸道中會快速被消化為游離氨基酸。POWER-GRANT等[38]對完整的WPC進行模擬胃腸消化，然后用ORAC測定其抗氧化活性。胃消化WPC后，其ORAC值較未消化WPC增加2.5倍。為了測定置于經胃消化后的乳清制品環(huán)境下的腸道細胞的抗氧化活性，PICCOLOMINI等[39]用胃消化的WPI處理H2O2氧化誘導損傷的腸上皮細胞Caco-2，與對照組相比，用胃消化的WPI處理后，Caco-2細胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)活性降低了32.5%。CORROCHANO等[40]對WPI進行模擬胃腸消化，并經Caco-2/HT-29細胞轉運，最終鑒定并合成了幾種乳清蛋白肽，其中肽ALPM, GDLE, VGIN和AVEGPK顯著降低了氧化誘導損傷細胞C2C12和HepG2的氧化水平。此外，JOUBRAN等[41]對α-乳白蛋白分別進行嬰兒胃腸模擬消化和成人胃腸模擬消化后發(fā)現(xiàn)，嬰兒十二指腸消化樣品比成人十二指腸消化樣品具有更高的抗氧化活性，但是成人的胃消化樣品抗氧化活性高于嬰兒時期。這說明乳清蛋白在腸道運輸過程中的抗氧化活性不僅受腸道位置的影響，還可能和年齡階段有關。

體外細胞培養(yǎng)法是將細胞直接置于乳清蛋白/肽中，但是乳清蛋白/肽通常是作為食物被攝入體內的，目標細胞只會暴露在從腸道進入血液的乳清成分中，在體外環(huán)境中具有抗氧化活性的乳清蛋白/肽在體內不一定能保持其活性，因此這類試驗的生物學意義還有待證實。

2.3 體內動物實驗法

乳清蛋白/肽能否在機體內部發(fā)揮活性，需要通過體內實驗驗證，也是活性評估中最重要的一環(huán)，但是到目前為止，只有少數(shù)研究使用人體或者動物的飲食干預試驗評估乳清蛋白/肽的有效性。雖然生物標志物是有限制的，但人體或動物的飲食干預試驗仍是目前最好的評估體內抗氧化作用的方法。

2.3.1 動物實驗

動物實驗一般采用不同的小鼠模型進行短期或長期的飲食干預實驗，通過比較飲食干預前后小鼠血液或組織中GSH、CAT水平評估乳清蛋白/肽的有效性。GOLD[42]給17～20月大的老年C7BL/6NIA雄性小鼠喂食富含WPC的食物3個月。之后測量小鼠肝臟和心臟的GSH水平。食用WPC的小鼠肝臟和心臟的GSH水平明顯高于同期食用富含酪蛋白的食物或對照食物的小鼠，這表明富含谷胱甘肽氨基酸前體(如Cys)的飲食可以促進細胞GSH的產生。ASHOUSH等[43]發(fā)現(xiàn)添加10 %乳清粉的食物可以保護Wistar大鼠抵抗CCl4肝毒性，他們認為這種抗性是由于血漿中GSH水平增加。KIM等[44]將Sprague-Dawley大鼠作為氧化應激模型，一組喂食富含鐵的食物，另一組在喂食同樣富含鐵的食物外，額外喂食10 %的乳清蛋白食物，持續(xù)6周，發(fā)現(xiàn)含有乳清蛋白食物組的大鼠紅細胞中GSH含量有所增加，但是CAT活性卻沒有顯著提高。而ATHIRA等[45]觀察到，接受枯草桿菌蛋白酶水解的WPH腹腔注射的瑞士白化小鼠的肝臟CAT水平與未接受WPH注射的小鼠相比顯著升高。HARAGUCHI等[46]還發(fā)現(xiàn)富含乳清蛋白的飲食似乎可以延長老年小鼠的生存時間。

2.3.2 人體實驗

人體飲食干預實驗可以更好地反映乳清蛋白/肽的有效性，目前的研究一般選擇特殊人群如持續(xù)高強度訓練的人群、超重人群或患病人群進行飲食干預實驗。MIDDLETON等[47]對18名接受高強度有氧訓練的男性參與者進行了6周以上的血液中GSH水平的評估，他們每天補充與體重對應比例的WPI。在進行運動的受試者中，血液中GSH水平明顯低于沒有進行運動的受試者。說明在運動方案中添加WPC可以防止血液中GSH的消耗。SHEIKHOLESLAMI等[48]觀察到，在30名體重超重的年輕男性中，服用WPI并進行8周的運動訓練后，血漿GSH水平增加。CHITAPANARUX等[49]發(fā)現(xiàn)，與補充WPI前相比，持續(xù)補充WPI 12周的肝病患者血漿中GSH水平也增加了23 %。而在ZAVORSKY等[50]進行的另一項人體試驗中，每天服用45 g WPI的受試者血液淋巴細胞的GSH水平比沒有服用WPI的受試者高24 %。

血漿中GSH水平是檢測乳清產品體內抗氧化作用最常用的指標之一。血漿低GSH水平與氧化應激誘發(fā)的疾病(如心血管疾病、多囊卵巢綜合征和自閉癥)之間存在正相關[51]。然而，血漿GSH水平不太可能反映經常暴露于氧化應激的靶器官(如肝臟、大腦或肌肉)細胞內的GSH水平。因此，記錄與疾病發(fā)生和發(fā)展有關的特定蛋白質的氧化水平，將在細胞檢測和飲食干預試驗中提供更多相關的生物標志物。

3 結論和展望

乳清和乳清蛋白具有抗氧化活性，并可通過酶解釋放生物活性肽提高活性。一些來源于β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的合成肽證明了抗氧化活性。乳清蛋白抗氧化的效果一般不如乳清蛋白源抗氧化肽，但是后者制備的成本比較高，因此如何工業(yè)化生產以及商業(yè)化應用也是目前亟待解決的問題。乳清蛋白/肽活性的測定方法有很多，但是并沒有統(tǒng)一的標準，使得不同研究者得到的結論缺乏可比性，應進一步制定一個相對統(tǒng)一的標準。乳清蛋白/肽體外活性的研究相對較多，而對于體內抗氧化機制的研究相對較少，應進一步進行動物實驗和臨床實驗等研究抗氧化肽的體內活性，并比較體內與體外活性之間的差異及相互聯(lián)系。最重要的是，抗氧化肽對人體產生有益作用的同時，也可能有一些副作用，這些副作用(細胞毒性、變態(tài)反應等)可能是抗氧化肽本身具有的，未來要進行更深層次的研究。