超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蠔油中3種甲基咪唑類物質(zhì)

張麗華，邵瑞婷，楊麗梅，姜潔

(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京，100094)

甲基咪唑類物質(zhì)是焦糖色素生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，焦糖色素作為重要的食品添加劑，廣泛應(yīng)用于食品加工生產(chǎn)中。國際技術(shù)焦糖色素協(xié)會(huì)(ITCA)根據(jù)生產(chǎn)過程中所采用的反應(yīng)劑而把焦糖色素分為四大類，對(duì)應(yīng)的生產(chǎn)工藝為普通法(Ⅰ類)、苛性硫酸鹽法(Ⅱ類)、氨法(Ⅲ類)和亞硫酸銨法(Ⅳ類)[1]。其中，Ⅲ類和Ⅳ類焦糖色素在制作過程中會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物4-甲基咪唑。國際癌癥機(jī)構(gòu)(IARC)將4-甲基咪唑列為2B類致癌物，即人類可能的致癌物[2]。相關(guān)研究表明，4-甲基咪唑具有類似吡啶、吡咯的毒性，抑制細(xì)胞色素P450同功酶，在人的肝臟中發(fā)生催化反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生許多低分子質(zhì)量致癌物，能誘發(fā)動(dòng)物驚厥還會(huì)導(dǎo)致甲狀腺腫瘤[3-5]；有致癌和白血病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。我國的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定Ⅲ類和Ⅳ類焦糖色素中4-甲基咪唑的含量不得高于200 mg/kg，同時(shí)對(duì)不同食品中焦糖色的含量進(jìn)行了限定[1,7]。2-甲基咪唑、N-甲基咪唑均為4-甲基咪唑的同分異構(gòu)體，目前，國內(nèi)外均未對(duì)這2種甲基咪唑類物質(zhì)進(jìn)行明確的限量規(guī)定。蠔油以牡蠣為原料，經(jīng)煮熟熬制濃縮而成，其含有豐富的蛋白質(zhì)，為餐飲中常用的鮮味調(diào)料。目前，對(duì)食品中甲基咪唑類物質(zhì)的檢測(cè)多見于醬油、醋、飲料等液體調(diào)料及食品中[8-10]，未有蠔油中相關(guān)檢測(cè)方法的報(bào)道；關(guān)注物質(zhì)以4-甲基咪唑[11-12]為主，2-甲基咪唑[13-15]也有涉及，未見對(duì)N-甲基咪唑的涉及。檢測(cè)方法主要有紫外可見分光光度法[16-18]、液相色譜法[19-20]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[21-23]、氣相色譜法[24-25]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[26-28]等。本文運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法實(shí)現(xiàn)蠔油中N-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基咪唑的同時(shí)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr. Ehrenstorfer Gmb H公司；N-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6、4-甲基咪唑-D6標(biāo)準(zhǔn)品，加拿大TRC公司；乙腈(色譜純)、乙酸銨(色譜純)，美國Thermo Fisher公司；甲醇(分析純)、甲酸(分析純)、正己烷(分析純)、乙腈(分析純)，國藥化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：精確稱取甲基咪唑類及其內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光、-18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別量取100 μLN-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于同一10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至10 mL，配制成濃度10 μg/mL的3種甲基咪唑混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別量取100 μLN-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6、4-甲基咪唑-D6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于同一10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至10 mL，配制成濃度10 μg/mL的3種甲基咪唑混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：用90%乙腈水(體積分?jǐn)?shù))逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成外標(biāo)濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度均為25 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC-Xevo TQD超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國沃特世公司；MULTIFUGE X1R高速冷凍離心機(jī)，美國賽默飛世爾公司；H·SWX-6008S電熱恒溫水溫箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；GM200型刀式研磨儀，德國萊馳公司；T18 均質(zhì)器，德國艾卡公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2.0 g蠔油樣品(精確到0.01 g)置于50 mL離心管中，加入50 μL濃度為1 μg/mL的3種甲基咪唑內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置20 min后，加入20 mL水，渦旋1 min使其混合充分后，置于恒溫水浴鍋中，70℃下水浴加熱10 min，靜置室溫后超聲提取20 min，并以10 000 r/min， 4 ℃下離心10 min，取上清液于一新的離心管中。吸取10 mL上清液過MCX固相萃取柱(6 cc，150 mg)(先用5 mL甲醇活化，再用5 mL水淋洗平衡)，依次用5 mL的2%甲酸水溶液，5 mL乙腈淋洗，1.5 mL正己烷淋洗2次，再用8 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，收集全部洗脫液，45℃氮吹至近干，精密加入乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(體積比9∶1)1 mL，渦旋30 s，過0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2 液相色譜方法

色譜柱：Agilent Poroshell 120 Hilic(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣量: 10 μL；流動(dòng)相：乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(體積比9∶1)；流速：0.4 mL/min；時(shí)間：5 min。

1.3.3 質(zhì)譜方法

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔氣流：氮?dú)?，流?0 L/h；脫溶劑氣流：氮?dú)?，流?50 L/h；碰撞氣：氬氣。其他質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

表1 三種甲基咪唑類物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式參數(shù)Table 1 The MRM parameters of three methylimidazoles and internal standards

注：*為定量離子。

在流動(dòng)相為5 mmol/L乙酸銨與乙腈混合液(體積比1∶9)，0.4 mL/min的流速下，比較了BEH HILIC、Poroshell 120 HILIC、Acclaim HILIC-10、Acclaim Mix-Mode HILIC-1四個(gè)型號(hào)色譜柱在分離3種甲基咪唑類化合物上的效果，結(jié)果如圖1所示。Acclaim HILIC-10無法實(shí)現(xiàn)4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的基線分離；Acclaim Mix-Mode HILIC-1可實(shí)現(xiàn)3種物質(zhì)的分離，但目標(biāo)物保留時(shí)間較長且前端雜質(zhì)峰明顯；BEH HILIC可將3種化合物基本分開，但基線分離效果不好；Poroshell 120 HILIC可達(dá)到較好的分離度。綜上，選擇Poroshell 120 HILIC作為色譜柱進(jìn)行條件的優(yōu)化。

a-Poroshell 120 HILIC;b-BEH HILIC； c-Acclaim HILIC-10;d-Acclaim Mix-Mode HILIC-1圖1 不同色譜柱對(duì)3種甲基咪唑類物質(zhì)的分離效果Fig.1 The separation results of three methylimidazoles by different columns

2.2 前處理過程優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇

比較了乙腈、水、2%甲酸水的提取效果，圖2為3種試劑提取甲基咪唑結(jié)果顯示，3種試劑均可將3種甲基咪唑類物質(zhì)提取出。但相較于2%甲酸水和水，乙腈對(duì)3種甲基咪唑類物質(zhì)的提取效率偏低；2%甲酸水和水的提取效率相當(dāng)，但以2%甲酸水為提取液時(shí)，凈化過程中的過柱速度較慢。因此在試驗(yàn)中選擇以水作為提取試劑。

圖2 不同提取試劑下3種甲基咪唑類物質(zhì)的提取效率Fig.2 The extraction results of three methylimidazolesby different extraction solutions

2.2.2 凈化方式的選擇

因甲基咪唑類化合物是強(qiáng)極性化合物，選擇陽離子交換固相萃取柱對(duì)其進(jìn)行分離。將加標(biāo)濃度均為30 μg/kg的蠔油樣品按上述過程提取，過MCX固相萃取柱，用2%甲酸淋洗后，分別以甲醇、乙腈、正己烷作為淋洗液對(duì)樣品做進(jìn)一步凈化。如圖3所示，甲醇作為淋洗液時(shí)，3種目標(biāo)化合物的分析譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液存在較大差異，保留時(shí)間均有明顯的偏移，且隨著分析樣品的增多，譜峰逐漸變寬，峰形變差，嚴(yán)重影響色譜柱的柱效。分析其原因，蠔油樣品中含有的動(dòng)物蛋白、油脂等成分，未能被甲醇去除。

a-經(jīng)甲醇凈化;b-標(biāo)準(zhǔn)溶液圖3 甲醇凈化對(duì)3種甲基咪唑類物質(zhì)的影響Fig.3 The result of the three methylimidazoles purifiedwith methanol

乙腈和正己烷分別作為淋洗試劑，均可有效地改善譜峰偏移及變寬的問題。表2所示為分別使用乙腈、正己烷，及同時(shí)依次使用乙腈、正己烷作為淋洗試劑時(shí)，3種甲基咪唑類化合物的回收率情況。蠔油中含有較為豐富的蛋白質(zhì)和動(dòng)物油脂，凈化時(shí)使用乙腈，可更好地除去附著在固相萃取柱中的蛋白質(zhì)；進(jìn)一步使用正己烷，可將其中的油脂類物質(zhì)去除，實(shí)現(xiàn)較好的凈化效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，二者的使用不會(huì)對(duì)已富集在固相萃取柱填料中的甲基咪唑類物質(zhì)產(chǎn)生影響。同時(shí)依次使用乙腈、正己烷作為淋洗試劑時(shí)，可使3種化合物回收率均在80%～120%，滿足方法學(xué)要求。

表2 不同淋洗液下3種甲基咪唑類化合物的回收率 單位：%

2.3 檢出限、定量限與線性范圍

分別配制質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的3種甲基咪唑類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，自動(dòng)進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。目標(biāo)物以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的峰面積為Y坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液質(zhì)量濃度為X坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。選取甲基咪唑本底含量相對(duì)較低的蠔油樣品，方法檢出限以加標(biāo)樣品檢測(cè)色譜峰信噪比RSN≥3確定，方法定量限以加標(biāo)樣品檢測(cè)色譜峰信噪比RSN≥10確定，因考慮到3種甲基咪唑類物質(zhì)的響應(yīng)不同，滿足上述信噪比要求時(shí)的最低濃度有所差異，為兼顧3種物質(zhì)同時(shí)便于實(shí)驗(yàn)操作，分別將檢出限及定量限進(jìn)行統(tǒng)一，具體結(jié)果詳見表3。結(jié)果表明，3種甲基咪唑類物質(zhì)在5.0～200.0 ng/mL的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)R2均大于0.996，能滿足定量分析的要求。方法對(duì)于3種甲基咪唑類物質(zhì)檢出限為5 μg/kg，定量限均為10 μg/kg。

表3 三種甲基咪唑類物質(zhì)線性范圍、回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges, linear equations and correlation coefficients of the three methylimidazoles

2.4 回收率及精密度

在蠔油樣品中分別添加低、中、高(10、20、100 μg/kg)3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次，標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線進(jìn)行校正，內(nèi)標(biāo)法定量，得到方法的回收率及精密度如表4所示。結(jié)果表明，3種甲基咪唑類物質(zhì)在3個(gè)加標(biāo)水平下，回收率在82.9%～113.1%，6次重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，滿足方法學(xué)要求。

2.5 實(shí)際樣品分析

用上述方法對(duì)北京市售16個(gè)蠔油樣本進(jìn)行了3種甲基咪唑類物質(zhì)的測(cè)定，結(jié)果顯示16個(gè)樣品均檢出4-甲基咪唑，檢出值為40～410 μg/kg，6個(gè)樣本檢出2-甲基咪唑，檢出值為11～26 μg/kg；7個(gè)樣品檢出N-甲基咪唑，檢出值為10～36 μg/kg。且2-甲基咪唑或N-甲基咪唑有檢出的樣本，其4-甲基咪唑檢出值偏高，均在100 μg/kg以上。16個(gè)蠔油樣品標(biāo)簽均顯示配料成分中含有焦糖色，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，焦糖色中4-甲基咪唑含量不得超過200 mg/kg，而對(duì)蠔油中焦糖色(加氨生產(chǎn))的使用量未有明確的限量要求。

表4 三種甲基咪唑類物質(zhì)在不同加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of the three methylimidazole at three levels

3 結(jié)論

本文建立了水提取，MCX固相萃取柱凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蠔油中N-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基咪唑的方法，3種物質(zhì)的定量限均為10 μg/kg，該方法良好解決了蠔油的凈化問題，建立了靈明度高、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高的方法，已在實(shí)際監(jiān)測(cè)中應(yīng)用。