水產(chǎn)品中氯霉素時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)方法

崔乃元，趙義良，馬立才，李云*

1(北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京，100095)2(石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，河北 石家莊，050041)

氯霉素(chloroamphenicol，CAP)是一種價(jià)格低廉且高效的廣譜抗生素，對(duì)多種有害細(xì)菌有較好的抑制作用，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。但氯霉素有較強(qiáng)的副作用和毒性，當(dāng)動(dòng)物源性食品隨著食物鏈被人體長(zhǎng)期攝入，可引發(fā)多種疾病[3-4]。為了保護(hù)消費(fèi)者健康，我國農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定氯霉素為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出[5-6]。

目前，水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測(cè)的主要方法有色譜方法、膠體金免疫層析法和ELISA等方法。色譜方法一般需要昂貴的檢測(cè)儀器，檢測(cè)成本高，不適合基層檢測(cè)。膠體金可以用于基層檢測(cè)但不能定量，ELISA則需要反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)。時(shí)間分辨免疫層析技術(shù)兼具了膠體金和ELISA的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物殘留的檢測(cè)當(dāng)中。時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是以鑭系元素(包括Eu、Tb、Sm、Dy等)作為標(biāo)記物，綜合免疫反應(yīng)的高特異性和鑭系元素標(biāo)記的高靈敏性相結(jié)合而建立的一種新型非放射性免疫檢測(cè)技術(shù)[7-9]。張藝等[10]利用直接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)牛奶中氯霉素的含量，測(cè)得該方法的靈敏度為0.01%，但在水產(chǎn)品中還沒有應(yīng)用此方法，由于水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，需要建立一種快速、靈敏度高的方法來檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素殘留。

本研究擬利用銪微球作為抗體標(biāo)記物建立一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏的魚、蝦和蟹中氯霉素殘留的熒光定量免疫層析檢測(cè)方法，并對(duì)所建立方法的靈敏度，準(zhǔn)確性和精密度等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期提供一種適用于水產(chǎn)品中氯霉素痕量殘留的快速檢測(cè)方法，保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全和消費(fèi)者健康。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；樣品粉碎機(jī)(九陽JYL-C090)，購自九陽公司；檢測(cè)卡恒溫孵育器(WH-400)和時(shí)間分辨熒光免疫定量分析儀(FQ-S2，365 nm/610 nm)，由維德維康生物技術(shù)有限公司研制。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈、K2HPO4、HCl、NaOH、吐溫20、乙酸乙酯和正己烷等，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白(BSA)，購自美國Amresco公司；200 nm羧基化銪微球(365/610 nm,λex/λem)，購自美國Creative Diagnostics公司；硝酸纖維素膜(NC膜)，購自美國Millipore公司；樣品墊、吸收墊、PVC底板，均購自上海良信科技有限公司。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma公司；儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取1.0 mg氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于-20 ℃保存，備用。

氯霉素單克隆體G375-5與羊抗鼠二抗，由北京維德維康生物技術(shù)有限公司制備。

泰心醫(yī)院一向關(guān)注小兒先心病的預(yù)防與治療，目前與國內(nèi)外多個(gè)慈善項(xiàng)目開展全方位合作，免費(fèi)為來自27個(gè)省區(qū)市、18個(gè)民族的11000多名孤、貧先心病兒童實(shí)施了先心病根治手術(shù)。醫(yī)院還與天津市婦兒保健中心合作，在國內(nèi)率先開展兒童先心病篩查工作，已篩查110余萬兒童，有手術(shù)指征的患兒得到了及時(shí)手術(shù)。

1.1.3 食品樣品

魚、蝦、蟹水產(chǎn)品，購自石家莊市的某超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光微球的抗體標(biāo)記

本研究采用200 nm羧基化時(shí)間分辨熒光微球，在抗體標(biāo)記方法[11]的基礎(chǔ)之上，進(jìn)行了優(yōu)化。具體標(biāo)記方法如下：(1)50 μL熒光微球中加入450 μL活化緩沖液(0.05 mol/L MES，pH 5.0)，超聲5 min；(2)然后，向微球溶液中依次加入EDC和NHS溶液使其終濃度為分別為0.1和0.2 mmol/L，室溫振蕩反應(yīng)30 min，15 000×g離心10 min，棄去上清液；(3)將沉淀用500μL偶聯(lián)緩沖液(0.04 mol/L PB，pH 8.0)復(fù)溶，超聲5 min，加入10 μL 2 mg/mL氯霉素單克隆抗體，室溫振蕩反應(yīng)2 h，15 000×g離心5 min；(4)向沉淀中加入500 μL封閉緩沖液(0.01 mol/L PB，2%BSA，pH 8.0)，4℃振蕩反應(yīng)過夜；(5)將反應(yīng)液以15 000×g離心5 min，棄去上清，加入1 mL的Tris-HCl(1% BSA，0.5% Tween-20，0.02% Proclin-300，pH 7.0)復(fù)溶沉淀，超聲5 min，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試紙條的組裝

用劃膜儀將氯霉素抗原(1.8 μg/mL，1∶6稀釋)和羊抗鼠IgG(17.5 μg/mL，1∶10稀釋)包被于NC膜上作為檢測(cè)線(T線，0.7 μL/cm)和質(zhì)控線(C線，0.7 μL/cm)，置于37℃烘箱中過夜干燥。將羧基化銪微球標(biāo)記的氯霉素單抗噴于釋放墊上，噴量為3.0 μL/cm，置于37℃烘箱中干燥2 h。然后，將樣品墊、釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘PVC底板上，并用切割機(jī)切成3.95mm寬度的試紙條。

1.2.3 樣本前處理

取魚、蝦、蟹可食用肌肉組織的樣本，稱取 3 g均質(zhì)后的樣品置于50 mL離心管中，加入 6 mL的乙酸乙酯，渦動(dòng)1 min，放到搖床上(300 r/min)振搖10 min。取出后離心(4 000×g)10min，取4 mL上層乙酸乙酯置于新的離心管中，50～60 ℃水浴條件下氮?dú)獯蹈?；向吹干的離心管中加入2 mL正己烷，充分渦動(dòng)10s，再加入1 mL 10 mmol/L PB(2% BSA，0.5% Tween-20，1%蔗糖)，低速渦動(dòng) 1 min后(4 000×g以上)，離心 5 min，完全棄去上層正己烷及中間層雜質(zhì)，取50 μL下層溶液進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 檢測(cè)步驟

取100 μL稀釋后的樣本提取液滴加至氯霉素免疫熒光層析裝置(圖1)中的樣本墊上，40℃檢測(cè)卡恒溫孵育器中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，取出并使用熒光免疫定量分析儀檢測(cè)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取魚、蝦、蟹陰性樣品各8份(每份不少于100g)，向其中添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液使其終濃度分別為：0.00，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80和1.60 μg/kg充分混勻后，按照1.2.3進(jìn)行樣本提取。然后，按照1.2.4進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，取平均值，以添加樣本中氯霉素的終濃度為X軸，檢測(cè)線T熒光信號(hào)值與質(zhì)控線C熒光信號(hào)值的比值(T/C)為Y軸，用Origin 8.0 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA)做非線性擬合分析，形成四參數(shù)擬合曲線如公式(1)所示：

(1)

1.2.6 最低檢測(cè)限

取經(jīng)儀器方法[12]確證為氯霉素陰性的魚、蝦、蟹樣品各20份，按照上述所建立的樣本前處理和氯霉素時(shí)間分辨熒光免疫層析方法進(jìn)行檢測(cè)。分別計(jì)算20份魚、蝦、蟹的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,平均值加上9倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為定量限。

1.2.7 準(zhǔn)確度和精密度

分別取均質(zhì)后的魚、蝦、蟹空白樣品各20份，分別加入氯霉素溶液，并使其終濃度為0.1、0.2、0.4和0.8 μg/kg，每個(gè)濃度梯度添加5個(gè)平行；分別按照1.2.3和1.2.4進(jìn)行樣本提取和檢測(cè)。最后，依據(jù)添加回收數(shù)據(jù)對(duì)所建立時(shí)間分辨熒光免疫層析定量分析方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行分析。

1.2.8 實(shí)際樣品與HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)

取魚、蝦、蟹樣品各10份，每份分別采用所建立的時(shí)間分辨熒光免疫層析定量分析法和GB/T 22338—2008《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》中液相色譜-質(zhì)譜方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過測(cè)試數(shù)據(jù)的擬合表明，所建立的氯霉素時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)魚、蝦和蟹樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)依次分別如公式(2)、(3)、(4)所示：

(2)

(3)

(4)

2.2 定量限

利用所建立的氯霉素時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)方法對(duì)魚、蝦和蟹真實(shí)樣本的測(cè)試數(shù)據(jù)如表1所示，依據(jù)20個(gè)樣本的所測(cè)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到該方法對(duì)魚、蝦和蟹樣本中氯霉素的定量檢測(cè)限依次分別為：0.084，0.096和0.091 μg/kg。為了避免假陽性的發(fā)生，將水產(chǎn)中定量限均定為0.1 μg/kg。

圖1 魚、蝦、蟹樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.1 Establishment of a standard curve for fish,shrimp and crab samples

表1 魚、蝦和蟹空白樣品的氯霉素測(cè)定結(jié)果 單位：μg/kg

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在魚、蝦、蟹樣本中依次添加LOQ、2LOQ、4LOQ、8LOQ的CAP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。確定免疫層析方法對(duì)添加了不同濃度氯霉素魚、蝦和蟹樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)。分析結(jié)果顯示，本文對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素的添加回收率為73.5%～114.2%，變異系數(shù)3.9%～11.5%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.4 與HPLC-MS/MS國標(biāo)方法對(duì)比

同時(shí)使用本研究所建立的時(shí)間分辨熒光免疫層析方法和國標(biāo)HPLC-MS/MS法對(duì)添加了0.1、0.2、0.4和0.8 μg/kg的魚、蝦、蟹樣本進(jìn)行了測(cè)定，其測(cè)試結(jié)果如圖2所示。上述兩種方法檢測(cè)結(jié)果的線性相關(guān)方程為：Y=0.02+1.07X，相關(guān)系數(shù)R2=0.973。由此可知，2種方法對(duì)魚、蝦和蟹中氯霉素檢測(cè)結(jié)果一致性較高。

3 討論

氯霉素是一種廣譜的抗菌藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌和陽性菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。鑒于其高效、廣譜的抗菌活性，氯霉素在水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治過程中發(fā)揮了重要作用[13-14]。氯霉素的水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的使用，可能會(huì)引起水產(chǎn)品中氯霉素殘留的產(chǎn)生。氯霉素可通過抑制骨髓造血機(jī)能而引起人類非劑量依懶性再生障礙性貧血。為了防止水產(chǎn)品中氯霉素的殘留危害消費(fèi)者健康，目前美國和歐共體已禁止在食用性動(dòng)物中使用氯霉素，并規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不得檢出；我國農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235 號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定氯霉素為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出。為了能夠更加簡(jiǎn)單、高效地對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素殘留進(jìn)行檢測(cè)，本研究建立了一種水產(chǎn)品氯霉素時(shí)間分辨熒光免疫層定量檢測(cè)方法。本研究使用鑭系元素銪(365 nm/610 nm,λex/λem)的羧基微球作為抗體標(biāo)記物建立免疫層析方法。銪元素具有較大的Stokes位移(>200 nm)，因此檢測(cè)過程中激發(fā)的信號(hào)不會(huì)對(duì)發(fā)射光的熒光信號(hào)造成干擾；另外，鑭系元素的熒光壽命相對(duì)比較長(zhǎng)，可達(dá)1～2 ms，故而可待其他熒光信號(hào)消失之后再行檢測(cè)，以達(dá)到降低背景信號(hào)干擾的目的。Stokes位移大和熒光壽命長(zhǎng)兩個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)極大地提高了時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的靈敏度。

表2 準(zhǔn)確性和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 單位：μg/kg

圖2 氯霉素時(shí)間分辨熒光免疫層析與HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of TRFIA and HPLC-MS/MS

同傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法相比，本研究所建立時(shí)間分辨熒光免疫層析方法具有更高的靈敏度，且可以對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素進(jìn)行定量檢測(cè)。ZHOU等[15]用膠體金免疫層析法檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素殘留物，檢測(cè)其檢測(cè)限為0.5 μg/kg。桑麗雅等[16]利用膠體金免疫層析技術(shù)研制了一種水產(chǎn)品(魚和蝦等)中氯霉素定性檢測(cè)方法，其檢測(cè)限為0.3 μg/kg。另外，張燕等[17]針對(duì)豬肉、雞肉和鱈魚樣本中氯霉素殘留優(yōu)化建立了滲濾式和側(cè)流式兩種膠體金標(biāo)記的免疫競(jìng)爭(zhēng)快速篩選方法，兩種方法的定性檢測(cè)限分別為0.8 μg/L和1 μg/L。本研究所建立的時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)方法的定量檢測(cè)限為0.1 μg/kg，顯著地低于膠體金的定性檢測(cè)限。

另外，本研究所建立的熒光免疫層析檢測(cè)方法基本達(dá)到了酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的靈敏度水平。PENG等[18]采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)魚肉中氯霉素的殘留量，其魚肉中的檢出限為0.126 μg/kg，回收率超過88.1%。ZHANG等[19]采用ELISA和GICA的方法檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量，測(cè)得檢出限為1.000 μg/kg。李曉云等[20]建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)氯霉素殘留的方法，對(duì)豬肉、雞肉和蜂蜜中氯霉素的檢測(cè)限達(dá)到0.1 μg/L，線性范圍0.1～100 μg/L，回收率61.0%～102.0%。薩仁托雅等[21]建立了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的酶聯(lián)免疫方法，結(jié)果顯示該方法的檢出限為0.05 μg/kg，線性范圍為0.05～4.05 μg/kg，回收率為85.3%～111.3%。相比于ELISA方法，熒光免疫層析的操作更為簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短(8～10 min)，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求相對(duì)較低；同時(shí)，簡(jiǎn)單的操作可以避免一些認(rèn)為實(shí)驗(yàn)誤差帶來的結(jié)果不準(zhǔn)確。

WU等[22]使用基于石墨烯的SPE結(jié)合HPLC-MS/MS測(cè)定水產(chǎn)品中的氯霉素，測(cè)定其線性范圍為0.510 0 ng/mL，回收率為92.3%至103.4%。吳明媛等[23]利用毛細(xì)管電子捕獲氣相色譜法測(cè)定魚肉中氯霉素的殘留量，該方法對(duì)魚肉中氯霉素的檢出限為0.1 μg/L，線性范圍為1.0～200 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)R2>0.996。上述儀器方法與本研究建立的時(shí)間分辨熒光免疫層析的靈敏度基本一致，但這些方法一般需要昂貴的大型儀器，技術(shù)要求和檢測(cè)成本高，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不適合大量的樣品檢測(cè)，而熒光免疫層析的方法操作簡(jiǎn)單易學(xué)，檢測(cè)成本低，易于上手。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)建立了一種水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速檢測(cè)方法。方法的檢測(cè)靈敏度(定量限0.1 μg/kg)優(yōu)于傳統(tǒng)的膠體金熒光免疫層析技術(shù)，達(dá)到了酶聯(lián)免疫吸附方法和儀器方法的靈敏度水平；該方法對(duì)水產(chǎn)品中氯霉素的添加回收率(73.5%～114.2%)和變異系數(shù)3.9%～11.5%均能滿足檢測(cè)要求，與國標(biāo)儀器檢測(cè)方法的符合率較高。因此，本研究建立的時(shí)間分辨熒光免疫層析方法在水產(chǎn)品氯霉素檢測(cè)工作具有較高應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。