桑椹貯藏年份與其中5-羥甲基糠醛含量的相關(guān)性分析

吳翠，徐靚，馬玉翠，巢志茂*

1(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)2(國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貯藏與包裝崗位，北京，100700)

桑椹(Mori Fructus，MF)，別名桑葚，為?？浦参锷orusalbaL.的干燥成熟果穗[1]，在2002年被原衛(wèi)生部列入《既是食品又是藥品的物品名單》，在食品和醫(yī)療方面均使用廣泛[2-13]。

色澤是藥材固有的性狀，對(duì)于評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量具有重要價(jià)值。通常，中藥材可以通過色澤的觀察進(jìn)行新貨或陳貨的判斷，也就是說可以根據(jù)色澤判斷出貯藏的年份，一般來說，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，藥材色澤會(huì)出現(xiàn)加深的現(xiàn)象[14-16]，5-羥甲基糖醛(5-HMF)的含量也顯著升高。5-HMF主要來源于焦糖化反應(yīng)和Maillard反應(yīng)。前者的反應(yīng)需要在140～170℃的高溫下發(fā)生，而后者的反應(yīng)在常溫下即可發(fā)生。中藥材在貯藏環(huán)節(jié)，通常是不接觸較高的溫度的，因此其中5-HMF應(yīng)該主要來源于Maillard反應(yīng)。同時(shí)，在中藥材較長(zhǎng)時(shí)間的貯藏過程中，隨著Maillard反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生，不斷累積了5-HMF，因此導(dǎo)致中藥材中5-HMF的含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。但是，桑椹在干燥后即呈現(xiàn)紫黑色的外觀，人們很難通過色澤判斷貯藏了多長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致桑椹在藥材市場(chǎng)中經(jīng)常出現(xiàn)新貨和陳貨混雜的現(xiàn)象。而對(duì)于桑椹來說，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為新貨的療效較好，陳貨的質(zhì)量欠佳。目前，尚未見人們對(duì)桑椹新貨與陳貨之間進(jìn)行過色澤、化學(xué)成分進(jìn)行比較的文獻(xiàn)報(bào)道。為此，參照山萸肉、五味子色澤與5-HMF具有顯著相關(guān)性的文獻(xiàn)報(bào)道，我們首次對(duì)桑椹進(jìn)行了5-HMF含量的測(cè)定，并指出了貯藏年份與其中5-HMF含量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑椹樣品于2017年12月收集于藥材市場(chǎng)、各地的藥店，其中4號(hào)樣品采收于北京西山，收集的樣品封裝在自封袋內(nèi)，放置于溫度為(16±0.5)℃，濕度為(40±5)%RH的恒溫恒濕箱中，經(jīng)某研究員鑒定為桑MorusalbaL.的干燥成熟果穗，詳見表1，于2018年3月取出，粉碎，粉末封裝于自封袋，放置于常溫條件的實(shí)驗(yàn)室中，于1個(gè)月內(nèi)完成全部實(shí)驗(yàn)工作，未作特殊保存;5-HMF對(duì)照品(純度≥99.09%)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；娃哈哈純凈水(電導(dǎo)率為2.22 μs/cm)，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)，購自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司，配有SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20A5型自動(dòng)脫氣機(jī)，LC-20AT型泵，SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器，CTD-10ASvp柱溫箱，LC-solution色譜工作站；NH310型三恩馳便攜式色差儀，三恩馳科技有限公司；Ohaus CP224C型電子天平(精度0.1 mg),奧豪斯(上海)儀器有限公司；XS105 Dual Range型電子分析天平(精度0.01 mg)，Mettler Toledo儀器系統(tǒng)有限公司；KC-02高速粉碎機(jī)，北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司；KQ-100E超聲波清洗器(100 W，40 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色澤觀察

取各樣品約50 g于高速粉碎機(jī)中，25 000 r/min粉碎約40 s，過四號(hào)篩，取適量樣品粉末置于白紙上，在日光下觀察色澤。

1.3.2 水分測(cè)定

取“1.3.1”項(xiàng)下粉末約2.0 g，精密稱定，按2015版《中國(guó)藥典》第四部通則0832項(xiàng)下第二法，即烘干法測(cè)定水分。

1.3.3 5-HMF含量測(cè)定

1.3.3.1 色譜條件

Dikma Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(體積比5∶95)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為284 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣10 μL。

1.3.3.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取5-HMF對(duì)照品19.85 mg，置于50 mL棕色量瓶中，加適量體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇使溶解，并逐漸加至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.397 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

1.3.3.3 供試品溶液的制備

取“1.3.1”項(xiàng)下粉末約1.0 g，精密稱定后置于25 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱重后超聲25 min(100 W，40 kHz)，取出放冷至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

1.3.3.4 方法學(xué)考察

參照文獻(xiàn)[17]方法對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，主要包括，線性關(guān)系考察、精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)并測(cè)定了檢測(cè)限和定量限。用50%甲醇稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，稀釋成濃度分別為0.116 6、0.291 4、1.457、1.985、2.914、3.97 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按“1.3.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定5-HMF峰面積，得出線性方程。將濃度為3.97 μg/mL的5-HMF對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，每次均為10 μL，測(cè)定5-HMF的峰面積，計(jì)算RSD。將18號(hào)供試品溶液室溫放置，在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定5-HMF的峰面積，計(jì)算RSD。取6份18號(hào)樣品粉末，制備供試品溶液后，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均含量和RSD。取6份18號(hào)樣品粉末，每份約0.5 g并精密稱定，精密加入濃度為0.039 7 mg/mL的5-HMF對(duì)照品溶液1.0 mL，制備供試品溶液后，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。將對(duì)照品儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋，分別進(jìn)樣測(cè)定，最終確定檢測(cè)限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。

1.3.3.5 樣品含量測(cè)定

按“1.3.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算干品中含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色澤和水分分析

色澤和水分測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 桑椹樣品信息、色澤、水分和5-HMF的含量Table 1 Samples information, color, and water and5-HMF contents of MF

注：“-”表示低于檢測(cè)限(2.914×10-4μg);*表示低于定量限(9.925×10-4μg)。

表1的結(jié)果顯示，全部18個(gè)桑椹樣品的色澤均較深，呈紫黑色，不同樣品之間的色澤相似，很難通過人眼判斷出樣品之間的差異。由表1可知，各樣品的水分含量變化較大，水分與色澤之間的相關(guān)性不明顯。其中，1號(hào)樣品的水分含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.35%，為所有樣品中最低；5號(hào)樣品水分含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.43%，為水分含量最高的樣品，超過了《中國(guó)藥典》中“水分不得過15%”的規(guī)定。各樣品水分含量差異明顯，可能原因:(1)干燥的方式和干燥后的水分含量有出入;(2)我們購置前該商品的貯藏環(huán)境中濕度的不同。

2.2 5-HMF含量分析

對(duì)照品與供試品的HPLC圖見圖1。由圖1可知，供試品色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處顯示色譜峰，且該色譜峰峰型獨(dú)立，說明該色譜條件下能夠有效檢測(cè)出供試品中的5-HMF。

圖1 對(duì)照品及桑椹供試品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of 5-HMF and MF

通過方法學(xué)考察，計(jì)算測(cè)定方法的線性方程為Y=8 234 771X-1 528(r2=0.999 2)，其中橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量(g)，縱坐標(biāo)為峰面積(mAU)，表明進(jìn)樣量在0.001 166～0.039 7 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD分別為0.78%和0.82%。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，18號(hào)供試品溶液的5-HMF的平均含量為0.084 23 mg/g，RSD為1.85%。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2，由表可知，平均回收率為98.92%，RSD為0.74%。檢測(cè)限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為2.914×10-4μg和9.925×10-4μg。以上結(jié)果均顯示，所建立的用于測(cè)定5-HMF含量的方法準(zhǔn)確可行。

表2 5-HMF的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery results of 5-HMF in MF

各樣品含量測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，各樣品中5-HMF的含量差異很大。在可以明確貯藏年份的樣品中，1～4號(hào)樣品為貯藏1年或2年的桑椹，含量低于檢測(cè)限(2.914×10-4μg)和定量限(9.925×10-4μg)。貯藏了3年的樣品，其中5-HMF的含量則相對(duì)較高，達(dá)到了3.180～23.64 μg/g。貯藏5年的2個(gè)樣品，5-HMF高達(dá)74.60和83.78 μg/g。該結(jié)果說明，隨著貯藏年份的延長(zhǎng)，桑椹中5-HMF的含量變化為從無到有，從少到多，與貯藏年份具有顯著的相關(guān)性。這種隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，5-HMF含量逐漸升高的現(xiàn)象與龍眼肉[13]、牛膝[14]等藥材一致。

5-HMF是葡萄糖、果糖等單糖發(fā)生Maillard反應(yīng)生成的一種醛類小分子化合物[18]，對(duì)H2O2引起的人體肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用(0.79 μmol/L)[19]，可抑制A375腫瘤細(xì)胞的增殖(4.8 mmol/L)[20]，但是高劑量的5-HMF(>75 mg/kg)對(duì)人眼部、上呼吸道、皮膚和黏膜具有刺激性[21]等毒性作用。目前關(guān)于5-HMF的藥理活性存在爭(zhēng)議，且5-HMF廣泛存在于烘焙、加熱的食品中，對(duì)于人體的副作用也存在爭(zhēng)議[22]。2015版《中國(guó)藥典》對(duì)甲硝唑、己酮可可堿等葡萄糖注射液中5-HMF的含量進(jìn)行了不得高于葡萄糖標(biāo)示量0.02%的規(guī)定。就桑椹來說，測(cè)定的最高含量為0.008%，低于0.02%。由于桑椹屬于藥食同源藥材，攝入過多也許會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在的副作用，但是具體的攝入量還有待進(jìn)一步研究。

Maillard反應(yīng)在常溫下即可發(fā)生，說明在桑椹的貯藏環(huán)節(jié)，發(fā)生了Maillard反應(yīng)，生成了5-HMF，造成了隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，桑椹中5-HMF含量顯著的升高現(xiàn)象。該現(xiàn)象提示我們應(yīng)該控制桑椹貯藏的年限，盡量采用新貨而不使用陳貨。陳貨中較高的5-HMF含量可以作為新貨與陳貨的判別依據(jù)。

3 結(jié)論

牛膝、山萸肉等藥材的色澤本身比較淺，隨著貯藏年份的延長(zhǎng)引起了色澤的加深，人眼可以觀察到色澤的明顯變化，貯藏年份與色澤、5-HMF含量之間均具有顯著的相關(guān)性。而對(duì)于色澤本身就很深的桑椹來說，人眼未能觀察到貯藏年份與色澤變化的相關(guān)性，但是通過測(cè)定5-HMF的含量可以說明其與貯藏年份具有顯著的相關(guān)性，表明由于發(fā)生Maillard反應(yīng)致使5-HMF含量的升高已不足以導(dǎo)致色澤的進(jìn)一步加深了。這種首次發(fā)現(xiàn)，對(duì)于色澤很深的一類中藥材具有示范性的研究?jī)r(jià)值。通過5-HMF含量的測(cè)定進(jìn)而推測(cè)桑椹的貯藏年份，對(duì)于制定桑椹的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、指導(dǎo)桑椹的貯藏具有重要的意義。