傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒中產(chǎn)香乳酸菌的分離鑒定

楊劍，卿煜維，鄧放明，潘金薇，李巧蕓，李娜，趙玲艷

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙，410128)

辣椒(CapsicumannuumL)，原產(chǎn)于拉丁美洲和北美而后傳入我國[1]。辣椒營養(yǎng)價值高，富含VC。辣椒的主要種植地主要集中在陜西、河北、河南等地區(qū)，但在我國南方吃辣椒的人較多，以著名的食辣大省湖南為例，湖南的辣椒產(chǎn)量約占全國5%，而消費(fèi)量已經(jīng)達(dá)到全國總量的10%[2]。剁辣椒是湖南發(fā)酵辣椒中一種頗具特色的傳統(tǒng)食品和調(diào)味品，是發(fā)酵辣椒制品的典型代表[3]，其特點(diǎn)是發(fā)酵菌種豐富，充分利用了微生物資源，產(chǎn)品風(fēng)味柔和、醬香味濃。但傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒發(fā)酵時間較長，發(fā)酵質(zhì)量不穩(wěn)定，存在亞硝酸鹽超標(biāo)的安全隱患[4]。通過選育優(yōu)良菌種，利用人工接種發(fā)酵可以有效的改善這一狀況，在保持傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒良好風(fēng)味的同時控制發(fā)酵，防止其他雜菌的生長[5]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵辣椒是將新鮮辣椒剁碎后加之一定量的食鹽攪拌均勻后，裝入殺菌處理后的泡菜壇封口發(fā)酵而成。辣椒表面附著的微生物利用其生成的代謝產(chǎn)物以及形成的低氧環(huán)境成為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌。同時乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的醇、醛、酮和有機(jī)酸等物質(zhì),賦予了發(fā)酵辣椒中特殊的乳酸發(fā)酵香味[2-5]。發(fā)酵辣椒中擔(dān)當(dāng)主要任務(wù)的微生物為乳酸菌，以辣椒本身帶有的乳酸菌在密閉的泡菜壇中快速繁殖發(fā)酵產(chǎn)生香味[6]。作者團(tuán)隊利用高通量測序及宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵辣椒中優(yōu)勢乳酸菌Lactobacillusplantarum、Weissellaparamesenteroides和Lactococcuslactis是線椒自然發(fā)酵過程中的3種關(guān)鍵微生物[7]。產(chǎn)香微生物的選育研究在其他發(fā)酵產(chǎn)品中較多[8-10]，產(chǎn)香酵母在釀酒香味的研究一直都是產(chǎn)香微生物的研究熱點(diǎn)[11-15]，但關(guān)于發(fā)酵辣椒中產(chǎn)香微生物的研究鮮有報道。

本研究主要是從湖南傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒中篩選出產(chǎn)香優(yōu)異的乳酸菌，進(jìn)行鑒定。研究菌種產(chǎn)香能力、耐酸、耐鹽、產(chǎn)酸等生理生化特性，為后期深入研究菌種產(chǎn)香機(jī)理和制備發(fā)酵性能優(yōu)異的發(fā)酵劑做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室自制發(fā)酵辣椒，市售發(fā)酵辣椒，農(nóng)家發(fā)酵辣椒。

MRS肉湯培養(yǎng)基，MC培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品，上海恒斐生物科技有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，TaKaRa公司；PCR引物，派森諾生物公司；API 50CH，法國生物梅里埃；其他均為國產(chǎn)分析純和化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

奧林巴斯顯微鏡(CX31RBSFA)，奧林巴斯有限公司；紫外/可見光分光光度計(UV-1801)，北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司；Haier超凈工作臺(HCB-1300V)，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)，奧斯特羅德分公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

從湖南各地區(qū)采集特色發(fā)酵辣椒，將樣品用100 mL已殺菌處理的離心管密封帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱保存等待菌種分離并記錄采樣時間、地點(diǎn)、溫度及樣品來源。

1.3.2 乳酸菌的分離與純化

將采集回的樣品取適量用0.9%生理鹽水做10倍梯度稀釋，均勻涂布MRS平板上，培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)各菌落的形態(tài)、顏色和濕潤程度等菌落特征判斷出不同的菌落，用接種針挑取外部特征不同的菌落到MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，接種環(huán)蘸取菌液于MC固體培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)24 h，挑取有溶鈣圈的菌落再次MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，為革蘭氏染色生理生化試驗(yàn)做準(zhǔn)備[16]。

1.3.3 產(chǎn)香乳酸菌的篩選

將分離純化保藏的菌株取出活化培養(yǎng)3代后，人工接種到減菌處理[17]后的辣椒汁中發(fā)酵7 d，每份樣品選取5位具有感官鑒評經(jīng)驗(yàn)的人員打分，鑒評標(biāo)準(zhǔn)參照表1。同時參考JI等[18]和高文睿等[19]用肌酸比色法測定發(fā)酵液中乙偶姻的含量，綜合兩者篩選出產(chǎn)香優(yōu)異的乳酸菌。

表1 剁椒感官質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)[20]Table 1 Sensory evaluation criteria of chopped hot pepper

1.3.4 乳酸菌的鑒定

將1.3.3篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，接觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)以及16S rDNA測序，用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，即為鑒定結(jié)果[21]。將測序得到的基因序列利用MEGA 5.05對所有序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，測序由上海桑尼生物科技有限公司提供。

1.3.5 乳酸菌生理生化試驗(yàn)

1.3.5.1 API試紙條試驗(yàn)

按照API試紙條使用手冊將活化后菌株接種到試紙中，無菌液體石蠟封口，37 ℃培養(yǎng)24 h后記錄結(jié)果于梅里埃官網(wǎng)系統(tǒng)比對結(jié)果[5]。

1.3.5.2 菌株生長曲線及產(chǎn)酸試驗(yàn)

將活化好的菌株調(diào)節(jié)菌懸液濃度調(diào)節(jié)為0.5的麥?zhǔn)媳葷峁?，接種1%到MRS液體培養(yǎng)基中，以空白培養(yǎng)基作為空白，每2 h測定OD600值，同時測定發(fā)酵液pH，每份樣品做3份平行，測定3次。

1.3.5.3 菌株耐酸試驗(yàn)

將活化好菌株接種按照1.3.5.2接種方法接種到pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0的液體培養(yǎng)基中，以未接種培養(yǎng)基作為空白，每隔12 h測定OD600值，每組做3次平行。

1.3.5.4 菌株耐鹽試驗(yàn)

菌種活化好后，接種1%到分別含有60、80、100、120 g/L NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每隔12 h以未接種培養(yǎng)基作為空白測定OD600值，每組做3次平行。

1.3.5.5 菌株耐膽鹽試驗(yàn)

菌種活化好后，接種1%到分別含有3、5、7、10 g/L牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，以未接種培養(yǎng)基作為空白，每隔12 h測定OD600值，每組做3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香乳酸菌篩選結(jié)果

乙偶姻是發(fā)酵辣椒中一種重要的羰基化合物香味物質(zhì)[4]，研究也表明乙偶姻與雙乙酰、乙醛、丙酮酸、丁二酮等風(fēng)味物質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)，因此這一指標(biāo)的測定也在一定程度上反映了其他風(fēng)味物質(zhì)的代謝與積累[22-23]。在堿性條件下3-羥基丁酮與含胍基的化合物反應(yīng)生成紅色化合物，甲萘酚的存在可以促進(jìn)并加速紅色物質(zhì)生成，該化合物在500～600 nm有光吸收，其吸光度在一定濃度范圍內(nèi)與3-羥基丁酮濃度成正比[23]。從86份發(fā)酵辣椒樣品中分離純化，經(jīng)革蘭氏染色陽性，接觸酶陰性且有溶鈣圈，初步鑒定為乳酸菌菌株486株，用于后續(xù)篩選試驗(yàn)。將486株菌種進(jìn)行初步感官鑒評試驗(yàn)，篩除感官評定較差，產(chǎn)異味、不生長發(fā)酵菌株，選取乙偶姻產(chǎn)量最高25株菌，其乙偶姻測定結(jié)果見圖1。

圖1 25株菌種乙偶姻測定值Fig.1 25 strains of acetoin measured value

將分離純化的菌株按照1.3.3方法篩選，選出了綜合產(chǎn)香優(yōu)異，編號為H3D、6d-16、6-12，其感官評分及乙偶姻測定值結(jié)果見圖2。3株菌株人工接種發(fā)酵辣椒感官評分均在93分以上，其24 h發(fā)酵液中乙偶姻濃度分別為37.737、53.160、26.716 mg/L。ZHAO等[24]在西藏靈菇中篩選出4株產(chǎn)香乳酸菌乙偶姻產(chǎn)量最高為43.72 mg/L，田懷香等[8]篩選1株產(chǎn)香乳酸菌，其乙偶姻產(chǎn)量為38.92 mg/L，楊銘等[25]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)6個與乙偶姻有關(guān)基因，其菌株產(chǎn)乙偶姻為8.92 μg/mL。H3D、6d-16、6-12 三株菌乙偶姻產(chǎn)量最高為53.160 mg/L較之同類乳酸菌乙偶姻產(chǎn)量更高，具備高產(chǎn)香能力可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 單菌株發(fā)酵感官評分及乙偶姻測定值Fig.2 Single strain fermentation sensory score and acetoin value

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌種形態(tài)檢測

將2.1中篩選的菌株，進(jìn)行革蘭氏染色顯微鏡觀察菌種形態(tài)，其形態(tài)學(xué)特征見圖3。由圖3可見，3株菌種菌落形態(tài)皆為圓形光滑，凸起，邊緣整齊不透明。革蘭氏染色皆為陽性，1 000倍鏡頭下，6-12菌種菌體形態(tài)為球狀，H3D與6d-16菌體形態(tài)為成對桿狀。

a- 6-12;b- H3D;c-6d-16圖3 菌株菌落及菌體形態(tài)Fig.3 Strains of colonies and cell morphology

2.2.2 16S rDNA測序結(jié)果

測序完成后將測序結(jié)果，用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對。6-12與Pediococcuspentosaceus的同源性為99%初步鑒定為戊糖片球菌，H3D與Lactobacillusplantarum同源性為99%初步鑒定為植物乳桿菌，6d-16與Lactobacilluspentosus同源性為100%初步鑒定為戊糖乳桿菌。將測序得到的基因序列利用MEGA 5.05對所有序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Strain phylogenetic tree

2.2.3 API試紙條試驗(yàn)結(jié)果

由于H3D植物乳桿菌與6d-16戊糖乳桿菌兩者親緣關(guān)系較近，利用API試紙條可以通過碳源發(fā)酵產(chǎn)酸將其進(jìn)一步區(qū)分。API試紙條結(jié)果見表2，在法國梅里埃公司官網(wǎng)利用API LABPlus自動判讀系統(tǒng)對其進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為：H3D為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，6d-16為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。

2.3 菌株生長曲線及產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果

活化后的菌株按1.3.5.2培養(yǎng)后，其生長曲線及產(chǎn)酸測定結(jié)果見圖5。由圖可見，3株菌均在2～4 h后進(jìn)入生長對數(shù)期，12 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，H3D與6d-16生長曲線幾乎同步，較強(qiáng)于6-12。37℃培養(yǎng)24 h，菌種H3D OD600達(dá)到2.16 9，菌種6d-16 OD600達(dá)到2.175，菌種6-12 OD600為2.050。同時也可看出菌株產(chǎn)酸與生長同步，在4～12 h時pH快速下降。37 ℃培養(yǎng)24 h，H3D最終pH為3.44，6d-16 pH為3.63，6-12 pH為4.0。生長產(chǎn)酸速度對菌株今后作為辣椒發(fā)酵人工接種菌株也較為重要，3株菌在2 h后便開始進(jìn)入生長對數(shù)期，同時開始大量產(chǎn)酸，奠定了初期發(fā)酵辣椒中優(yōu)勢地位，抑制其他雜菌的生長，保證了發(fā)酵辣椒的質(zhì)量。

表2 API試紙條試驗(yàn)結(jié)果Table 2 API test strip test results

注：“+”表陽性;“-”表陰性。

圖5 菌株生長曲線及pH測定Fig.5 Strain growth curve and pH determination

2.4 菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

生理生化試驗(yàn)中，3株菌株在過氧化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)中結(jié)果均為陰性，符合乳酸菌的生理生化特征。

表3 菌種生理生化試驗(yàn)Table 1 Physiological and biochemical test of strains

注： “+”表陽性；“-”表陰性。

2.5 菌株對不同pH、鹽濃度及膽鹽濃度適應(yīng)性

為了進(jìn)一步了解菌株的特性，對3株菌種耐酸、耐鹽、耐膽鹽進(jìn)行測定，為后期應(yīng)用到發(fā)酵辣椒產(chǎn)品制備做準(zhǔn)備。在耐酸試驗(yàn)中，由圖6可見，H3D耐受較強(qiáng)，在pH 2.0時也具備一定耐受性，在pH 3.0中H3D和6d-16都能較好的生長繁殖，pH 3.5中基本對H3D與6d-16無影響，6-12在pH 3.5中具有一定耐受性。

圖6 不同pH值下菌株生長情況Fig.6 The OD value of strain under different pH values

在耐鹽試驗(yàn)中，如圖7所示，60 g/L NaCl對3株菌株生長幾乎無影響，菌株H3D與6d-16在120 g/L NaCl中具備一定耐受性，這對于后期作為人工接種發(fā)酵菌株可作為參考，一般發(fā)酵辣椒的制作含鹽量在60～80 g/L[26]。

圖7 不同鹽濃度下菌株生長情況Fig.7 The OD value of strains under different salt concentrations

膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)中，由圖8可見3 g/L的膽鹽對3株菌對其生長影響不大，菌株H3D與6d-16在5 g/L的膽鹽中也具備一定耐受性，這一特性有利于菌株作為益生菌作用，保證了其在小腸膽鹽濃度下還可以存活，人體小腸膽鹽濃度在0.003 ～0.03 g/L[27]。3株菌種對酸、NaCl、膽鹽均具備一定的耐受性，其中H3D與6d-16表現(xiàn)較為優(yōu)異，這也保證了將來應(yīng)用到發(fā)酵辣椒中的存活率。

圖8 不同膽鹽濃度下菌株生長情況Fig.8 The OD value of strains under different bile salt concentrations

3 結(jié)論

本研究從86份傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒中分離純化得到486株乳酸菌，以接種發(fā)酵辣椒感官評分值與發(fā)酵液中乙偶姻測定值為篩選指標(biāo)，篩選出了3株產(chǎn)香優(yōu)異的乳酸菌，編號為H3D、6d-16、6-12。其感官評分均在93分以上，3株菌種24 h發(fā)酵液乙偶姻測定值分別為37.737、53.160、26.716 mg/L。

根據(jù)3株菌種的菌落、菌體形態(tài)，16S rDNA鑒定，H3D為植物乳桿菌，6d-16為戊糖乳桿菌，6-12為戊糖片球菌。由于H3D植物乳桿菌，6d-16戊糖乳桿菌，兩者親緣關(guān)系較近，進(jìn)一步利用API試紙對其進(jìn)行碳源產(chǎn)酸試驗(yàn)，最終確定H3D為植物乳桿菌，6d-16為戊糖乳桿菌。3株菌株生長繁殖、產(chǎn)酸速度快，在耐酸、耐鹽、耐膽鹽試驗(yàn)中均有一定的耐受性，具備良好的生理生化特性適合作為發(fā)酵劑制備菌株。

現(xiàn)在大多數(shù)工廠為延長辣椒原料貯藏期，常采用鹽胚脫鹽發(fā)酵法，其加工工藝簡單且成本低廉，但風(fēng)味、滋味和營養(yǎng)物質(zhì)在較長的貯存期和水洗脫鹽過程中損失嚴(yán)重[28]。人工接種發(fā)酵可以很好控制產(chǎn)品質(zhì)量，從而保證發(fā)酵風(fēng)味，以期最大程度達(dá)到傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒的良好風(fēng)味。3株菌種來源于傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒，具備優(yōu)異產(chǎn)香特質(zhì)，作為制作發(fā)酵辣椒發(fā)酵劑的制備具有發(fā)展前景，同時對于后期深入研究菌株產(chǎn)香機(jī)理也奠定了研究基礎(chǔ)。