酶法轉(zhuǎn)化精氨酸生產(chǎn)胍基丁胺

張言慧，吉武科，高愛(ài)存，孫博通，袁建國(guó)*

1(山東國(guó)力生物技術(shù)研究院，山東 濟(jì)南，250101)2(山東國(guó)力生物科技有限公司，山東 濟(jì)南，250014)

胍基丁胺(agmatine)作為一種重要的生物胺，具有很大的生理功能和醫(yī)藥價(jià)值。1994年LI等認(rèn)為CDS物質(zhì)便是胍基丁胺[1]，從此對(duì)該物質(zhì)的研究逐漸增多。胍基丁胺由精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase,ADC)催化底物精氨酸脫羧產(chǎn)生[2]。血液中胍基丁胺的質(zhì)量濃度為0.2～0.4 ng/mL，胍基丁胺在體內(nèi)幾乎分布于所有的器官[3]，在亞細(xì)胞水平上，胍基丁胺存在于距內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體很近的大密度核心囊泡中[4]。胍基丁胺能抑制細(xì)胞內(nèi)多胺的合成，促進(jìn)多胺的降解，從而降低細(xì)胞內(nèi)多胺的水平[5]；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，胍基丁胺可作為一種抗抑郁的藥物，減緩耐藥性的發(fā)生和改善急性嗎啡停藥綜合征[6]；此外，胍基丁胺還能促進(jìn)記憶的鞏固[7]；胍基丁胺能抑制多種細(xì)胞的增殖(包括肝癌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等)[8-9]。在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外需求巨大，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。

目前我國(guó)胍基丁胺的制備主要來(lái)自化學(xué)方法，化學(xué)法合成胍基丁胺步驟繁瑣、效率低、污染重。利用生物法合成胍基丁胺因具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)速率快、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的關(guān)注。AKASAKA等[10]利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胍基丁胺，產(chǎn)量只有8.3 mmol/L，ZHANG等[11]利用固定化基因重組大腸桿菌催化精氨酸合成胍基丁胺，其產(chǎn)量可以達(dá)到20 g/L；SUN等[12]利用基因重組大腸桿菌表達(dá)ADC，然后利用該酶催化精氨酸反應(yīng)，使得胍基丁胺的產(chǎn)量提高到69.22 g/L。本文應(yīng)用構(gòu)建的1株基因工程菌發(fā)酵表達(dá)ADC，通過(guò)在搖瓶上對(duì)最基本的發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)化pH、輔酶加量及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，ADC酶活水平得到提高。15L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，胍基丁胺產(chǎn)量明顯提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

含有pET-28a(+)質(zhì)粒的重組大腸桿菌K12(EscherichiacoliK12,E.coliK12)，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏，革蘭氏陰性菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。pH自然，121 ℃高溫滅菌20min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油10(單消)，蛋白胨12，酵母粉8，Na2HPO4·12H2O 15，K2HPO4·3H2O 10，KH2PO43，檸檬酸2，NH4Cl 1，MgSO40.5，NaCl 0.5，檸檬酸鐵銨0.3，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油7(單消)，蛋白胨15，酵母粉5，Na2HPO4·12H2O 18，K2HPO4·3H2O 13，KH2PO45，NaCl 1，MgSO41。pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)方法

1.2.1.1 菌體濃度[13]

取一定量的發(fā)酵液用純化水稀釋一定的倍數(shù)，用UV-1200分光光度計(jì)在600 nm下測(cè)定其吸光值OD600。取一定體積發(fā)酵液離心去上清并烘干至恒重得菌體干重(dry cell weight,DCW)。

1.2.1.2 胍基丁胺

胍基丁胺含量使用島津LC-20AT高效液相色譜儀測(cè)定，色譜柱為Inertsil ODS-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流動(dòng)相為0.03 mol/L NaH2PO4，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；分析時(shí)間為20 min。

1.2.1.3 酶活[14]

酶活檢測(cè)反應(yīng)體系組成為：4 mL 0.2 mol/L的KH2PO4緩沖液，200 μLL-Arg母液(125 g/L)，200 μL磷酸吡哆醛(phosphopyridoxal,PLP)母液(4.13 g/L)，200 μL MgSO4母液(25 g/L)?；旌虾笾?7 ℃水浴鍋中預(yù)熱15 min，再加入200 μL粗酶懸液反應(yīng)5 min，離心取上清，檢測(cè)胍基丁胺濃度計(jì)算酶活。

1.2.2 重組菌構(gòu)建

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Escherichiacoli的基因組，以其為模板，PCR擴(kuò)增精氨酸脫羧酶基因。所用脫精氨酸羧基之基因乃adiA非speA[15]，載體pet-28a(+)。所用引物如下：

正向引物F：5′-CGGGATCCCGTACTTTCATAATTAACAAC-3′；反向引物R：5′-CGAGCTCGAATGCGA-AAGTGCGTGTATTG-3′。

PCR反應(yīng)體系和條件如下：

(1)PCR擴(kuò)增體系：DNA聚合酶 25 μL；正向引物 2.0 μL；反向引物 2.0 μL；模板DNA 2.0 μL；dd H2O 19 μL。

(2)PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性：95℃，3min；變性：95℃，15s；退火：55℃，15s；延伸：72℃，15 s；循環(huán)30次；延伸：72℃，10min；4℃保存。

載體與脫羧基基因所連接處，用BamHI與SacI限制性內(nèi)切酶處理6 h，用T4DNA連接酶將二者于16℃條件下過(guò)夜連接。然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)E.coliK12細(xì)胞中，隨之將其涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落，由通用生物進(jìn)行基因序列的測(cè)定以驗(yàn)證其正確性，從而獲得正確構(gòu)建的工程菌株。

1.2.3 搖瓶試驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)與誘導(dǎo)

甘油管保藏菌接種于平板進(jìn)行活化，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。從平板挑取一環(huán)菌苔入搖瓶種子培養(yǎng)基中(50 mL/250 mL錐形瓶)，37 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床中培養(yǎng)16 h得到種子培養(yǎng)液，以3%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(50 mL/500 mL錐形瓶)，同時(shí)添加體積分?jǐn)?shù)為50%的甘油，在37 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床中培養(yǎng)6 h，再加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG開(kāi)始誘導(dǎo)，并補(bǔ)加甘油，30 ℃培養(yǎng)16 h后結(jié)束發(fā)酵。

1.2.3.2 酶轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化體系組成為100 g/LL-Arg，8 g/L輔酶PLP，5 g/L MgSO4。轉(zhuǎn)化溫度37℃，轉(zhuǎn)化pH 5.0，轉(zhuǎn)化時(shí)間：5 h。

1.2.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

利用SAS JMP軟件對(duì)重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基各成分(A-甘油、B-蛋白胨、C-酵母粉、D-Na2HPO4、E-K2HPO4、F-KH2PO4、G-NaCl、H-NH4Cl、I檸檬酸、J-檸檬酸鐵銨、K-MgSO4)進(jìn)行定制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)選取11因素2水平進(jìn)行。

1.2.4 放大實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 發(fā)酵

采用上海保興BIOTECH 15L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵[16]，當(dāng)罐內(nèi)底料中碳源與氮源耗盡后，開(kāi)始流加甘油與氨水，流加速率vC、vN見(jiàn)圖1。

圖1 甘油與氨水流加曲線Fig.1 The flow curve of glycerol and ammonia

1.2.4.2 酶轉(zhuǎn)化

發(fā)酵結(jié)束后用50 nm陶瓷膜對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行濃縮和洗滌，收集菌體濃縮液，并加入L-Arg、PLP及MgSO4，然后加水定容至原發(fā)酵液體積，制得轉(zhuǎn)化液，稀H2SO4調(diào)節(jié)pH至5.0開(kāi)始反應(yīng)，反應(yīng)期間補(bǔ)加L-Arg以提高產(chǎn)物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 ADC發(fā)酵誘導(dǎo)溫度的選擇[17]

為了確定重組E.coliK12發(fā)酵的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度，本文在搖瓶培養(yǎng)條件下考察了4種不同溫度對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)和酶活的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，所用發(fā)酵培養(yǎng)基為1.1.2中的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)之前的培養(yǎng)方法見(jiàn)1.2.3.1。

圖2 不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對(duì)生物量和酶活的影響Fig.2 The effect of different temperature to the biomass and enzyme activity

由圖2可知，不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度，對(duì)菌體生長(zhǎng)和ADC的活性大小有一定影響，30 ℃為最適誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度，此溫度有利于酶蛋白形成正確的空間構(gòu)象，提高了酶活；25 ℃時(shí)酶活與OD600值均低，這是因?yàn)榈蜏叵聟⑴c重組蛋白表達(dá)的各種酶的活性有所降低，減緩了ADC的表達(dá)速率，低溫不利于菌體生長(zhǎng)，使得產(chǎn)生酶蛋白的數(shù)量不足而影響酶活。37 ℃對(duì)OD600值影響雖然較小，但對(duì)重組蛋白表達(dá)速率影響較大，因而酶活較低。

2.2 不同pH條件下ADC對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響

轉(zhuǎn)化時(shí)pH控制在5個(gè)范圍(如圖3所示)。由于胍基丁胺是精氨酸在ADC催化下脫掉羧基生成的，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，轉(zhuǎn)化體系的pH會(huì)隨之升高，需要不斷調(diào)節(jié)pH以維持酶的高轉(zhuǎn)化活性。反應(yīng)結(jié)束后檢測(cè)胍基丁胺與精氨酸濃度計(jì)算出酶活與轉(zhuǎn)化率。由圖3可以看出pH控制在5.0時(shí)胍基丁胺濃度最高，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率也最高。

圖3 不同酸堿性條件對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響Fig.3 The effect of acid-base condition to the conversion

2.3 重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表1，根據(jù)結(jié)果篩選出影響ADC活性的顯著性因素，得到酶活的預(yù)測(cè)表達(dá)式。從表1中可以看出,在誤差允許范圍內(nèi)，酶活實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值是相符的。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 The design of experiment and response values

回歸參數(shù)及效應(yīng)檢驗(yàn)見(jiàn)表2，在P值為0.1的條件下進(jìn)行參數(shù)分析，結(jié)果表明，因素K、I、C、E是顯著性影響因子，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)ADC的活性影響最大[18]。通過(guò)影響因素篩選，得到以ADC活性Y為響應(yīng)值的回歸方程：

該模型的R2=0.997，一般認(rèn)為，R2至少應(yīng)該為0.80[19]，說(shuō)明實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性很好。在表1高低水平之間，將Y最大化，得到最優(yōu)培養(yǎng)基(g/L)：甘油7，蛋白胨15，酵母粉5，Na2HPO4·12H2O 18，K2HPO4·3H2O 13，KH2PO45，NaCl 1，MgSO41。

2.4 最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基驗(yàn)證

將上述優(yōu)化培養(yǎng)基與表1中的4號(hào)、11號(hào)培養(yǎng)基和初始培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)[20]，結(jié)果顯示最優(yōu)培養(yǎng)基酶活達(dá)到3 552.99 IU，是優(yōu)化前的2.23倍(圖4)。

表2 回歸參數(shù)及效應(yīng)檢驗(yàn)Table 2 Regression parameter and effect test

圖4 不同培養(yǎng)基的酶活水平Fig.4 The enzyme activity of different medium

2.5 PLP濃度對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的影響

選取了6個(gè)梯度對(duì)輔酶PLP的用量進(jìn)行優(yōu)化(見(jiàn)圖5)。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)將PLP的用量由原來(lái)的8 g/L減少至1 g/L，仍可以達(dá)到相同的轉(zhuǎn)化效果。當(dāng)PLP的質(zhì)量濃度降至1g/L以下時(shí)胍基丁胺的濃度明顯降低，即輔酶質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)ADC與PLP的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)飽和，無(wú)需再增加輔酶用量。

圖5 PLP濃度對(duì)轉(zhuǎn)化液中胍基丁胺產(chǎn)量的影響Fig.5 The effect of PLP on the amount of agmatine in conversion liguid

2.6 重組菌發(fā)酵與胍基丁胺轉(zhuǎn)化放大實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵過(guò)程中隨著碳源的消耗會(huì)產(chǎn)生大量的CO2及有機(jī)酸，這時(shí)發(fā)酵液的pH值會(huì)降低，從而帶動(dòng)了氮源的補(bǔ)入及消耗，維持了菌體生長(zhǎng)及目的蛋白表達(dá)所需的碳氮比。由圖6可知，發(fā)酵過(guò)程中隨著菌體的生長(zhǎng)，溶氧逐漸降低，當(dāng)溶氧降低至20%以下時(shí)，體系pH急速下降，重組蛋白表達(dá)停止，這是由于菌體產(chǎn)生的大量乙酸產(chǎn)生抑制作用造成[21]。當(dāng)溶氧穩(wěn)定在20%的水平時(shí)，抑制作用解除，菌體恢復(fù)正常。當(dāng)菌體干重達(dá)到5.68 g/L時(shí)，將37 ℃培養(yǎng)溫度降為30 ℃誘導(dǎo)溫度，并加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

由圖6可知，發(fā)酵時(shí)間5～8 h，μ(比生長(zhǎng)速率)開(kāi)始回升，vX(生長(zhǎng)速率)達(dá)到整個(gè)發(fā)酵周期的最大值，表明此時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。至24 h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，DCW為33.44 g/L，菌體的vX維持在1 g/(L·h)左右，表明該重組菌具有高密度培養(yǎng)的潛力。

圖6 發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)曲線Fig.6 The curve of bacterial growth during fermentation

經(jīng)檢測(cè)最終轉(zhuǎn)化液中胍基丁胺的濃度為279.21 g/L，精氨酸轉(zhuǎn)化率98%(胍基丁胺HPLC檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖7)。為下一步濃縮結(jié)晶工藝奠定了基礎(chǔ)。

圖7 胍基丁胺HPLC檢測(cè)圖譜Fig.7 The detection chromatogram of agmatine

3 結(jié)論

本研究以重組E.coli發(fā)酵表達(dá)ADC，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，確定了該酶在30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)優(yōu)于在其他溫度條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)表達(dá)效果，該酶的最適pH在弱酸性范圍內(nèi)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基ADC活性是優(yōu)化前的2.23倍。PLP價(jià)格較貴，經(jīng)優(yōu)化后用量減少數(shù)倍，可使生產(chǎn)成本明顯降低。發(fā)酵與轉(zhuǎn)化放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最終胍基丁胺質(zhì)量濃度為279.21 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了98%，相較資料報(bào)道達(dá)到了較高水平。該研究結(jié)果對(duì)于酶法制備胍基丁胺的產(chǎn)業(yè)化具有重要指導(dǎo)作用。