釀酒專用糧基地釀酒玉米生長過程穩(wěn)定同位素研究

張倩，謝正敏*，安明哲，魏金萍，葉華夏，黃箭

1(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)2(中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實驗室，四川 宜賓，644000)

釀酒原料的品質(zhì)是白酒品質(zhì)的基礎(chǔ)，對白酒原料的控制直接影響到白酒成品的最終品質(zhì)。釀酒生產(chǎn)通過長期經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蒯劸圃掀贩N釀造的白酒具有獨(dú)特的風(fēng)味組成，使白酒成品截然不同于其他品牌產(chǎn)品。白酒公司通過建立“釀酒專用糧”種植基地對釀酒原料進(jìn)行規(guī)?；y(tǒng)一種植，以加強(qiáng)對白酒原料的控制來提升保證公司白酒產(chǎn)品的品質(zhì)[1]。玉米既是世界上人類栽種的重要糧飼兼用作物之一，也是五糧濃香型白酒的重要原料之一。研究者們對影響玉米生長、產(chǎn)量、品質(zhì)的多方面因素都進(jìn)行了深入研究[2-7]，但對釀酒專用玉米生長過程各部位碳、氮穩(wěn)定同位素特征的研究卻少有全面提及。分餾是穩(wěn)定同位素的自然屬性，同一植物不同生長時期不同部位之間的穩(wěn)定同位素特征也會存在一定差異。近年來，隨著穩(wěn)定同位素技術(shù)的快速發(fā)展，該技術(shù)在各種植物不同部位的穩(wěn)定同位素特征、植物是否有機(jī)種植等研究領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[8-13]。而在玉米上，以往利用該技術(shù)的研究多只提到玉米某生長階段一部分組織的穩(wěn)定同位素特征[14-16]。本文利用該技術(shù)對“釀酒專用糧”種植基地釀酒玉米進(jìn)行了不同生長階段各部位碳、氮穩(wěn)定同位素特征的跟蹤分析，以加強(qiáng)對釀酒玉米生長過程的監(jiān)控，進(jìn)一步加強(qiáng)對釀酒原料品質(zhì)的控制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

IAEA-600(咖啡因，國際原子能機(jī)構(gòu)IAEA，基于V-PDB計算δ13C = -27.771 ‰，基于air N2計算δ15N =1.0 ‰)；錫盒(Thermo Fisher公司PN 24 006 400)；肥料(不同肥料δ15N差異大，范圍廣，本文所用肥料信息列于表1)。

GT200球磨儀，格瑞德曼；Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀、Flash 2000-HT元素分析儀，Thermo Fisher公司。

樣品：為跟蹤檢測釀酒玉米的生長過程，對“釀酒專用糧”種植基地的釀酒玉米(正紅311)進(jìn)行了植物不同生長時期的整株(包括根、莖、葉、果實等)取樣，以進(jìn)行穩(wěn)定同位素研究，具體取樣情況如下：

(1)標(biāo)記位置不同的3塊地，每個生長時期的釀酒玉米均在這3塊地內(nèi)取樣，這3塊地分別位于山頂、山中、山底，海拔總差值不超過200 m；山地區(qū)，地塊面積小，每塊地分別取3個不同點(diǎn)的土壤樣(地面下10～20 cm取120～150 g)，分別充分混合，并標(biāo)記為XJ-T-1，XJ-T-2，XJ-T-3；

(2)收集純營養(yǎng)生長的3葉一心期(未移栽)玉米幼苗3份，編號XJ-1-1，XJ-1-2，XJ-1-3；

(3)在3個地點(diǎn)采集生長發(fā)育最旺盛的拔節(jié)孕穗期釀酒玉米(長出8～12片葉)各1株，編號XJ-2-1，XJ-2-2，XJ-2-3；

(4)在3個地點(diǎn)采集以生殖生長為中心的開花抽絲期釀酒玉米(雄穗抽出，雌穗苞葉中開始長出花絲)各1株，編號XJ-3-1，XJ-3-2，XJ-3-3；

(5)在3個地點(diǎn)采集生長發(fā)育完全結(jié)束的成熟釀酒玉米(可收割)各1株，編號XJ-4-1，XJ-4-2，XJ-4-3。

1.2 實驗方法

對以上所取樣品進(jìn)行多部位取樣、前處理，具體情況如下：

玉米植株取樣分為：A根；B底莖(出土莖取3～5 cm)；C底葉(玉米莖最底1～2片老葉)；D中葉(玉米莖中葉片或玉米苞葉)；E頂莖(取頂葉下莖5～10 cm)；F頂葉(玉米莖頂?shù)娜~片或穗位葉)；G雄穗；H果實：I果穗；

土壤：自然風(fēng)干3個地塊的土壤樣品，球磨儀研磨后待用。

玉米植株：分別摘取玉米植株各部位，蒸餾水清洗后，于烘箱60 ℃烘至恒重，球磨儀研磨后待用。

肥料：于烘箱50 ℃烘至恒重，球磨儀研磨后待用。

用錫盒包裹適量樣品粉末，以IAEA-600為標(biāo)準(zhǔn)品、穩(wěn)定尿素為質(zhì)控樣，采用元素分析-穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(EA-IRMS)檢測樣品；所述元素分析條件為：進(jìn)樣器He吹掃流量200 mL/min，氧化爐溫度為960 ℃，柱溫60 ℃，載氣He,流量110 mL/min；穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜條件如下：離子源真空為1.3×10-6mbar，電壓為3.06 kV。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在自然界中，13C/12C、15N/14N變化微小，難以測得其真實值，故采用相對測量法表示樣品中13C/12C、15N/14N，結(jié)果以δ(千分差，‰)表示，如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

式中：Rsample C、Rsample N表示樣品中13C/12C、15N/14N值；RV-PDB表示國際基準(zhǔn)物質(zhì)V-PDB的13C/12C值，13C/12C = (11 237.2 ± 90)×10-6；Rair N2表示空氣氮庫的15N/14N值，15N/14N = 0.003 68。本項目中所有數(shù)據(jù)均基于V-PDB、air N2計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒玉米幼苗穩(wěn)定同位素

釀酒玉米幼苗(未移栽)穩(wěn)定同位素結(jié)果如圖1所示：3個樣品根、莖、葉的δ13C、δ15N均值并不完全相同，有細(xì)微區(qū)別，但因是在相同條件下、同一地塊內(nèi)進(jìn)行的集體育苗，故均集中于-11.7‰～-13.2‰、3.4‰～5.7‰；對于碳穩(wěn)定同位素，3個樣品均表現(xiàn)出根>莖> 葉δ13C的趨勢，這可能是因為在幼苗期，玉米主要是生根發(fā)芽，根部生長很快，地表部分發(fā)育速度緩慢，使得根部更有利于富集13C，符合C-4植物的碳穩(wěn)定同位素特征；而氮穩(wěn)定同位素不同于碳，表現(xiàn)出莖>葉> 根δ15N的趨勢，這主要是因為植物通過根吸收的氮素一部分被根同化，由于14N活性優(yōu)于15N，植物進(jìn)行生命活動時會優(yōu)先同化14N，使植物根氮穩(wěn)定同位素偏負(fù)，剩余部分氮穩(wěn)定同位素偏正[14]。

a-δ13C；b-δ15N圖1 玉米幼苗穩(wěn)定同位素Fig.1 The stable isotope ratios of maize seedlings

2.2 拔節(jié)孕穗期釀酒玉米穩(wěn)定同位素

將集體育苗的釀酒玉米幼苗分別移栽，移栽土壤、施肥信息如表1所示。3個不同地塊的土壤樣各為每塊地內(nèi)3個不同點(diǎn)的土壤，各自擁有不同性狀，每個樣平行測量3次，取平均值。對拔節(jié)孕穗期釀酒玉米穩(wěn)定同位素進(jìn)行檢測，3組樣品每組平行測量3次，取平均值，檢測結(jié)果列于圖2。

表1 釀酒玉米移栽土壤、施肥信息Table 1 The soil and fertilization informations of liquor-making maize transplantation

移栽到3個不同土壤的拔節(jié)孕穗期釀酒玉米各部位δ13C均集中在-11.2‰～-13.7‰，與移栽前幼苗期相比并無明顯差異，與3塊地土壤δ13C(<-21‰)相比差異顯著，這是因為植物δ13C受其光合碳代謝途徑和環(huán)境因子共同影響[17]，以C-4循環(huán)為光合碳代謝途徑的植物δ13C多集中于-11‰～-15 ‰，土壤碳穩(wěn)定同位素組成對其不具顯著性影響。圖2顯示3株釀酒玉米各部位δ13C均值的表現(xiàn)并不完全一致，底莖δ13C、根δ13C、中葉δ13C趨勢不明顯，但總的來說拔節(jié)孕穗期玉米葉、莖生長迅速，使得頂葉、頂莖更易富集13C，形成頂葉>頂莖>底莖、中葉、根>底葉δ13C的規(guī)律。

圖2顯示移栽后，3株拔節(jié)孕穗期釀酒玉米各部位δ15N分別處于-1.5‰～4 ‰、2.9‰～6‰、-2.8‰～0‰，與幼苗期(3.4‰～5.7‰)相比，各具差異；對比相應(yīng)土壤及肥料δ15N均值，發(fā)現(xiàn)此時期釀酒玉米δ15N更受肥料影響；除了底葉δ15N規(guī)律不明顯外，其他部位δ15N均表現(xiàn)出底莖>頂莖>頂葉>中葉>根δ15N的趨勢。

a-δ13C；b-δ15N圖2 釀酒玉米拔節(jié)孕穗期穩(wěn)定同位素Fig.2 The stable isotope ratios of liquor-making maize at jointing-booting stage

2.3 開花抽絲期釀酒玉米穩(wěn)定同位素

收集開花抽絲期釀酒玉米樣品，對其各部位δ13C，δ15N進(jìn)行檢測，每個樣品平行檢測3次，取平均值，結(jié)果如圖3所示。此階段釀酒玉米各部位δ13C均集中在-11.0‰～-13.2‰，與前兩時期相比并無明顯差異。

a-δ13C；b-δ15N圖3 釀酒玉米開花抽絲期穩(wěn)定同位素Fig.3 The stable isotope ratios of liquor-making maize at flowering-silking stage

開花抽絲期釀酒玉米，所有葉片均已展開，植株定長，營養(yǎng)生長基本停止，進(jìn)入以生殖生長為中心的階段，此段時間營養(yǎng)集中累積到玉米植株的生殖器官(果穗、雄穗)上，使之快速生長。由圖3可知，此時期釀酒玉米各部位δ13C均值均表現(xiàn)出果穗>雄穗>頂莖>頂葉>根> 底莖>中葉>底葉δ13C的趨勢，說明處于快速生長狀態(tài)的果穗、雄穗更易富集13C，形成穗>莖、葉、根δ13C的規(guī)律。不同于δ13C規(guī)律，開花抽絲期釀酒玉米各部位δ15N均值均表現(xiàn)出底莖>底葉、中葉>頂莖、果穗>頂葉>雄穗>根δ15N的趨勢，總的來說呈現(xiàn)莖、葉>穗> 根δ15N的規(guī)律。

2.4 成熟期釀酒玉米穩(wěn)定同位素

收集了成熟釀酒玉米樣品，此階段底葉、中葉均已干枯掉落，故沒收集底葉、中葉數(shù)據(jù)。成熟期釀酒玉米干物質(zhì)積累已停止，植株主要是脫水，可觀察到收集到的樣品多部位已干枯發(fā)黃，但籽粒生長狀況比較好。對樣品其余各部位δ13C、δ15N進(jìn)行檢測，每個樣品平行檢測3次，取平均值，結(jié)果示于圖4。此階段釀酒玉米各部位δ13C均集中在-11.3‰～-13.0‰，與前三時期相比并無明顯差異。圖4顯示，山頂、山中、山底3塊地上的成熟期釀酒玉米各部位δ13C均值均表現(xiàn)出果實>雄穗>頂莖>根>底莖>頂葉δ13C的趨勢，說明經(jīng)過整個生命過程后，釀酒玉米的果實富集到最多13C，形成果實>莖、根、葉δ13C的規(guī)律。而釀酒玉米各部位δ15N均值，除了根δ15N規(guī)律不明顯外，其他部位表現(xiàn)出底莖>果實>頂葉>頂莖>雄穗δ15N的趨勢。

a-δ13C；b-δ15N圖4 成熟期釀酒玉米穩(wěn)定同位素Fig.4 The stable isotope ratios of liquor-making maize at maturity stage

另外，采集了3塊地上其他釀酒玉米植株的果實樣品各2個，平行檢測3次，取平均值，檢測結(jié)果列于圖5。由圖5可知，山頂、山中、山底釀酒玉米果實δ13C 波動不大，均集中于-11.9‰～-11.2‰；而果實δ15N顯示出不同現(xiàn)象：同一塊地內(nèi)，3個果實δ15N波動不大，但不同地內(nèi)，果實δ15N差距明顯；山頂、山中地內(nèi)釀酒玉米果實δ15N均大于+2.0 ‰，而山底地內(nèi)釀酒玉米果實δ15N均小于-1.5 ‰。這是因為山頂、山中田地施有機(jī)肥，而山底田地施非有機(jī)肥；研究表明非有機(jī)肥δ15N約為-2‰～2‰，有機(jī)肥δ15N約為0.6‰～36.7 ‰[18]，過多使用非有機(jī)肥會使植物δ15N貧化，而有機(jī)肥對15N有富集作用，植物利用后，15N會進(jìn)一步富集，造成3塊地內(nèi)釀酒玉米果實δ15N表現(xiàn)不同。

a-δ13C；b-δ15N圖5 釀酒玉米果實穩(wěn)定同位素Fig.5 The stable isotope ratios of liquor-making maize fruits

3 討論

檀文炳等[19]發(fā)現(xiàn)北京東靈山(海拔400～2 300 m)C-4植物葉片δ13C隨海拔高度的增加逐漸變重，釀酒玉米屬于C-4植物，在圖2拔節(jié)孕穗期中也表現(xiàn)出相似的規(guī)律：各部位δ13C均隨著海拔高度的增加(從山底XJ-2-3到山頂XJ-2-1)逐漸變重，這可能是因為隨著海拔高度的增加，環(huán)境大氣壓下降，植物葉片內(nèi)外CO2的分壓差異變小，造成植物體內(nèi)碳穩(wěn)定同位素的分餾作用變小，最終造成這一規(guī)律[20]。然而這一規(guī)律并未在圖3開花抽絲期和圖4成熟期中出現(xiàn)，這可能是因為除了海拔高度，植物δ13C還受到壓力、光照、可利用水量、溫度等因素影響[20]，雖然3個取樣地點(diǎn)沒變，但隨著取樣時間從初春逐步過渡到夏天，3個取樣地點(diǎn)的其他環(huán)境因素出現(xiàn)了不一樣的變化，使得海拔高度因素在這2個生長時期未對釀酒玉米δ13C造成顯著影響?？傊?，海拔高度在本文中未對釀酒玉米δ13C產(chǎn)生顯著影響。

表2顯示不同生長時期釀酒玉米擁有不同穩(wěn)定同位素規(guī)律，總的來說，13C最易富集在生長旺盛的部位；而15N/14N最易在莖部(特別是底莖)富集(與以往研究[14-15]的結(jié)果一致)，在根部貧化。

表2 不同生長時期釀酒玉米穩(wěn)定同位素規(guī)律Table 2 The stable isotope ratio regularities of liquor-makingmaize at different growth stages

釀酒玉米移栽不同土地、施不同肥后底莖、底葉δ15N的情況如圖6所示?？v觀釀酒玉米整個生長過程，發(fā)現(xiàn)在集體育苗的幼苗期，釀酒玉米莖、葉δ15N分布集中，無明顯區(qū)別；移栽到不同土地、施不同肥后，各部位δ15N出現(xiàn)了不同分化：其他部位δ15N分化不具明顯趨勢，而底莖、底葉δ15N，無論是在拔節(jié)孕穗期，還是在開花抽絲期，施有機(jī)肥的山頂、山中地內(nèi)，其都如果實δ15N一般大于+2.0 ‰，施非有機(jī)肥的山底地內(nèi)，其均小于0 ‰。綜合圖5、圖6結(jié)果，說明釀酒玉米底莖、底葉和果實δ15N對施肥情況比較依賴：多施有機(jī)肥，有利于釀酒玉米富集15N/14N，使底莖、底葉、果實δ15N偏高；多施非有機(jī)肥，不利于釀酒玉米富集15N/14N，使底莖、底葉、果實δ15N偏低。這與CHOI等[15]的研究結(jié)果“種植70 d后，施有機(jī)肥(豬糞肥)的玉米葉片δ15N和玉米粒δ15N明顯高于施非有機(jī)肥(尿素)；施不同肥的玉米根δ15N、莖δ15N的差異不顯著”不完全一致。造成本文與CHOI等[15]在玉米莖δ15N結(jié)論上不一致的可能原因有：種植環(huán)境條件不一樣，本文是在多變的實際種植環(huán)境中進(jìn)行的，CHOI等[15]是在穩(wěn)定的實驗室種植環(huán)境中進(jìn)行的；取玉米莖的位置可能不一樣，本文在頂莖δ15N和底莖δ15N上的結(jié)論就不同。

a-釀酒玉米底莖δ15N;b-釀酒玉米底葉δ15N圖6 釀酒玉米底莖、底葉δ15NFig.6 The δ15N in bottom stem and bottom leaf of liquor-making maize

4 結(jié)論

隨著消費(fèi)者對濃香型白酒品質(zhì)要求的提高，研究者們不斷地深入對濃香型白酒原料和生產(chǎn)工藝的研究，釀酒原料的品質(zhì)直接影響著濃香型白酒的品質(zhì)。肥料的差異導(dǎo)致了釀酒玉米底莖、底葉、果實δ15N的表現(xiàn)不同；生長過程中的同位素自然分餾效應(yīng)導(dǎo)致了釀酒玉米各部位δ13C在不同生長時期的不同差異。本文在對釀酒專用糧食基地玉米生長過程的監(jiān)控中，提供了初步理論數(shù)據(jù)；并在加強(qiáng)對白酒原料品質(zhì)的控制，進(jìn)而加強(qiáng)對濃香型白酒品質(zhì)的控制中，貢獻(xiàn)了一份力量。鑒于本文是在釀酒玉米單次施肥條件下得到的結(jié)果，故要實現(xiàn)這個監(jiān)控可能性還需收集更多更細(xì)致的實驗數(shù)據(jù)，如釀酒玉米植株在不同生長時期施不同肥后，不同部位δ15N的表現(xiàn)以及土壤硝態(tài)氮δ15N、銨態(tài)氮δ15N、有機(jī)氮δ15N、營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化等。