電化學氧化降解濕態(tài)玉米酒精糟中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

熊粟栗，袁文娟，高婧琪，李曉，李華志，張杰*

1(四川大學 生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都，610064)2(四川省資中縣銀山鴻展工業(yè)有限公司，四川 內江，641200)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又被稱為嘔吐霉素、嘔吐毒素，是單端孢霉烯族化合物的一類[1]。DON具有強烈的細胞毒性與致畸性，研究表明DON與神經障礙和免疫抑制等各種并發(fā)癥有關[2-3]，嚴重情況下可導致死亡。DON主要由禾谷鐮刀菌產生[4]，廣泛出現(xiàn)于玉米、小麥、大麥等谷物及其產品中，可增加作物結痂的發(fā)生率，降低作物的產量和品質。據調查，在各種常見飼料原料中玉米受DON污染最為嚴重，檢出率達97.9%，超標率達47.7%[5]。玉米是酒精發(fā)酵工業(yè)的主要原料，目前中國已成為第三大酒精生產國，年產酒精超過900萬t[6-7]。玉米發(fā)酵制取乙醇過程中留下的副產物被稱為“濕態(tài)玉米酒精糟(wet distillers grains with solubles broths,WDGS)”烘干后為“干態(tài)玉米酒精糟(dar disstillers grains with solubles broths,DDGS)”[8]。DDGS融合了玉米和酵母的營養(yǎng)成分和活性因子，可直接作為動物蛋白質飼料并且具有高蛋白，高營養(yǎng)等優(yōu)勢[9]。

DON具有熱穩(wěn)定性[10]，經歷糖化和發(fā)酵后仍存留在玉米酒精糟中，嚴重影響后期副產物DDGS的品質。這種被DON污染過的DDGS營養(yǎng)價值及口感都大大降低，并且進入食物鏈中將嚴重危害人和動物的健康，造成巨大的經濟損失，因此有必要開發(fā)一種具有成本效益的DON去除方法。前人曾采用過多種方法對DON進行降解，包括：物理方法，如紫外線照射、微波處理；添加化學強氧化劑，如臭氧[11]和二氧化氯[12]等。但是這些方法都具有不同程度的局限，例如去除效果不穩(wěn)定，造成營養(yǎng)價值和適口性的降低。其中，最大的問題是這些技術難以與酒精發(fā)酵過程結合，不適合在酒精發(fā)酵工業(yè)中應用。

電化學氧化(electrochmical oxidation，EO)是一種新興的處理技術，具有諸多的優(yōu)點，例如反應條件溫和、反應裝置簡單、不易產生二次污染。因此，它被稱為環(huán)境友好型技術，已被廣泛用于降解污水中難降解的污染物，如有殘留有機氯農藥[13]、殘留殺蟲劑[14]。但是目前利用電化學氧化技術來處理谷物中的霉菌毒素的研究還未見報道。本文采用電化學氧化法探究了電壓、時間、電解質濃度3個因素對DON標品和WDGS中DON降解率的影響，確定了最優(yōu)降解條件，并對處理前后WDGS中總蛋白和脂質含量進行了測定。該研究為利用電化學氧化技術去除發(fā)酵工業(yè)中難降解毒素提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WDGS，四川省資中縣銀山鴻展工業(yè)有限公司，常溫密封保存; DON標品，新加坡 Pribolab，CAS: 51481-10-8；鈦網(Ti mesh)電極，購自市場。其他試劑均購自成都蜀都有限公司。本實驗中除甲醇，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 實驗裝置

實驗裝置采用“H”型電解室，將陽極室和陰極室用質子交換膜隔開進行實驗。陰極和陽極電極材料均為鈦網，電極面積為23.5 cm，電極間距5 cm，各室容積15 cm3(處理玉米發(fā)酵糟液所用電解室容積為100 cm3)，磁力攪拌器以1 000 r/min進行攪拌，確保樣品完全混合。電位輸出由CHI760E電化學工作站(上海辰華)控制。

1.3 電化學處理DON標品

電壓強度及處理時間對DON降解率的影響：采用恒壓模式控制以0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V處理用電解質溶液稀釋的5 μg/mL DON溶液，電解液為 0.2 mol/L NaCl溶液，處理時間為80 min。每10 min取200 μL樣品檢測DON含量并計算降解率。

電解質濃度對實驗的影響：配置0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液作為電解質溶液，在1.2 V的恒定電壓下處理60 min，每10 min取樣檢測DON濃度。

1.4 電化學處理WDGS

電壓強度對DON降解率的影響:分別采用0.8、1.0、1.2 V處理80 mL WDGS，每10 min取10 mL樣品烘干，檢測DON含量，計算降解率。

NaCl對DON降解率的影響：在1.3實驗的基礎上，選用0.2 mol/L NaCl為實驗電解質濃度，比較了添加NaCl及不添加NaCl對WDGS中DON降解率的影響。

DDGS理化性質變化：把WDGS分為添加NaCl及不添加NaCl兩組，分別用1.2 V恒電壓處理60 min并烘干，以未經處理的DDGS作為對照。評估了不同處理后的DDGS粗蛋白、脂質變化。粗蛋白提取采用堿提法：V(樣品)∶V(提取液)(0.1 mol/L NaOH)=1∶5，50 ℃萃取2 h，以1 000 r/min攪拌，保證樣品完全混合。8 000 r/min離心5 min，上清為粗蛋白提取物。采用考馬斯亮藍G-250法測定粗蛋白含量，并進行SDS-PAGE實驗，采用索氏提取法測定脂質含量。

1.5 DON檢測

將1 mg DON標品溶于1 mL甲醇(LC級)，配置1 g/L儲備液，4℃避光保存。建立DON標準曲線，將DON標準儲備液用超純水稀釋為0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL的系列標準工作溶液，通過HPLC檢測。建立的標準曲線方程為y=0.018 8x-0.005 3(R2=0.999 9)，線性關系良好。

DDGS中DON提取參照國標GB/T(23503—2009)[15]及WANG等[11]的方法，將5 g樣品放入50 mL燒瓶中，加入25 mL乙腈水(體積比84∶16)。40 ℃下超聲振蕩提取30 min，然后將提取物以8 000 r/min離心10 min，收集上清液。并使用固相萃取凈化柱凈化(Oasis HLB)，收集洗脫液在45℃和氮氣下干燥。最后，將干燥的殘余物用1 mL甲醇(LC級)再溶解，并通過0.22 μm有機過濾器過濾，使用HPLC進行檢測。

HPLC條件：采用Waters C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)=10∶90；柱溫：30 ℃；UV檢測波長：218 nm；流速：1.0 mL/min；檢測體積：20 μL。

1.6 統(tǒng)計學分析

每組處理平行實驗3次，獨立重復的數據進行合并后計算用標準差。使用SPSS軟件通過方差分析(ANOVA) 和Duncan檢驗(P<0.05) 分析所有數據。

2 結果與分析

2.1 不同電壓及處理時間對DON降解率的影響

如圖1所示，不同電壓下DON降解率有較大差異，經80 min處理后0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 V電壓對應的降解率分別為23.73%、57.02%、66.9%、79.15%、100%，當電壓達到1.4 V，處理30 min后降解率即可達到100%。由于水的電解電位為1.23 V[16]，當外加電壓高于1.23 V時，此時發(fā)生的不僅僅是電極的析氯反應，還伴隨著強烈的水電解反應，大量的氣泡從電極表面產生，更多電能用于析氧副反應[17]。這意味著更多不必要的電力消耗，且反應過程難以控制。1.2 V電壓處理60 min可達到76.4%的降解率，LI等[15]用臭氧處理90 min后第降解率為53.48%。說明相比傳統(tǒng)的氧化方法，電化學方法能夠更快速高效的降解DON，具有更廣闊的應用前景。

將1.2 V反應條件下各時間點的濃度與初始濃度之比進行對數轉換后，擬合ln(C/C0)-t曲線，如圖2所示，在0～60 min，表現(xiàn)出較好的線性關系，R2=0.96。說明該電化學反應在60 min符合一級動力學反應。這為將來進一步探究該電化學反應條件機理及優(yōu)化實驗方案提供了思路。由圖2可知，在不同的電壓條件下，DON降解率在前30 min內增加迅速，在30～60 min內增速變緩，60 min后降解率無明顯變化。因此我們選擇1.2 V，60 min作為后續(xù)實驗條件。

圖1 DON降解率Fig.1 Degradation rate of DON注：初始DON質量濃度5 μg/mL，電解質0.2 mol/L NaCl。圖2同。

圖2 ln(C/C0)在室溫下隨時間的變化Fig.2 Variation of ln(C/C0) with the time at room temperature

2.2 NaCl濃度對DON降解的影響

不同NaCl濃度(在0～0.5 mol/L)在1.2 V條件下處理60 min后的DON降解率如圖3所示。在0.2 mol/L NaCl電解液中，降解率為79.22%，當NaCl濃度達到0.3 mol/L時，DON的降解率降低至69.18%。之后，NaCl濃度增加但DON降解率變化無顯著性差異。在電化學氧化過程中，溶液中活性氯物質的濃度是一個重要參數[18]。當電解液中的NaCl濃度較低時，隨著NaCl含量的增加，電極的氯析出速率相應增加，電解液中的氯活性物質濃度也增加，因此降解效果顯著增加。然而，當NaCl增加到一定濃度時，電解產生的大量氯氣無法完全溶解在水中形成氯活性物質，一部分氯氣溢出并隨之有更多的氯氣擴散[19]，因此溶液中氯活性物質的濃度反而降低，導致降解速率降低。綜上，我們將0.2 mol/L的NaCl溶液作為實驗電解質濃度進行后續(xù)實驗。

圖3 電解質NaCl濃度對DON降解的影響Fig.3 Effect of NaCl concentration in electrolyte on DON degradation 注：不同字母(a～d)的均值經Duncan檢驗后的差異性具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。下同。

2.3 鈦網電極重復性實驗

在使用電化學氧化技術處理DON時，電極重復使用能力與DON的降解效果和設備成本息息相關。如圖4所示為3次連續(xù)實驗鈦網電極對DON的降解率。第1次使用之后，不對電極進行任何處理即開始下一次實驗，第2次實驗中DON的降解效率出現(xiàn)了明顯的下降，僅為48.96%。第2次實驗之后，用甲醇對電極表面進行沖洗后再進行第3次實驗，DON降解效率又回升至75.02%，與第1次電解實驗的降解率無顯著性差異，說明經簡單處理后鈦網即可具備良好的重復使用性。

圖4 循環(huán)次數對DON降解的影響Fig.4 Effect of recycling times on degradation of DON.

2.4 電壓強度及NaCl對WDGS中DON降解率的影響

圖5-A為添加0.2 mol/L NaCl時不同電壓對WDGS中DON的影響。與處理標準品溶液過程類似，WDGS中DON的降解率也隨著電壓強度的升高而升高。0.8、1.0、1.2 V下對DON的降解率分別為26.25%、40.09%、51.72%。說明WDGS復雜的溶液環(huán)境可能對電化學氧化效果產生不利的影響，但仍然高于李曉等[20]用ClO2處理12 h后達到40.70%的降解率，并且大大降低了處理時間。同時也提醒了我們，WDGS復雜的溶液環(huán)境具有作為電解質的潛力，因此我們將1.2 V條件下的實驗結果與不加NaCl 1.2 V處理的WDGS中DON降解率變化進行了對比。如圖5-B所示，1.2 V處理60 min后DON去除率為43.28%，說明不添加額外的電解質依然具有良好的降解效果，這又進一步降低了處理成本。綜上所述，雖然電化學氧化處理對WDGS中DON的降解率略低于處理標準品的降解率，但WDGS液態(tài)狀態(tài)以及成分復雜的特殊特性，使得該方法仍然可以作為一種具有巨大潛力、低成本、易操作的去除WDGS中DON的可行方法。

A-不同電壓下WDGS中DON的降解率;B-NaCl對WDGS中DON降解率的影響圖5 電化學氧化處理WDGSFig.5 Electrochemical oxidation of WDGS

2.5 DDGS理化性質變化

由圖6-A和表1可知，與未經處理的對照組相比電化學氧化處理后的DDGS中粗蛋白及脂質含量無顯著性差異。圖6-B為粗蛋白SDS-PAGE圖，其中通道1為未經處理的DDGS的粗蛋白提取物，通道2、3分別為無NaCl和添加了0.2 mol/L NaCl的WDGS的1.2 V電解產物烘干后的粗蛋白提取物。如圖7所示，3組蛋白質條帶的數量一致，蛋白質條帶的亮度無顯著差異。說明電化學處理后的DDGS粗蛋白分子量及種類無明顯變化。因此，施加電壓和NaCl的添加對DDGS中營養(yǎng)質量含量無顯著影響。

表1 電化學氧化處理后DDGS理化性質的改變Table 1 Changes in the physicochemical properties of EO-treated DDGS

注：數值表示為均值標準差(n= 3)，每列上標相同字母a表示無顯著差異。

1-處理前；2-處理后(無NaCl)； 3-處理后(0.2mol/L NaCl)A-不同處理后的粗蛋白及脂質變化;B-粗蛋白SDS-PAGE圖6 電化學氧化處理后DDGS理化性質的改變Fig.6 Changes in the physicochemical properties of EO-treated DDGS

3 結論

本文利用電化學氧化技術對DON標品及被DON污染的WDGS進行了處理，實驗結果表明,該技術能夠在短時間內有效降解DON標品及WDGS中的DON。處理時間、電壓強度、電解質濃度都對DON降解率有一定程度的影響。此外，電解質的加入能夠極大地提高DON降解率，處理DON標準品的最佳NaCl濃度為0.2 mol/L，再提高電解質濃度對實驗結果無顯著性影響。重復性實驗結果表明，在電極表面可能存在某種吸附機制，吸附溶液中的物質從而影響電解效率，但這種影響可以很容易的通過甲醇沖洗去除。在處理WDGS過程中，由于其本身成分復雜的特點，使得WDGS本身可作為電解質，不需要再加入額外的電解質，大大降低了成本。電解處理后，DDGS的粗蛋白和脂質含量無明顯變化。本研究為利用電化學氧化技術在乙醇發(fā)酵過程中去除DON提供了新思路，這可以作為在大規(guī)模生產中去除霉菌毒素的有效方法。