啤酒釀造過(guò)程中酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與風(fēng)味代謝物質(zhì)的相關(guān)性

宋玉梅，謝鑫，趙楠，郭立蕓

(北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，101300)

酵母作為啤酒釀造的四大原料之一，其發(fā)酵過(guò)程可賦予啤酒獨(dú)特的風(fēng)味和口感，同時(shí)優(yōu)良性能的酵母亦是保證啤酒質(zhì)量穩(wěn)定的重要前提[1-2]。鋅作為啤酒釀造中的無(wú)機(jī)微量金屬離子，對(duì)促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的進(jìn)行起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在酵母生長(zhǎng)過(guò)程中，鋅離子主要分為酵母總鋅和酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅[3-4]，其中酵母總鋅指吸附于酵母細(xì)胞表面的無(wú)機(jī)鋅離子，必須與有機(jī)配位體螯合后才能進(jìn)一步為機(jī)體所吸收利用，而經(jīng)與蛋白螯合后的有機(jī)鋅由于更接近于機(jī)體內(nèi)的作用形式被稱為酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅，其生物學(xué)價(jià)值和可用性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)機(jī)鋅[5-6]。

啤酒釀造過(guò)程中，酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅可有效地促進(jìn)酵母菌體的生長(zhǎng)繁殖、加速蛋白質(zhì)和維生素的合成[7-9]。鋅離子作為α-淀粉酶和磷酸酶的激活劑，可提高α-淀粉酶和磷酸酶的活性，進(jìn)而提高淀粉的分解速度，縮短糖化時(shí)間；有機(jī)磷酸鹽在磷酸酶的分解下產(chǎn)生磷酸，可進(jìn)一步改善醪液的緩沖性，使各種酶系在適宜的pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用[10-11]。同時(shí)鋅離子作為啤酒中泡沫的促進(jìn)劑，還能起到增強(qiáng)啤酒泡沫的強(qiáng)度，提高啤酒非生物穩(wěn)定性的作用[12]。

啤酒風(fēng)味物質(zhì)是啤酒釀造過(guò)程中由于酵母代謝而產(chǎn)生的一系列揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)的總稱，構(gòu)成了啤酒特有的香味和口感[13]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于酵母代數(shù)、批次、品種及接種量對(duì)酵母發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的影響已有較多的研究[14-18]，而鋅離子作為促進(jìn)揮發(fā)性酸、醛類以及雙乙酰等物質(zhì)產(chǎn)生的重要金屬離子，其對(duì)風(fēng)味代謝物質(zhì)的影響還鮮有報(bào)道。本文從啤酒酵母菌株YJ02出發(fā)，探究不同傳代次數(shù)和外源添加鋅離子對(duì)酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅的影響，并進(jìn)一步對(duì)酵母菌株YJ02代謝過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，以期闡明酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與風(fēng)味代謝物質(zhì)的相關(guān)性，為酵母發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的控制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及材料

啤酒酵母菌株YJ02，保藏于北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心酵母菌種保藏室。

13 °P麥汁，北京燕京啤酒股份有限公司糖化車(chē)間生產(chǎn)；酵母泥，北京燕京啤酒股份有限公司釀造車(chē)間發(fā)酵罐種酵母泥。

1.2 試劑與儀器

ZnSO4、pH 6.5 10mmol/L EDTA溶液、葡萄糖、丙酮等,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

NexlON電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)，Perkin-Elmer儀器有限公司；Alpha2-4真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin Christ公司；7697A-7890B氣相色譜儀，Agilent Technologies公司；MVS-1漩渦混合儀，北京金水德工貿(mào)有限公司；FE 28 pH計(jì)，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；JB-3A恒溫定時(shí)攪拌器，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同鋅離子含量麥汁的制備

取糖化車(chē)間煮沸前麥汁(未添加ZnSO4)，加熱煮沸1 h后加入20 g/L硅藻土(粗細(xì)比例為1∶1)進(jìn)行過(guò)濾，并于115 ℃下滅菌20 min，待無(wú)菌麥汁冷卻后進(jìn)一步使用無(wú)菌濾紙過(guò)濾以去除麥汁中冷凝固物，并檢測(cè)濾液中的鋅離子含量。同時(shí)將處理后的麥汁分裝至三角瓶中，按照不同梯度添加過(guò)濾除菌的ZnSO4溶液使麥汁中鋅離子含量分別為0.2、0.4、0.6、1.4、3.4 mg/L。

1.3.2 發(fā)酵方法

取不同濃度梯度下500 mL麥汁進(jìn)行三角瓶發(fā)酵，每天進(jìn)行搖瓶稱重追蹤C(jī)O2失重量，當(dāng)CO2失重量小于0.2 g時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.3 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 酵母活力

參考應(yīng)用酵母活力值評(píng)價(jià)啤酒生產(chǎn)酵母的發(fā)酵性能[19]的方法在發(fā)酵結(jié)束后收集酵母泥進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.2 酵母總鋅

發(fā)酵結(jié)束后于4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，重復(fù)3次后收集酵母泥，使用純水和pH 6.5 10 mmol/L EDTA溶液各洗滌1次后，于8 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，棄取上清液收集酵母細(xì)胞，120 ℃下烘干至恒重并使用ICP-MS進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.3 酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅

在發(fā)酵結(jié)束后收集酵母泥，分別使用純水和pH 6.5 10 mmol/L EDTA溶液洗滌后于4 ℃、6 000 r/min條件下離心1 min，棄去上清液后于沉淀中加入氧化鋯研磨珠和100 μL純水進(jìn)行旋渦振蕩破碎；收集破碎酵母細(xì)胞提取液，并加入700 μL純水混勻，4 ℃離心10 min后收集上清液，并重復(fù)以上步驟共計(jì)5次；合并離心后的上清液并添加等體積的丙酮(-20 ℃預(yù)冷)，混合均勻后于-20 ℃放置2 h，4 ℃離心10 min，棄去上清液得到酵母胞內(nèi)蛋白沉淀；將酵母胞內(nèi)蛋白沉淀通風(fēng)干燥10 min后加入2 mL超純水，真空冷凍干燥24 h以徹底去除水分和殘留的丙酮，收集凍干后的酵母胞內(nèi)蛋白(胞內(nèi)有機(jī)鋅以與蛋白螯合的形式存在)，消解后使用ICP-MS檢測(cè)。其中酵母破碎率計(jì)算公式如下：

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，用SAS V8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 研磨珠對(duì)酵母破碎率的影響

由于研磨珠的型號(hào)和材料對(duì)酵母破碎率有較大影響，本試驗(yàn)分別選用不銹鋼和氧化鋯2種材料的研磨珠，探究0.5和1.0 mm研磨珠對(duì)酵母菌株YJ02破碎率的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同型號(hào)研磨珠研磨下酵母菌株YJ02破碎率Table 1 The yeast strain YJ02 crushing rate under different types of grinding balls

由表1可知，對(duì)于不銹鋼材料的不同型號(hào)的研磨珠，其破碎率分別為33.7%和33.3%，差別不大，而對(duì)于氧化鋯研磨珠，0.5 mm研磨珠對(duì)酵母菌株YJ02破碎率明顯高于1.0 mm研磨珠，也高于不銹鋼研磨珠，因此綜合比較后選用0.5 mm氧化鋯研磨珠用于后續(xù)酵母菌株YJ02胞內(nèi)有機(jī)鋅的提取，研磨效果如圖1-c所示。

a-0.1 mm不銹鋼；b-1.0 mm不銹鋼；c-0.5 mm氧化鋯；d-1.0 mm氧化鋯圖1 顯微鏡下不同研磨珠對(duì)酵母菌株YJ02破碎情況Fig.1 Fragmentation of yeast strain YJ02 by different grinding beads under the microscope

2.2 胞內(nèi)有機(jī)鋅在傳代過(guò)程中的變化

追蹤酵母菌株YJ02不同代數(shù)下的酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅的變化情況，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如圖2所示。

a-1號(hào)發(fā)酵車(chē)間；b-2號(hào)發(fā)酵車(chē)間圖2 酵母菌株YJ02不同代數(shù)下酵母總鋅、胞內(nèi)有機(jī)鋅和酵母活力變化趨勢(shì)圖Fig.2 The trend charts of total zinc, intracellular organic zinc in yeast and yeast activity under different generations of yeast strain YJ02

對(duì)酵母菌株YJ02不同代數(shù)下的酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅的變化情況進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。

表2 酵母總鋅、胞內(nèi)有機(jī)鋅及酵母活力與酵母菌株YJ02傳代次數(shù)相關(guān)性分析Table 2 The analysis correlation of total zinc, intracellular organic zinc in yeast,yeast activity and yeast strain YJ02 generations

注：**表示P<0.01,*表示P<0.05。

對(duì)比同一發(fā)酵車(chē)間下不同酵母菌株YJ02代數(shù)的酵母活力、酵母總鋅和胞內(nèi)有機(jī)鋅可以發(fā)現(xiàn)，隨著酵母菌株YJ02傳代次數(shù)的增加，酵母活力整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這是由于傳代初期，酵母菌株YJ02在進(jìn)入新的環(huán)境中存在一定適應(yīng)階段，故其整體活力增長(zhǎng)速度較慢，隨后由于麥汁為酵母菌株YJ02生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使酵母活力快速提高，隨著傳代次數(shù)的進(jìn)一步增加，酵母菌株YJ02會(huì)逐漸衰老死亡，甚至出現(xiàn)自溶或者變異等現(xiàn)象，同時(shí)由于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，在傳代后期會(huì)出現(xiàn)其他雜菌污染的情況，因此導(dǎo)致酵母菌株YJ02活力呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，這也與董霞等[20]研究結(jié)果一致。結(jié)合圖2和表2可以發(fā)現(xiàn)，酵母總鋅的含量隨傳代次數(shù)的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，與傳代次數(shù)有極顯著的相關(guān)性(P<0.01)，而酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅則在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，與酵母菌株YJ02傳代次數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性，這說(shuō)明在酵母菌株YJ02傳代過(guò)程中酵母總鋅含量是隨著傳代次數(shù)的增加而不斷進(jìn)行累積，但酵母菌株YJ02實(shí)際可利用的有機(jī)鋅含量則是一定的，在傳代后期并不會(huì)隨著酵母活力和傳代次數(shù)的變化而發(fā)生變化。

2.3 不同麥汁鋅離子添加對(duì)酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅的影響

對(duì)發(fā)酵過(guò)程中不同鋅離子含量麥汁內(nèi)CO2失重進(jìn)行追蹤，結(jié)果如圖3所示。不同鋅離子含量下發(fā)酵的CO2失重量高峰期及發(fā)酵結(jié)束時(shí)間相近，0.2 mg/L的鋅離子含量下發(fā)酵高峰期失重量顯著低于其他濃度，說(shuō)明較高鋅離子含量對(duì)酵母菌株YJ02發(fā)酵速率的影響不大，但過(guò)低的鋅離子含量會(huì)導(dǎo)致高峰期CO2失重量降低。

圖3 酵母菌株YJ02在不同鋅離子含量麥汁中的CO2失重曲線Fig.3 The CO2 weightlessness curve of yeast strain YJ02 in different zinc ion contents

于麥汁中添加不同濃度鋅離子后對(duì)酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅含量的變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖4所示。

對(duì)不同鋅離子含量麥汁發(fā)酵過(guò)程中酵母活力、酵母總鋅和酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅含量的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示。

由圖4可以發(fā)現(xiàn)，隨著麥汁中鋅離子濃度的增加，酵母活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明在麥汁中添加低濃度的鋅離子可有效地促進(jìn)酵母菌株YJ02生長(zhǎng)繁殖，提高酵母活力，但麥汁中鋅離子濃度過(guò)高時(shí)，亦會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，從而降低酵母活力，這也與蔣虹等[21]研究結(jié)果一致。酵母總鋅隨著麥汁中鋅離子濃度的增加逐漸上升，而酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅則先上升后趨于平穩(wěn)，說(shuō)明隨著外界鋅離子的不斷增加，酵母表面的無(wú)機(jī)鋅不斷富集；當(dāng)鋅離子添加量小于0.6 mg/L時(shí)，酵母菌株YJ02生長(zhǎng)實(shí)際可利用的有機(jī)鋅隨著外界鋅離子的增加而不斷增長(zhǎng)，當(dāng)麥汁中鋅離子添加量為0.6 mg/L時(shí)，酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅含量達(dá)到最大值，此時(shí)酵母活力也最強(qiáng)，隨后當(dāng)麥汁中鋅離子含量繼續(xù)增加時(shí)，酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅含量仍然維持在80～95 mg/kg蛋白之間，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中酵母菌株YJ02實(shí)際可利用的有機(jī)鋅含量是有限的，并不會(huì)隨著外界鋅離子添加量的增加而不斷發(fā)生變化。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中酵母胞內(nèi)鋅含量維持在60～95 mg/kg的水平對(duì)酵母菌株YJ02活力最有利，此時(shí)麥汁中的鋅離子含量應(yīng)保持在0.4～1.4 mg/L。

圖4 不同麥汁鋅離子添加對(duì)酵母活力、酵母總鋅及酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅影響Fig.4 Effects of zinc ion addition in wort on yeast activity,total zinc and intracellular organic zinc in yeast

表3 酵母總鋅、胞內(nèi)有機(jī)鋅及酵母活力與麥汁中鋅離子相關(guān)性分析Table 3 The analysis correlation of total zinc, intracellular organic zinc in yeast,yeast activity and zinc ion addition in wort

注：**表示P<0.01,*表示P<0.05。

2.4 胞內(nèi)有機(jī)鋅與風(fēng)味代謝物質(zhì)相關(guān)性研究

發(fā)酵結(jié)束后對(duì)酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與酵母菌株YJ02代謝過(guò)程中相關(guān)風(fēng)味指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(n=15)，結(jié)果如表4所示。酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅的含量與乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯及辛酸乙酯呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與乙酸乙酯呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與甲醇、異丁醛呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與醇酯比呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，表明酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅含量的增加可以有效的促進(jìn)酯類的生成，同時(shí)一定程度降低醛類、醇類的生成，從而降低醇酯比，這也與宋丹等[22]研究結(jié)果一致。酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與二甲基硫呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，可能是由于而麥汁中添加少量鋅離子可有效的促進(jìn)酵母菌株YJ02發(fā)酵，從而促進(jìn)了二甲基硫的產(chǎn)生[23]。由表4可以發(fā)現(xiàn),酵母活力、麥汁鋅離子濃度以及酵母總鋅與酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅相關(guān)性較弱，這也表明發(fā)酵過(guò)程中酵母菌株YJ02對(duì)鋅離子的利用不僅受到鋅離子添加量的影響，可能還受到其他因素的綜合影響。

表4 酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與風(fēng)味物質(zhì)等指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 The correlation between intracellular organic zinc and flavor substances in yeast

注：**表示P<0.01,*表示P<0.05。

3 結(jié)論

研究結(jié)果顯示，隨著酵母菌株YJ02傳代次數(shù)和發(fā)酵液外源鋅離子含量的增加，酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅均呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，同時(shí)酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅與大部分脂類代謝產(chǎn)物呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，與醛類、醇類呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明酵母利用有機(jī)鋅的能力是有限的，外加鋅離子含量保持在0.4～1.4 mg/L范圍內(nèi)時(shí)對(duì)酵母菌株YJ02生長(zhǎng)最有利，且酵母胞內(nèi)有機(jī)鋅可以有效地促進(jìn)酯類物質(zhì)的合成，并在一定程度降低醛類和醇類物質(zhì)的生成，可為后續(xù)酵母發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的研究與控制提供新的參考。