線粒體介導(dǎo)遠(yuǎn)端缺血后處理抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究進(jìn)展

陶苗苗，徐鳴曙，張英杰，程愛芳，鄧韻怡

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市 200120；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海市200030

大腦對缺血缺氧十分敏感，長時(shí)間處于缺氧或缺血狀態(tài)，會使缺血區(qū)域組織發(fā)生不可逆壞死。主要治療措施是盡快恢復(fù)該區(qū)域腦血流灌注，但缺血腦組織被血流再次灌注，會造成嚴(yán)重的二次傷害。目前針對腦缺血的干預(yù)，急性期大多采用靜脈溶栓，但大多數(shù)患者不能在短暫的時(shí)間窗內(nèi)得到有效治療[1]；腦缺血后，阻斷缺血損傷的級聯(lián)反應(yīng)，減少或緩解神經(jīng)元損傷則是另一思路[2]。訖今仍沒一種應(yīng)用廣泛并行之有效的方法可以預(yù)防或減少腦缺血再灌注損傷。

1 遠(yuǎn)端缺血后處理

缺血后處理的概念由Zhao 等[3]于2003 年首次提出。Keren?di 等[4]發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注前實(shí)施短時(shí)間腎臟缺血再灌注，能明顯減少實(shí)驗(yàn)鼠心肌梗死范圍，提出遠(yuǎn)端缺血后處理的概念。Ren 等[5]的研究證明肢體缺血后處理對大腦的保護(hù)作用。經(jīng)過逐步完善，現(xiàn)在認(rèn)為，機(jī)體重要組織器官缺血后，在再灌注前對遠(yuǎn)離靶器官的非重要器官或組織進(jìn)行反復(fù)、短暫缺血再灌注，可使長期缺血的組織器官在恢復(fù)血流后即刻充血過程受到調(diào)節(jié)，有效調(diào)動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減輕再灌注損傷[6]。

2 遠(yuǎn)端缺血后處理方法

根據(jù)對遠(yuǎn)端肢體的處理方法，遠(yuǎn)端缺血后處理可分為有創(chuàng)和無創(chuàng)兩種[7]。有創(chuàng)的方法，如李富瑩[8]對大腦中動脈閉塞栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注大鼠，于雙側(cè)腹股溝處分離股動脈，用蛙心夾夾閉、放開行缺血再灌注治療。無創(chuàng)的方法，如許士民[9]對MCAO 再灌注大鼠，用橡皮筋扎緊大鼠雙下肢根部，以雙下肢足背動脈搏動消失、皮膚溫度下降、皮膚紫紺、肢體發(fā)脹作為阻斷成功標(biāo)志，松開橡皮筋，使股動脈恢復(fù)血流。

根據(jù)遠(yuǎn)端肢體的處理時(shí)間，可分為快速和延遲兩種?？焖偬幚?，如MCAO 大鼠拔出栓線后5 min，即對大鼠雙側(cè)股動脈進(jìn)行缺血再灌注處理[10]。延遲處理，如對MCAO大鼠，輪流夾閉雙下肢股動脈2 min后灌注2 min，連續(xù)5 d[11]。

根據(jù)缺血部位，可分為上肢和下肢。臨床多采用血壓計(jì)纏繞上臂加壓肱動脈，如何潔等[12]將血壓計(jì)纏繞腦卒中患者上臂，加壓維持180～200 mmHg，持續(xù)5 min，恢復(fù)5 min；每次5 個(gè)循環(huán)，每天2 次，連續(xù)治療半年。而動物實(shí)驗(yàn)多選用下肢股動脈作為缺血處理的對象。

3 線粒體與腦缺血再灌注損傷

線粒體存在于大多數(shù)細(xì)胞中，除了為細(xì)胞提供能量外，還承擔(dān)其他許多生理功能，如參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、氧自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡和自噬，以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[13]。應(yīng)激狀態(tài)下，以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主[14]。

3.1 線粒體和細(xì)胞凋亡

線粒體功能障礙是再灌注誘導(dǎo)腦細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素之一[15]。導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)破壞的事件，如膜電位改變、鈣離子超載、線粒體體積改變和凋亡因子釋放等，都會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷引起細(xì)胞死亡的重要形式[17]：細(xì)胞收縮后，細(xì)胞內(nèi)DNA 程序化降解，細(xì)胞色素C 釋放增多，caspases被激活[18]。

3.2 細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷涉及一系列復(fù)雜的病理過程[19]，這些病理過程會破壞線粒體的形態(tài)和功能。缺血再灌注期間，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境突然改變、線粒體膜電位變化、鈣離子內(nèi)流增加等，會導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔突然打開，線粒體外膜破裂，繼而形成線粒體水腫，并可導(dǎo)致來自線粒體膜間隙的促凋亡因子如細(xì)胞色素C 釋放；外滲的細(xì)胞色素C 可激活caspase?9，進(jìn)而活化凋亡執(zhí)行蛋白caspase?3，最終使細(xì)胞凋亡[20]。

4 遠(yuǎn)端缺血后處理的線粒體機(jī)制

細(xì)胞凋亡的調(diào)控有許多凋亡基因參與，而線粒體是這一調(diào)控程序的核心機(jī)制[21?22]。研究顯示[23]，無創(chuàng)延遲肢體缺血預(yù)處理可促進(jìn)腦缺血再灌注大鼠線粒體ATP敏感性鉀通道開放，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，減小腦缺血再灌注損傷后腦梗死面積，改善神經(jīng)功能障礙。

4.1 細(xì)胞色素C

線粒體內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴，附著許多有重要作用的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞色素[24]。正常情況下，細(xì)胞色素C 不能通過外膜；如果線粒體外膜破裂或通透性發(fā)生改變，細(xì)胞色素C 之類的促凋亡蛋白就會被釋放入細(xì)胞質(zhì)。

細(xì)胞色素C 是細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因素之一。釋放的細(xì)胞色素C 通過損害線粒體功能，激活caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。采用顯微注射技術(shù)將細(xì)胞色素C 注入細(xì)胞內(nèi)，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型凋亡[26]。腦缺血再灌注損傷后，細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到胞漿[27]，啟動細(xì)胞凋亡[25?27]。邢變枝等[28]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過遠(yuǎn)端缺血后處理的缺血再灌注模型大鼠，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C 漏出減少。Wang 等[29]的研究證實(shí)，短暫重復(fù)循環(huán)缺血后處理可減少短暫全腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡和學(xué)習(xí)記憶障礙，可能與抑制細(xì)胞色素C 釋放，進(jìn)而阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。遠(yuǎn)端缺血后處理抑制線粒體細(xì)胞色素C釋放的機(jī)制尚不清楚。

4.2 線粒體自噬

線粒體自噬由Lemasters[30]于2005 年提出。線粒體自噬是細(xì)胞為了維持自身內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，通過降解受損的、自身不需要的線粒體，調(diào)整線粒體數(shù)量和能量代謝平衡的過程，對維持生物體正常生長發(fā)育至關(guān)重要[31?32]。

線粒體自噬能清除受損線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，緩解腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡[33]。自噬在腫瘤、炎癥、衰老，以及胚胎發(fā)育過程中也有重要的保護(hù)作用[34]。

線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中的作用尚未明確。研究表明[35]，自噬通路的過度激活與許多疾病狀態(tài)相關(guān)，受損線粒體的清除超出正常范圍會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，加重腦損傷。腦缺血再灌注后，線粒體外膜蛋白BNIP3表達(dá)增加，并過度激活線粒體自噬，引發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡，加重腦缺血再灌注損傷[36]。過度自噬也會加速線粒體裂解，同樣加重細(xì)胞損傷[37]。

另有研究發(fā)現(xiàn)[38?39]，早期應(yīng)用遠(yuǎn)端缺血后處理觸發(fā)更多自噬開關(guān)分子，誘導(dǎo)復(fù)雜的自噬調(diào)控，從而減少線粒體損傷，提供即時(shí)神經(jīng)保護(hù)。周密[40]發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)端缺血后處理能上調(diào)Parkin和DJ?1 蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)其向線粒體轉(zhuǎn)位，從而增強(qiáng)線粒體自噬，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

線粒體自噬水平升高呈現(xiàn)截然相反的結(jié)果，我們推測，自噬作為一種自身“清潔”機(jī)制，應(yīng)維持在合理范圍內(nèi)，過低起不到腦保護(hù)作用，過高則會帶來相反的結(jié)果。

4.3 線粒體ATP敏感性鉀通道

ATP 敏感性鉀通道是一種非電壓依賴性的配體門控通道，主要參與細(xì)胞代謝和電活動，涉及的門控因素為細(xì)胞內(nèi)ATP和ADP 水平[41]。線粒體ATP 敏感性鉀通道開放引發(fā)鉀離子內(nèi)流，降低鈣離子內(nèi)流，減輕或避免鈣超載引起的線粒體腫脹和分解等，保護(hù)線粒體功能，減輕細(xì)胞損傷[42?44]。大腦中的線粒體K?ATP 通道密度比其他器官和組織更大[45]，提示線粒體K?ATP 通道對神經(jīng)細(xì)胞具有潛在的保護(hù)作用。線粒體ATP敏感性鉀通道開放可抑制caspase?3活性，預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對腦缺血再灌注產(chǎn)生保護(hù)作用[46]。二氮嗪是線粒體K?ATP通道的選擇性開放劑。二氮嗪后處理聯(lián)合預(yù)處理對大鼠心臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，與開放線粒體ATP敏感性鉀通道，維護(hù)線粒體功能有關(guān)[47]。調(diào)節(jié)線粒體ATP 敏感性鉀通道有望成為緩解腦缺血再灌注損傷的一種治療途徑。有研究發(fā)現(xiàn)[48]，肢體缺血后處理對局灶性腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，而K?ATP選擇性阻斷劑5?hydroxydecanoate可使保護(hù)作用消失。Sun 等[49]發(fā)現(xiàn)，延遲遠(yuǎn)端缺血后處理可減少局灶性腦缺血損傷，其機(jī)制和K?ATP通道的開放有關(guān)。

4.4 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)

MPTP 位于線粒體內(nèi)外膜間，是線粒體合成ATP 的重要場所，一般處于關(guān)閉狀態(tài)，通透性具有選擇性；當(dāng)其開放后，可允許各種離子和大分子自由通過線粒體膜。如長時(shí)間處于開放狀態(tài)，會引起線粒體腫脹和功能障礙，最終導(dǎo)致線粒體死亡。

MPTP 的開放與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切[50]。腦缺血再灌注期間MPTP 開放，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基和游離脂肪酸大量生成，以及興奮性氨基酸釋放等，造成線粒體合成障礙和形態(tài)變化，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。大鼠MCAO 30 min 后再灌注30 min，腦缺血后處理組腦梗死面積明顯減少，線粒體通透性轉(zhuǎn)換降低[51]，提示腦缺血后處理的腦保護(hù)作用可能與抑制MPTP 開放有關(guān)；遠(yuǎn)端缺血后處理的腦保護(hù)作用有時(shí)間依賴性，再灌注即刻缺血后處理保護(hù)作用明顯。另有研究顯示[52?53]，缺血再灌注會降低打開MPTP 所需的鈣離子濃度閾值，而遠(yuǎn)端缺血后處理可使其閾值趨向正常，從而抑制MPTP 的開放。MPTP有望成為治療缺血再灌注損傷的靶點(diǎn)。

5 小結(jié)

線粒體功能對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和缺血再灌注環(huán)境中細(xì)胞存活均有重要意義。遠(yuǎn)端缺血后處理操作簡單方便，有很好臨床應(yīng)用價(jià)值；隨著遠(yuǎn)端缺血后處理研究的不斷深入，線粒體機(jī)制正成為腦保護(hù)的研究熱點(diǎn)。

關(guān)于線粒體途徑的研究還有很多具體問題尚未解決。①動物模型：雖然多種動物模型研究都證明，線粒體途徑在對遠(yuǎn)端缺血后處理的腦保護(hù)中發(fā)揮重要作用，但不同模型得出的結(jié)論是否具有可比性，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。②遠(yuǎn)端缺血處理方式：研究者對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行遠(yuǎn)端缺血后處理的方式有所區(qū)別，其具體作用機(jī)制或通路未必相同。③時(shí)間窗：現(xiàn)有研究并未明確何時(shí)介入遠(yuǎn)端缺血后處理能對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮最大保護(hù)效應(yīng)。

為深入研究遠(yuǎn)端缺血后處理緩解腦缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制，未來研究應(yīng)闡明不同動物模型和處理方式的異同，揭示遠(yuǎn)端缺血后處理發(fā)揮明確效應(yīng)的時(shí)間窗，為腦卒中治療及改善預(yù)后提供新的治療靶點(diǎn)和方案。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。