小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的應(yīng)用進(jìn)展

邵紅蓮譚 韜

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500)

哺乳動物植入后胚胎發(fā)育的相關(guān)機(jī)制是發(fā)育學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn),小鼠是最易獲得且最具特征的哺乳動物胚胎發(fā)育模型。 哺乳動物的早期胚胎發(fā)育經(jīng)歷:受精卵→2-細(xì)胞→4-細(xì)胞→8-細(xì)胞→桑椹胚→囊胚→原腸胚幾個(gè)階段,植入后早期胚胎發(fā)育是指囊胚由輸卵管進(jìn)入子宮著床并繼續(xù)發(fā)育的過程[1-5]。 小鼠胚胎體外培養(yǎng)體系的成功建立,可以作為一個(gè)深入研究小鼠植入后胚胎發(fā)育的相關(guān)機(jī)制平臺,也可以作為其他哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)體系的建立及優(yōu)化的參考依據(jù)。

現(xiàn)階段已有較多小鼠植入前胚胎發(fā)育機(jī)制的相關(guān)研究,植入前胚胎發(fā)育過程的核基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白表達(dá)變化等問題都得到了比較詳細(xì)的解答[6]。 Xue 等[7]研究發(fā)現(xiàn),受精卵胚胎處于轉(zhuǎn)錄靜止?fàn)顟B(tài),其發(fā)育完全由母系提供的蛋白質(zhì)和來自卵漿的RNAs 控制,2 細(xì)胞期才發(fā)生重要的基因激活。桑椹胚時(shí)期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mess,ICM)和滋養(yǎng)外胚層(trophoblastic ectoderm,TE)分化形成囊胚的分子機(jī)制也較為詳盡[8-9]。

相較于眾多的植入前形態(tài)發(fā)生和信號通路的研究,植入期和植入后期的研究非常有限。 尤其是人類及非人類靈長類動物的胚胎,其植入期、植入后期的形態(tài)發(fā)生、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的特異性調(diào)控都未得到系統(tǒng)的研究。 由于人類胚胎14 d 原則的倫理限制以及難以獲取胚胎,小鼠胚胎成為眾多基礎(chǔ)研究的常用胚胎模型。 小鼠胚胎的體外延時(shí)培養(yǎng)體系不僅能夠解釋植入過程和植入后的胚胎發(fā)生事件,更為探索高級哺乳動物體外培養(yǎng)體系建立基礎(chǔ)。 該篇綜述對小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系進(jìn)行總結(jié),并對更高等的哺乳動物的體外培養(yǎng)體系發(fā)展提供更好的思路。

1 普通培養(yǎng)體系

目前常用的體外培養(yǎng)體系(in vitroculture,IVC)可大致分為兩類:IVC1 與IVC2。 IVC1 用于滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophoblast cells,TS)貼壁前的培養(yǎng),IVC2用于TS 貼壁后的培養(yǎng)。 目前很多實(shí)驗(yàn)室都在進(jìn)行小鼠的體外延時(shí)培養(yǎng),培養(yǎng)體系在不停的優(yōu)化,但依舊不能獲得穩(wěn)定的體系。

1.1 基于DMEM、Whitten 的體外培養(yǎng)體系

2011 年,Takaoka 等[10]使用 DMEM、Whitten 培養(yǎng)基培養(yǎng) E5.0-E5.5 和 E3.7 胚胎。 首先在添加50%胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)和25 mm HEPES-NaOH(pH 7.2)的 DMEM 中恢復(fù)胚胎。 隨后將E5.0-E5.5 胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,該培養(yǎng)基由75%大鼠血清和25% DMEM 緩沖44 mM NaHCO3(pH 7.2) 組成。 將 E3.7 胚胎轉(zhuǎn)移到改良的Whitten 培養(yǎng)基中。 胚胎在35 mm 的玻璃底塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。

1.2 基于CMRL1066 的體外培養(yǎng)體系

2012 年,Morris 等[11]人為了研究小鼠植入后胚胎前后軸的形成,建立了一套體外培養(yǎng)體系。 在該體系中,IVC1 的基礎(chǔ)成分為 CMRL1066、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、雙抗(青霉素和鏈霉素)、胎小牛血清(fetal calf serum,FCS)等。 IVC2 基礎(chǔ)成分與 IVC1相同,但使用人臍帶血清(human cord serum,HCS)替代了FCS。 該培養(yǎng)體系使用了聚丙烯酰胺凝膠與玻璃結(jié)合,并覆蓋各種蛋白質(zhì)涂層,以便能夠清晰地跟蹤前內(nèi)臟內(nèi)胚層的逐步發(fā)育。 但是凝膠制備的復(fù)雜性和HCS 分離難度使該方法難以廣泛應(yīng)用,而且來源不同的HCS 可能會導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果的不同。

1.3 基于Advanced-DMEM/F12 的體外培養(yǎng)體系

2014 年,Bedzhov[12]團(tuán)隊(duì)描述了一個(gè)支持小鼠胚胎發(fā)育至囊胚之后的體系,提供了一個(gè)新的分步培養(yǎng)方案,奠定了小鼠植入后胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的發(fā)展基礎(chǔ)。 在該研究中, 采用 Advanced-DMEM/F12 代替CMRL-1066,同時(shí)添加雙抗(青霉素和鏈霉素)、L-谷氨酰胺、β-雌二醇、孕酮、N-乙酰-I-半胱氨酸等成分。 為進(jìn)一步降低HCS 的需求,他們還添加了ITS-X 和敲除血清替代品(KnockOut serum replacement,KSR)。 IVC1 與 IVC2 均基于以上成分,二者最主要的區(qū)別在于,IVC1 使用FBS 作為胚胎的營養(yǎng)成分,而 IVC2 使用 KSR 替代 FBS。該研究還采用了特殊的光學(xué)材料(ibiTreat μ-plates,eight-well)作為基質(zhì),在體外將小鼠囊胚培養(yǎng)到卵圓柱階段,體外培養(yǎng)的胚胎形態(tài)以及譜系標(biāo)志物的檢測和正常體內(nèi)E6.5 相同。

在該研究中,Bedzhov 等[12]還嘗試了兩種培養(yǎng)方法。 第一種方法從早期囊胚開始,去除透明帶后,囊胚可以附著在基質(zhì)上,5 d 后發(fā)育成卵圓柱體；第二種方法是從晚期囊胚開始,在3 d 內(nèi)分離出的附壁TE 形成卵圓柱體,通過這種方法可以觀察到以前隱藏的發(fā)育時(shí)期。 他們使用的培養(yǎng)體系可用于直接監(jiān)測小鼠植入期胚胎譜系發(fā)生,胚胎生長等情況。 至此,小鼠胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系已初見規(guī)模,能夠很好的支持眾多小鼠胚胎研究。

2 3D 培養(yǎng)體系

早在幾十年前,研究者就觀察到,細(xì)胞在活體內(nèi)和培養(yǎng)皿中所處的微環(huán)境截然不同。 當(dāng)細(xì)胞系嵌入3D 基質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)板中時(shí)[13],細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的不同形態(tài)和生長特征[14]。 自此,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的一個(gè)重要進(jìn)展是引入了3D 培養(yǎng)系統(tǒng)。 與二維方法相比,3D 方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是減少了細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和體內(nèi)環(huán)境之間的差距,顯示出更接近復(fù)雜的體內(nèi)條件特征[15-17]。 在傳統(tǒng)的2D 條件下,對分化、增殖和細(xì)胞功能非常重要的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分、細(xì)胞間相互作用都會丟失[18]。 在3D 培養(yǎng)系統(tǒng)中,未分化細(xì)胞的存活率也得到了提高,這對研究與環(huán)境相關(guān)的物理化學(xué)因素對胚胎細(xì)胞的影響是有幫助的。

3D 支架是用各種天然(膠原蛋白、明膠、彈性蛋白、絲素蛋白、殼聚糖、甲殼素、纖維蛋白、纖維蛋白原等)和合成聚合物制成的,同時(shí)也包括一些公認(rèn)的天然和合成物質(zhì)的混合物。 常用的3D 支架材料有瓊脂糖、膠原、纖維連接蛋白、明膠、層粘連蛋白和卵黃蛋白。 這些復(fù)合材料在孔隙率、纖維、滲透性和機(jī)械穩(wěn)定性等物理特性方面模擬天然ECM。微結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了胚胎中粘附細(xì)胞的生物物理學(xué)和生物化學(xué)相互作用,使其在體外更好的表達(dá)相應(yīng)的基因。 3D 基質(zhì)為胚胎增殖、分化和分泌細(xì)胞特異性ECM 提供了一個(gè)生物活性環(huán)境[19]。 以下介紹了常用3D 基質(zhì)及其在胚胎培養(yǎng)當(dāng)中的用途。

2.1 基質(zhì)膠(matrigel)

Matrigel 在干細(xì)胞領(lǐng)域已經(jīng)有了充分的應(yīng)用,在胚胎培養(yǎng)當(dāng)中也有所嘗試。 Bedzhov 等[20]使用Matrigel 培養(yǎng)E3.5 胚胎的ICM。 該研究將單個(gè)ICMs滴入ibiTreat 顯微術(shù)塑料m 板中的基質(zhì)凝膠中,37℃孵育2～3 min,直至基質(zhì)凝膠凝固。 然后用加熱過的IVC1 培養(yǎng)基填充培養(yǎng)皿。 在以Matrigel 為基質(zhì)的3D培養(yǎng)體系當(dāng)中,TS 的發(fā)育更加接近于體內(nèi)的狀態(tài),可以在一定程度上模擬體內(nèi)的著床過程。

2.2 聚丙烯酰胺膠

Niu 等[21]評估了與玻璃結(jié)合并覆蓋各種蛋白質(zhì)涂層的聚丙烯酰胺水凝膠在3D 胚胎延時(shí)培養(yǎng)體系中的使用。 在該研究中,首先通過改變 N′N′-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酰胺的比例來優(yōu)化聚丙烯酰胺水凝膠的表面硬度,其次使用了不同的蛋白質(zhì)涂層。 采用I 型大鼠尾膠原涂層時(shí),87%(13/15)的胚胎可附著在基質(zhì)上,38%(5/13)的胚胎可發(fā)育成卵圓柱。 相比之下,層粘連蛋白或纖維蛋白-布朗寧與膠原結(jié)合使用時(shí),80%(12/15)的胚胎可以附著,41%(5/12)的胚胎可形成卵圓柱。 這些胚胎發(fā)育出正確的形態(tài)和外胚層(epiblast,EPI)、TE 和原始內(nèi)胚層(primitive endoderm,PrE),并且表達(dá)相應(yīng)的組織標(biāo)記基因。

2.3 3D 培養(yǎng)體系在其他哺乳動物中的應(yīng)用

Shao 等[22]基于人多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSC)的模型,建立了稱為植入后羊膜囊胚狀體(post-implantation amniotic sac embryoid,PASE),它能夠概括圍繞羊膜囊發(fā)育的多個(gè)植入后胚胎發(fā)生事件。 在沒有母體或胚胎外組織的情況下,PASE自組織形成一個(gè)具有不對稱羊膜EPI 的上皮囊腫,類似于人類羊膜囊。 在進(jìn)一步的發(fā)育過程中,PASE以SNAI1 依賴的方式啟動一個(gè)類似于后原條發(fā)育的過程。 此外,他們還發(fā)現(xiàn)到非對稱BMP-SMAD 信號與PASE 的發(fā)展同步,并證實(shí) BMP-SMAD 的激活/抑制調(diào)節(jié)了PASE 的穩(wěn)定發(fā)展。 該研究為小鼠胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)提供了新的思路,即構(gòu)建3D 的培養(yǎng)體系,為胚胎著床及著床后的發(fā)育提供可能的條件。 他們采用3D 培養(yǎng)體系來培養(yǎng)植入后人羊膜囊,其在8 孔板底部鋪有一層Matrigel,且在日常培養(yǎng)基中添加了ECM。 Matrigel 能夠向EPI 細(xì)胞提供極化信號,胚胎干細(xì)胞在Matrigel 內(nèi)培養(yǎng)后能夠形成類似體內(nèi)胚胎花環(huán)的EPI 結(jié)構(gòu),凋亡細(xì)胞數(shù)量也少于一般的二維培養(yǎng)[22]。

3D 培養(yǎng)體系在體外通過細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建類體內(nèi)環(huán)境,有效促進(jìn)了哺乳動物胚胎在體外的發(fā)育過程,進(jìn)而促進(jìn)胚胎前后軸形成動力學(xué)、胚胎滋養(yǎng)巨細(xì)胞與子宮內(nèi)膜相互作用等問題的理解[23]。 但3D 體系仍然不夠成熟,不能夠完全模擬小鼠胚胎體內(nèi)著床以及著床后的進(jìn)一步發(fā)育。 尋找更合適的3D 體系材料及其構(gòu)建方法、并將其與已知的維持胚胎的培養(yǎng)體系結(jié)合是該領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。 現(xiàn)如今,3D 打印技術(shù)逐漸成熟,能夠建立更加精細(xì)的結(jié)構(gòu),該技術(shù)將來可以被應(yīng)用于小鼠胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)的3D 體系的建立,也有可能進(jìn)一步為非人類靈長類動物和人類的胚胎的體外培養(yǎng)提供技術(shù)支持和研究基礎(chǔ)。

3 培養(yǎng)體系添加物

有研究者報(bào)道了小鼠囊胚到卵圓柱轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生事件,這些步驟將簡單的EPI 細(xì)胞球轉(zhuǎn)化為杯狀上皮細(xì)胞[12]。 Copp[24]揭示了體外囊胚著床后,TS 與ECM 的粘附強(qiáng)度隨時(shí)間而發(fā)生變化,這限制了極性細(xì)胞進(jìn)一步的體外發(fā)育,從而導(dǎo)致卵圓柱的形成。 Bedzhov 等[20]人發(fā)現(xiàn),胚胎外細(xì)胞系分泌的基底膜成分為PSC 提供了極化信號。這導(dǎo)致EPI 整體重組為玫瑰花狀結(jié)構(gòu),并伴隨管腔發(fā)生。 除了3D 體系,胚胎發(fā)育過程中,胚胎外細(xì)胞系分泌的細(xì)胞因子也會決定胚胎發(fā)育的質(zhì)量。 因此體外培養(yǎng)體系中的各類添加物對胚胎發(fā)生也發(fā)揮重要作用。

3.1 細(xì)胞因子

在囊胚(E3.5)中三種不同的細(xì)胞系TE、ICM中的EPI 和PrE 發(fā)育過程中,許多關(guān)鍵的譜系因子,如CDX2、POU5F1 和SOX17,分別在小鼠胚胎發(fā)育過程中表現(xiàn)出保守表達(dá)。 在小鼠體內(nèi)胚胎發(fā)育過程中,成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)信號和隨后的細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)途徑激活EPI 和PE 細(xì)胞的分化,最終分別產(chǎn)生胚胎固有細(xì)胞和卵黃囊。 在小鼠胚胎培養(yǎng)過程中抑制 FGF/MAPK 信號可增加 ICM 內(nèi)表達(dá) NANOG 細(xì)胞的比例,FGF 受體上調(diào)可導(dǎo)致ICM 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為GATA6陽性PE 前體。 IGF1 受體、IGF1 和胰島素受體分別在人 PE 和 EPI 中表達(dá),通過磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)/mTOR,可以維持胚胎內(nèi)細(xì)胞干性的通路,如對PE 發(fā)育有重要作用的FGF 通路[25]。 在小鼠胚胎培養(yǎng)基中,添加IGF 和EGF 有利于胚胎從透明帶孵出。 對小鼠胚胎研究表明,TGF-α 和EGF 能分別通過自分泌作用和旁分泌作用促進(jìn)囊胚腔的擴(kuò)張膨大。 IL-1、IL-6、CSF-1 以及 TNF-α 等生長因在人早期胚胎植入過程中擔(dān)任不同的角色,最終促進(jìn)胚胎成功著床以及后續(xù)的胚胎發(fā)育。 Niu 等[21]在體外建立了一個(gè)培養(yǎng)體系,在人胚胎培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,能夠?qū)⒏呒壊溉閯游锸承泛锏呐咛パ訒r(shí)培養(yǎng)至20 d,獲得的胚胎能夠出現(xiàn)譜系分化、胎盤形成、羊膜囊和卵黃囊成腔化以及原始生殖細(xì)胞分化等哺乳動物胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵事件。 他們通過ROCK 抑制劑Y-27632 促進(jìn)了猴胚胎的發(fā)育,減少胚胎內(nèi)細(xì)胞的凋亡。 因此細(xì)胞因子及其作用通路是優(yōu)化胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的重要研究方向。

3.2 激素及有機(jī)物

胚胎環(huán)境中的激素以及體內(nèi)環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)也對胚胎發(fā)育有著重要的作用。 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)在體內(nèi)可以吸附于TS 表面,保護(hù)TS 免受母體淋巴細(xì)胞的攻擊。 體內(nèi)hCG 的濃度也與囊胚發(fā)育質(zhì)量有顯著相關(guān)性。 在體外,孕馬血清促性腺激素和hCG 的合用可以在一定范圍內(nèi)增加小鼠胚胎的發(fā)育數(shù)量和發(fā)育率[26]。 雌激素也在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,其在小鼠胚胎的體外培養(yǎng)體系中都有添加。 ?；撬岷虴DTA 可以克服二細(xì)胞阻滯,一些氨基酸如谷氨酰胺也會參與蛋白質(zhì)、DNA 的合成,成為胚胎發(fā)育最初48 h 內(nèi)的重要能量來源,而且谷氨酰胺具有防止細(xì)胞氧化的功效,一些研究表明,在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺,可提高小鼠在體外的囊胚孵化率[27]。

4 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ε咛グl(fā)育的啟示

小鼠植入前胚胎體外培養(yǎng)體系較為成熟,能夠培養(yǎng)至原條出現(xiàn)階段。 但隨著囊胚的發(fā)育進(jìn)行,胚胎內(nèi)的細(xì)胞逐漸分化,所需求的信號分子也隨之發(fā)生改變。 這也對體外環(huán)境是否能夠支持不同細(xì)胞系的發(fā)育提出了更高的要求。 研究表明轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用對于胚胎發(fā)育成功的譜系分離是必不可少的[28-31]。 對早期胚胎的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)給胚胎發(fā)育領(lǐng)域帶來了很多新的啟發(fā)[25]。 scRNA-seq 在不到10 年的時(shí)間里飛速發(fā)展,該技術(shù)能夠揭示胚胎內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞各自的發(fā)育事件及其產(chǎn)生的變化,詳細(xì)研究特定基因和調(diào)控序列在發(fā)育中的作用。

4.1 胚胎發(fā)育的基因表達(dá)

Smart-seq2 技術(shù)的出現(xiàn)及優(yōu)化為胚胎發(fā)育的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了一個(gè)很好的平臺[32-34]。Mohammed 等[35]人通過對 E3.5 到 E6.5 小鼠胚胎進(jìn)行scRNA-seq 來研究從著床期到早期原腸胚形成的調(diào)控環(huán)境,以探索從植入前到早期原腸胚早期的小鼠發(fā)育。 有研究者將該方法直接應(yīng)用于E3.5 小鼠囊胚未分化ICM 中的單個(gè)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)細(xì)胞群,一個(gè)具有PrE 表達(dá),另一個(gè)具有多能性EPI 樣基因表達(dá)。 兩個(gè)群體間差異表達(dá)的基因在胚胎中E4.5 在形態(tài)分化的PE 和EPI 中得到了很好的保存,表明該方法成功地檢測到了表面上同質(zhì)的細(xì)胞群體在單細(xì)胞水平上細(xì)微但本質(zhì)的差異[36-37]。 為了建立小鼠囊胚ICM 內(nèi)EPI 與PrE 譜系分離的圖譜,Ohnishi 等[38]描述了單個(gè)ICM 細(xì)胞的基因表達(dá)譜。 這項(xiàng)研究提出了一個(gè)模型,即ICM 中細(xì)胞基因的表達(dá)水平出現(xiàn)隨機(jī)變異,且彼此獨(dú)立,隨后通過一系列信號通路增強(qiáng)支持了ICM 譜系分離。 眾多胚胎scRNA-seq 是胚胎內(nèi)細(xì)胞群體的鑒定強(qiáng)有力的工具,為細(xì)胞命運(yùn)的溯源提供證據(jù)。

4.2 胚胎發(fā)育的細(xì)胞命運(yùn)圖譜

體內(nèi)哺乳動物細(xì)胞分化軌跡的全面描繪代表胚胎發(fā)育過程中基因表達(dá)變化的基線,其可用于再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)化體外分化方案的參照[39]。 Scialdone等[39]通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析小鼠胚胎早期中胚層分化的問題。 傳統(tǒng)的多細(xì)胞DNA 分析的實(shí)驗(yàn)方法依賴于細(xì)胞數(shù)較多的樣本,不適合胚胎早期譜系多樣性的研究。 為了解決這個(gè)問題,他們使用scRNA-seq 研究了1205 個(gè)中胚層單細(xì)胞向造血系統(tǒng)的分化過程,涵蓋了從E6.5 早期原腸胚形成到E7.75 原始紅細(xì)胞生成的時(shí)間過程。 在E6.5 小鼠胚胎中,位于PrE 和EPI 交界處的細(xì)胞經(jīng)歷上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。 隨后,細(xì)胞發(fā)生遷移進(jìn)而獲得不同的細(xì)胞命運(yùn),或圍繞著EPI,或進(jìn)入PrE 形成卵黃囊、臍帶和胎盤。 細(xì)胞命運(yùn)圖譜顯示,成熟組織,如血液和心臟,起源于原腸胚前成纖維細(xì)胞的特定區(qū)域,但仍然不清楚胚胎中眾多細(xì)胞的命運(yùn)是如何決定的[40]。

Pijuan-Sala 等[40]報(bào)告了在受精后 6.5 ～ 8.5 d的九個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)收集的來自小鼠胚胎的116,312個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜。 構(gòu)建了從多能性向所有主要胚胎譜系的細(xì)胞分化的分子圖譜,并探討了內(nèi)臟和原條衍生、內(nèi)胚層融合的復(fù)雜事件[39]。 Cao 等[41]分析了在妊娠9.5～13.5 d 之間的61 個(gè)胚胎大約200萬個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄體。 由此產(chǎn)生的“小鼠器官發(fā)生細(xì)胞圖譜”(MOCA)提供了這一關(guān)鍵時(shí)期發(fā)育過程的全局視圖[41-42]。 scRNA-seq 為追蹤胚胎發(fā)育過程的所有細(xì)胞命運(yùn)提供了可能,而且該領(lǐng)域還需要更深入的研究去完善其他哺乳動物胚胎譜系分化圖譜。

4.3 其他哺乳動物胚胎發(fā)育的單細(xì)胞測序研究

與此同時(shí),眾多研究者對高級哺乳動物的胚胎也進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究,探索胚胎發(fā)育的復(fù)雜機(jī)制。 EPI 是哺乳動物所有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的起源。 為了探索人類和靈長類多能性的個(gè)體發(fā)育,Nakamura 等人[43]對食蟹猴(Macaca fascicularis)植入前和植入后的EPI 進(jìn)行了全面的scRNA-seq。 結(jié)果表明,在囊胚發(fā)育過程中,食蟹猴EPI 在著床過程中發(fā)生了重要的轉(zhuǎn)錄組變化。 該研究不僅揭示了EPI 發(fā)育的差異性和一致性,而且確定了關(guān)鍵物種間多能性譜的發(fā)育坐標(biāo),為更好地建立人胚胎的培養(yǎng)體系提供了線索。 Zhou 等人[44]結(jié)合體外培養(yǎng)的胚胎發(fā)育和scRNA-seq,系統(tǒng)分析了來自人的65 個(gè)移植前后胚胎的8000 多個(gè)單個(gè)細(xì)胞。 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的無監(jiān)督降維和聚類算法顯示了EPI、PrE 和TE 譜系的逐步植入路徑,表明胚胎在植入過程中為著床于子宮內(nèi)膜做好了充分準(zhǔn)備。 該研究提供了對調(diào)節(jié)人類胚胎植入的復(fù)雜分子機(jī)制的理解,并有助于推進(jìn)未來對早期胚胎發(fā)育和生殖醫(yī)學(xué)的理解。 眾多的測序研究結(jié)果揭示了小鼠、高級哺乳動物以及人胚胎發(fā)育過程中的復(fù)雜路徑,同時(shí)其詳盡的轉(zhuǎn)錄組信息為體外延時(shí)培養(yǎng)獲得的胚胎發(fā)育譜系提供了很好的參照標(biāo)準(zhǔn),也為解析發(fā)育過程的分子機(jī)制提供了有力的支持。

5 結(jié)論與展望

胚胎是生命的起源,理解胚胎的發(fā)育歷程有助于研究高等動物的發(fā)育過程。 小鼠胚胎以其哺乳動物的胚胎特性和較短的發(fā)育時(shí)間等優(yōu)勢,成為了很好的胚胎研究的模型。 猴胚胎、人胚胎的植入發(fā)育研究都是建立在小鼠胚胎的模型上來開展的。建立體外延時(shí)培養(yǎng)的小鼠胚胎體系,有助于我們更好的理解哺乳動物在著床后所經(jīng)歷的事件,揭示胚胎發(fā)育的過程。 高級哺乳動物以及人胚胎的延時(shí)培養(yǎng)研究能夠反哺小鼠胚胎體外延時(shí)培養(yǎng)體系的有效建立。

總之,植入后胚胎體外培養(yǎng)這個(gè)領(lǐng)域在胚胎發(fā)育過程的研究中是至關(guān)重要的。 目前針對胚胎的體外培養(yǎng)技術(shù)還存在不足,需要更多的研究投入。未來的研究需要更多地理解胚胎發(fā)育的機(jī)制以及發(fā)育過程中的事件,這可以為生殖醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域提供相應(yīng)的基礎(chǔ),也可以幫助我們理解生殖醫(yī)學(xué)中的多種問題,例如胚胎受孕后的流產(chǎn)、胚胎與子宮內(nèi)膜的交互作用以及移植胚胎吸收等相關(guān)事件。