心肌肥厚動物模型及代償機制研究進展

劉夢迪張連峰呂 丹*

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021；2.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,北京 100021)

心肌肥厚通常是作為對血流動力學壓力或心肌損傷的適應性反應而引發(fā)的[1-2],表現(xiàn)為心肌質(zhì)量增加,收縮力增加,對增強心臟功能、降低心室壁張力和耗氧量具有補償作用,有助于維持心輸出量,維持正常的血液循環(huán),是一種緩慢發(fā)展的有效代償功能。 在細胞學方面,心肌肥厚的特點是心肌細胞變大,肌節(jié)結構分離,蛋白質(zhì)合成增強以及胎兒基因重新表達。 在心肌肥厚的超聲心動圖中可觀察到增厚的室間隔,縮小的左心室腔,變窄的左室流出道,且二尖瓣前葉收縮期前移,主動脈瓣收縮中期呈現(xiàn)出部位性關閉等。 雖然心肌肥厚最初可能是代償性和適應性的,在心血管疾病的早期階段可以提供某些益處,但長期病理學心肌肥厚將改變心臟基因的表達,細胞間肌纖維和血管周圍纖維化及功能障礙,從而導致失代償,心力衰竭和猝死的發(fā)生率增加。 目前的研究表明,腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑(renin-angiotensin system inhibitor,RASI)、β 受體阻滯劑(beta blocker,BB)、血管緊張素轉化酶抑制劑、他汀類藥物等對心肌肥厚有一定的治療效果。 RASI 和BB 聯(lián)合拮抗交感神經(jīng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng),對心室的重構、新功能的改善以及遠期預后等方面有益[3-7]。 本文對心肌肥厚動物模型及代償失代償分子機制的研究進展進行了歸納總結。

1 心肌肥厚動物模型及制備方法

心肌肥厚動物模型已經(jīng)在小鼠、大鼠、犬、羊、豬等物種中建立,小鼠及大鼠的優(yōu)點是基因背景信息齊全,商品化試劑豐富,同時經(jīng)濟且易飼養(yǎng)。 大動物的優(yōu)點是操作容易,重復性好,對動物造成的損傷較小,存活率高,并且更符合人體解剖和血流動力學的特點,尤其是豬。

1.1 大鼠心肌肥厚模型

目前大鼠模型在心臟損傷相關研究中仍占主導地位,它們較大的尺寸極大地促進了手術操作和術后研究,其心肌肥厚模型的建立采取物理法、化學法和生物法。

1.1.1 物理法

物理法包括壓力超負荷法、容量負荷法、心肌梗死和運動致心肌肥厚[3]。

壓力超負荷法主要包括:(1)主動脈縮窄法(transverse aortic constriction,TAC):在大鼠無名動脈和左頸總動脈之間結扎主動脈弓,經(jīng)過4 周形成明顯的左心室心肌肥厚；(2) 腹主動脈縮窄法(abdominal aortic constriction,AAC):在大鼠的腹腔動脈和腸系膜前動脈之間進行結扎,得到重建后的直徑為0.55 mm。 在AAC 術后進行超聲心動圖檢查,同時結合組織學和血漿腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平綜合評判,術后第4 周誘導左心室心肌肥厚。 (3)腎型高血壓法[8-10]:把左腎動脈用內(nèi)徑為0.2 mm 的銀夾夾住,造成腎缺血,使腎內(nèi)產(chǎn)生腎素,增加血內(nèi)的血管緊張素Ⅱ含量,致使高血壓形成,長期刺激而產(chǎn)生心肌肥厚。 術后避免感染需給予青霉素,4 周后在清醒狀態(tài)無創(chuàng)收縮壓≥160 mmHg 者為造模成功。 該方法的優(yōu)點在于同人類的病理模型相似,由于高血壓比較穩(wěn)定,可逐漸形成心肌肥厚,因此該模型也常被用來研究心肌肥厚。

容量負荷法包括:(1)動靜脈造瘺法:腹部正中進行切口,在其左腎動脈下面分離出腹主動脈和下腔靜脈,血管夾夾斷血流。 9 號靜脈注射針依次穿過下腔靜脈壁和動靜脈聯(lián)合壁,鮮紅色動脈血流出后將針頭退出,然后進行縫合。 造瘺成功的標志為松開血管夾后,見下腔靜脈紅色血流,這種方法4～5周可形成心肌肥厚；(2)DOCA 鹽敏感性高血壓法[11]:切除大鼠的左腎,在術后1 周皮下植入含去氧皮質(zhì)醇(deoxycortisol,DOCA) 的微泵或注射DOCA,按照50 mg/kg 連續(xù)每天給藥,持續(xù)9 周,術后8 周便可形成心肌肥厚。

心肌梗死致心肌肥厚采用冠狀動脈結扎、堵塞或促進冠狀動脈血栓形成等方法[12-13],有研究顯示在結扎冠狀動脈左前降支一周后可見心肌肥厚。

運動致心肌肥厚[13-14]包括:(1)跑輪訓練致心肌肥厚:在有一定阻力的跑輪上無外界干擾進行自主訓練,跑步距離在2～4 周達到每天10 ～15 km,此時距離最長,之后為每天小于4 km,3 ～4 周可觀察到心肌肥厚；(2)游泳訓練致心肌肥厚:對大鼠進行每日2 次,每次1 h,每周5 d,為期8 周的游泳訓練,可見發(fā)生顯著的心肌肥厚。

1.1.2 化學法

化學法是利用化學試劑或藥物對動物機體產(chǎn)生作用而誘發(fā)動物疾病[15-17]。 化學法誘發(fā)心肌肥厚主要是藥物誘導法,該方法需要的時間短、操作簡便且心肌肥厚可很快形成、出現(xiàn)明顯的心肌病變。 具體操作過程即給受試動物注射或在皮下植入滲透泵等,使其在某一種藥物的持續(xù)刺激下形成心肌肥厚。 主要用的藥物有去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、去氧腎上腺素(phenylephrine,PE)、異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)、 甲 狀 腺 素、 血 管 緊 張 素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)等。

1.1.3 生物法

生物法目前有自發(fā)性高血壓大鼠模型[10]。 自發(fā)性高血壓大鼠在出生之后,隨著時間變化,血壓不斷升高,心肌質(zhì)量在4 周時開始增加,血壓在3～4個月時穩(wěn)定升高,心肌肥厚加重。

1.2 小鼠心肌肥厚模型

上面闡述的大鼠制備方法,在小鼠上亦可獲得心肌肥厚,同時,小鼠是目前基因修飾種類最為豐富的物種,在研究基因功能及相關發(fā)病機制方面應用最為廣泛,通過基因修飾可以獲得遺傳性心肌肥厚模型。 此外,在感興趣基因的基礎修飾小鼠上給予心肌肥厚刺激,是小鼠心肌肥厚模型未來的主要研究方向。

基因修飾獲得心肌肥厚包括:1)肌球蛋白突變模型:2 條重鏈(MHC)和2 條輕鏈(MLC)一同構成肌球蛋白,MHC 又有 α 和 β 兩種亞型。 小鼠 α-MHC 基因第403 密碼子錯義突變會致使其左心房心肌肥厚；2)肌球蛋白結合蛋白C(MYBPC)突變模型:小鼠的心肌肥厚可由MYBPC 的缺失、插入或剪接位點的突變等致使；3)肌鈣蛋白突變[18]:小鼠TnT 突變,該突變導致TnT 外顯子缺失小鼠表現(xiàn)出較小的左心室,嚴重的舒張期和較輕的收縮功能障礙。

1.3 大型動物心肌肥厚模型

嚙齒類動物與人類的心臟在結構、心率、耗氧量、收縮力、蛋白質(zhì)表達等方面都存在差異,因此,大型動物心肌肥厚及代償失代償模型的建立具有重要研究價值。

大型動物除了上面闡述的DOCA 鹽敏感性高血壓法、化學法外,其特有的心肌肥厚模型建立方法有:1)二尖瓣返流(mitral regurgitation,MR)致心肌肥厚:常用的實驗動物為犬或羊。 該方法采用胸內(nèi)或開胸手術斷裂動物瓣膜上的腱索來破壞二尖瓣,前者借助超聲定位,用心肌活檢鉗將二尖瓣前葉緣上一條腱索夾斷；后者需在胸骨正中切口,將心包切除,金屬器械插進左心室心尖或切開心房來將腱索破壞,從而造成二尖瓣關閉不全,致使心肌肥厚；2)主動脈束帶法[19]:常用的實驗動物為豬。該方法是進行手術干預,通過結扎或夾子(主動脈束帶)部分阻塞升主動脈或降主動脈,然后突然增加閉塞前壓力,通過束帶逐漸形成主動脈縮窄以及肺動脈或腎動脈狹窄,從而引起左心室肥厚。

2 心肌肥厚分子機制研究進展

心肌肥厚通常是作為對血流動力學壓力或心肌損傷的適應性反應而引發(fā)的,即心臟為適應各類刺激而發(fā)生的心肌質(zhì)量增加,體積增大。 在初始的代償階段,心室容積輕微增大,肥大的心肌細胞收縮和舒張的時間變長,速度變慢,但仍可保持良好的肌纖維縮短和心室排空能力。 心肌肥厚是很多心臟疾病發(fā)展的一個重要階段,但它的形成機制仍不完全清楚,目前有關的研究都集中在一些通路上。

2.1 有絲分裂蛋白激酶(MAPKs)信號通路

MAPK 信號通路包括以下分支:1)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERKs):ERK 分支的信號通常在細胞膜上與Ras 激活協(xié)同啟動。 Ras 與Raf 偶聯(lián),之后偶聯(lián) MAPK 激酶MEK1 和MEK2,MEK1/2 作為雙重特異性激酶起作用,可直接磷酸化ERK1 和ERK2 激酶中的TEY基序；2)c-Jun N 末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNKs):MAPK 激酶激酶的激活,如MEKK1,促進雙重特異性激酶MKK4 和MKK7 的激活,進而直接磷酸化JNK 蛋白中的 TPY 基序；3)p38 激酶[20]:p38激酶中的TGY 基序可以通過激酶之間的偶聯(lián)被磷酸化而發(fā)揮作用。 在心肌細胞中,上述三個MAPK分支中的每一個都由G 蛋白偶聯(lián)受體(G proteincoupled receptors,GPCRs)通過神經(jīng)內(nèi)分泌因子如血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1 和兒茶酚胺來調(diào)節(jié),此類激活特征表明MAPK 信號介導或調(diào)節(jié)心臟肥大反應。

2.2 Ca2+介導的信號通路

在細胞內(nèi),增多的Ca2+可致使心肌肥厚,這可以作為最基本的信號。 其主要機制有:(1)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin,CaN)信號通路[21-23]:CaN 直接與細胞質(zhì)中活化T 細胞(nuclear factor of activated T cells,NFAT)轉錄因子的核因子結合并使其去磷酸化,從而使它們易位至細胞核中,介導肥大基因的表達；(2)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶信號通路:鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II 受Ca2+鈣調(diào)蛋白復合物和ROS 的調(diào)節(jié),交換蛋白被cAMP 激活,直接誘導心臟肥大。

2.3 蛋白激酶信號通路

蛋白激酶信號通路有[24-26]:1)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信號通路:Akt1 短期激活通過協(xié)調(diào)上調(diào)VEGF 的表達誘導生理性肥大,而Akt1 長期激活促進病理性肥大；2)蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)及其介導的信號通路:PKC 在發(fā)揮作用時,一方面可以直接移入細胞核調(diào)節(jié)核基因的表達,另一方面可以在胞漿內(nèi)通過活化 Raf-1 與MAPK 信號通路偶聯(lián)。 有研究表明,α-腎上腺素能受體通過Gq-磷脂酶C 途徑激活PKC,這是對心臟肥大的有效刺激。

2.4 Janus 激酶(JAK)/信號轉導子和轉錄激活子(STAT)信號通路

心肌表達多種IL-6 家族細胞因子[26-27]。 JAK/STAT 通路可以在IL-6 細胞因子與糖蛋白130 結合之后被激活,進而參與細胞生物過程。 研究證實,激活的JAK-STAT 通路可以致使心肌肥厚,并與心肌梗死、擴張性心肌病等相關。

2.5 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路

AMPK 是細胞中的節(jié)點能量傳感器,可以隨著營養(yǎng)利用而協(xié)調(diào)代謝輸出的增加。 AMPK 是一種異源三聚體蛋白激酶,由催化性α 亞基、連接α 和γ的β 亞基和結合糖原組成,γ 亞基以相互排斥的方式結合 AMP、ADP 或 ATP。 AMPK 通過構象變化導致其活化[28]。 能量水平下降導致 AMP 激活AMPK,通過刺激脂肪酸氧化,葡萄糖攝取和糖酵解及減少依賴于ATP 的過程來促進轉錄和蛋白質(zhì)合成。 因此,AMPK 對心臟動態(tài)平衡至關重要,大多數(shù)研究表明,長期抑制AMPK 會加劇病理性肥大,導致心力衰竭,而間歇性AMPK 激活可能具有心臟保護作用。

2.6 MicroRNAs(miRNAs)信號通路

MicroRNA(miRNA)的功能是使特定的mRNA轉錄功能沉默[29]。 單個miRNA 可能具有數(shù)十至數(shù)百個靶基因,并且有越來越多的證據(jù)表明miRNA 在心臟發(fā)育、肥厚和衰竭中起作用。

3 心肌肥厚失代償分子機制研究進展

流行病學的研究表明,心臟正常的心肌肥大隨著時間的推移會降低心臟的功能,導致組織學纖維化、Ca2+處理蛋白失調(diào)、線粒體功能異常、心肌細胞損傷、舒張功能障礙和縱向收縮功能均惡化,發(fā)展為“心肌肥厚失代償”,并在臨床上會導致心力衰竭。 心肌肥厚失代償?shù)姆肿訖C制研究主要集中在經(jīng)典信號傳導通路、細胞的生長與凋亡以及心肌細胞的鈣代謝等方面。

3.1 經(jīng)典信號傳導通路

3.1.1 血管緊張素Ⅱ系統(tǒng)及其信號通路

受體1(AT1)和受體2(AT2)是 Ang Ⅱ的受體[30-31],一些通路可在AngⅡ與AT1 結合后活化,而細胞生長的抑制及細胞凋亡均與AT2 有關。

3.1.2 G 蛋白和環(huán)磷酸腺苷(cAMP)

研究表明,Gq 通過參與AngⅡ等誘導的信號傳遞來阻止Akt 磷酸化,則致使心肌細胞凋亡增強,造成心臟的功能失調(diào)。 在β 腎上腺能受體激活后,腺苷酸環(huán)化酶被Gsα 亞單位激活產(chǎn)生cAMP,可以活化蛋白激酶A(protein kinases A,PKA)。 PKA 可以磷酸化多種與心肌功能有關的蛋白質(zhì)[32-33]。

3.1.3 生長因子及其信號傳導通路

多數(shù)生長因子受體是跨膜受體酪氨酸激酶,經(jīng)過 Ras、Raf、MEK、ERK 途徑活化轉錄因子,調(diào)節(jié)核內(nèi)基因的表達。 生長因子 FGFs、IGFs、PDGFs、TGFs[34],均會使得心肌細胞肥大。

3.2 細胞凋亡

細胞凋亡在調(diào)節(jié)細胞數(shù)量和結構重塑中發(fā)揮重要作用[35]。 有研究顯示,細胞凋亡致使的心肌細胞丟失,會引發(fā)心功能失調(diào),發(fā)展下去致使心衰,這說明細胞凋亡在心肌肥厚代償向失代償發(fā)展的過程之中起作用。

3.3 心肌細胞的鈣代謝

鈣代謝與心肌細胞舒縮聯(lián)系緊密[36]。 心肌鈣的鈣釋放是鈣離子通過細胞表面的L-型鈣離子通道(LCC) 內(nèi)流,激活肌質(zhì)網(wǎng)上的雷諾定受體(ryanodine receptor,RyR),促進肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子流入胞質(zhì),從而引起胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時增加,其控制著心肌收縮的力量,研究表明在心臟肥大及失代償進程中心肌鈣釋放失調(diào)發(fā)揮了重要作用。

4 結語

多年來,國內(nèi)外文獻報道了很多種心肌肥厚動物模型的建立方法,即壓力超負荷法、容量負荷法、藥物誘導法、基因修飾法等。 心肌肥厚動物模型的成功率、和人的相似程度都在逐漸提高,這對心肌肥厚的研究具有推動作用。

心肌肥厚可致使血壓降低、心肌細胞肥大和凋亡,心室順應性下降以及射血功能受損,從而使得心臟功能惡化。 總而言之,心肌肥厚已經(jīng)是心血管疾病領域內(nèi)越來越重要的因素,所以探索其機制尤為重要。 很多研究證明其過程與一些信號通路有關,這些信號通路交織在一起,信號通路效應因子之間相互作用,形成一個復雜的網(wǎng)絡。 雖然在分子機制方面已經(jīng)取得很大進展,但許多問題仍未完全清楚,需要進一步探究。