調(diào)控PTEN表達(dá)和活性的研究進(jìn)展*

祁閃閃，楊 李，盧文婕，孫 鳴，宋 娜，陳 智，熊 昊

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院武漢兒童醫(yī)院血液腫瘤科，湖北武漢 430015）

人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）是一個經(jīng)典的抑癌基因，位于染色體10q23.3，其編碼區(qū)含有1 209個堿基，編碼一個含有403 個氨基酸的蛋白。PTEN 蛋白含有4 個重要的功能區(qū)域：（1）N末端結(jié)構(gòu)域，是PTEN蛋白N端的32個氨基酸組成的短肽，含有核定位序列；（2）催化結(jié)構(gòu)域，由第7～185位氨基酸殘基在內(nèi)的179個氨基酸組成，負(fù)責(zé)PTEN 的去磷酸化活性；（3）C2 結(jié)構(gòu)域，由第186～351位氨基酸殘基在內(nèi)的186個氨基酸組成，主要介導(dǎo)PTEN蛋白插入和錨定到脂質(zhì)雙分子層；（4）尾區(qū)，包含第352～403 位氨基酸殘基在內(nèi)的肽段，該區(qū)域富含絲氨酸和蘇氨酸，參與調(diào)控PTEN 的穩(wěn)定性和磷脂酶活性。PTEN 尾區(qū)最后4 個（第400～403 位）氨基酸即ITKV，被稱為PDZ 結(jié)合基序（PDZ-binding motif，PDZ-BM），這一肽段介導(dǎo)PTEN與含有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白的相互結(jié)合。

PTEN 的氨基酸序列決定了其可以在胞漿和胞核之間動態(tài)穿梭的特性。而胞漿的PTEN 和胞核的PTEN 在腫瘤抑制方面扮演著不同的角色。胞漿中的PTEN 通過去磷酸化作用，將磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate，PIP3）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphati?dylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2），從而拮抗磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）通路的活性。因此，胞漿PTEN 的丟失可以導(dǎo)致PIP3 的累積并激活下游通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長、增殖、代謝和遷移［1-2］。而胞核PTEN 的磷脂酶活性對維持染色體的完整性是必須的［3］。胞核PTEN 位于著絲粒附近，與著絲粒蛋白C（centromere protein C，CENP-C）協(xié)同作用，作為在有絲分裂時染色體分離所需動粒的重要組分，維持染色質(zhì)的穩(wěn)定性［3］。最近的研究表明，PTEN 的PDZ-BM 與腫瘤抑制蛋白DLG1（disc large homolog 1）/驅(qū)動蛋白EG5（kinesin EG5，EG5）直接的相互作用可調(diào)節(jié)紡錘體極體的組成和運動。PDZBM缺乏的細(xì)胞傾向于出現(xiàn)染色體的錯配，而且PDZ-BM缺失的小鼠易患淋巴瘤和乳腺癌［4-5］。

與一些經(jīng)典的抑癌基因需要完全缺失才能誘發(fā)癌癥的現(xiàn)象不同，PTEN 功能的部分丟失便可對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。在本文中，我們將對近些年來已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控PTEN 表達(dá)水平和酶活性的轉(zhuǎn)錄前與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制進(jìn)行概述。

1 PTEN蛋白翻譯后修飾調(diào)節(jié)

PTEN蛋白C端360-385肽段絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化可以增加PTEN 的蛋白穩(wěn)定性或降低PTEN 的磷脂酶活性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有10 多種胞內(nèi)激酶可以直接對PTEN 進(jìn)行磷酸化。其中，酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）和糖原合成酶激酶3β（glyco?gen synthase kinase-3β，GSK-3β）是重要的兩個磷酸激酶，分別對PTEN 的S380-S385（集簇Ⅰ）和S361-S370（集簇Ⅱ）兩個肽段進(jìn)行磷酸化。在集簇Ⅰ中，磷酸化的順序為S385＞S380＞T383＞T382；在集簇Ⅱ中，磷酸化的順序為S370＞T366＞S362＞S361＞T363。這些位點的磷酸化掩蓋了PTEN 蛋白N 端的催化結(jié)構(gòu)域與C 端的C2 結(jié)構(gòu)域分子內(nèi)的相互作用［6-8］。將常發(fā)生磷酸化的5 個位點T366、S370、S380、T382 和T383 替換為丙氨酸可明顯使PTEN 的半衰期降低6倍［9］。與之類似，PTEN 整個C 端的截短也可明顯降低其穩(wěn)定性［10］。這可能是因為PTEN 蛋白C 端的磷酸化使其呈現(xiàn)出一種閉合狀態(tài)，而保護(hù)了PTEN蛋白對水解敏感的部位。雖然上述的磷酸化可以增加PTEN 蛋白的穩(wěn)定性，但S361/S380/T382/T383 或S385 的磷酸化卻可以降低PTEN 對底物PIP3 的去磷酸化活性［11-12］?？偟膩碚f，PTEN 的磷酸化調(diào)控機制部分解釋了：為什么在一些急性T 淋巴細(xì)胞白血病中，即使白血病細(xì)胞高表達(dá)非突變的PTEN，PI3KAKT信號通路仍處于高激活的狀態(tài)［13］。

雖然磷酸化PTEN 的激酶對調(diào)控PTEN 發(fā)揮著重要的作用，但是使PTEN去磷酸化的磷脂酶也有同等重要的作用。據(jù)報道，PTEN 可以通過其去磷酸化的活性對自身的T366 位點進(jìn)行去磷酸化［14］。其他的磷脂酶，例如蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）可以被N-Myc 下游調(diào)節(jié)基因2（N-Myc downstream regulated gene 2，NDRG2）招募，對PTEN進(jìn)行去磷酸化［15］。在T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中，經(jīng)常由于NDRG2 的低表達(dá)而使PTEN 在S380/T382/T383殘基磷酸化水平增加，進(jìn)而增強PI3K-AKT信號通路的活化［15］。

PTEN 與多數(shù)蛋白類似，其賴氨酸殘基的單泛素化可調(diào)節(jié)蛋白的功能，而賴氨酸殘基的多泛素化則介導(dǎo)蛋白的蛋白酶體降解。PTEN 蛋白賴氨酸殘基的泛素化集中在N 端。據(jù)報道，K13 或K289 的單泛素化以及K254的類泛素化都可以促進(jìn)PTEN 的胞核轉(zhuǎn)移和駐留［16-17］。NEDD4-1（neural precursor cell ex?pressed，developmentally downregulated 4-1）和X 連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis pro?tein，XIAP）是PTEN 單泛素化E3 連接酶［18-19］；E3 連接酶活化STAT 蛋白抑制物χα（protein inhibitor of activated STAT χα，PIASχα）則負(fù)責(zé)PTEN 的類泛素化［20］；而負(fù)責(zé)PTEN 去泛素化的是皰疹病毒相關(guān)性泛素特異性肽酶（herpesvirus-associated ubiquitin-spe?cific peptidase，HAUSP）［21］。PTEN 上述賴氨酸位點的去泛素化促進(jìn)PTEN從胞核向胞漿轉(zhuǎn)移［21］。

PTEN 是一個相對較穩(wěn)定的蛋白，其半衰期長于12 h［10］。K13 和K289 的多泛素化與其蛋白酶體調(diào)節(jié)的降解密切相關(guān)。泛素特異性肽酶11（ubiquitinspecific peptidase 11，USP11）負(fù)責(zé)多泛素化PTEN 的去泛素化，使PTEN 免于蛋白酶體的降解。USP11缺失的小鼠易于發(fā)生PTEN 相關(guān)的腫瘤［22］。目前，以E3 泛素連接酶為靶點的藥物正在被研究，以期通過抑制PTEN 的降解，上調(diào)PTEN 的蛋白水平，用于人類腫瘤的治療。

2 PTEN mRNA的調(diào)節(jié)

在多種腫瘤中，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是促進(jìn)PTEN mRNA 降解的重要機制。有多種miRNA 可以結(jié)合在PTEN 的3′-UTR，其中最重要的一個是miR-21。miR-21 在人腫瘤中常高表達(dá)，而且可以直接靶向PTEN 的mRNA，負(fù)性調(diào)節(jié)PTEN的蛋白水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲［23］。其他的miRNA，例如miR-23a［24］、miR-26a［25］、miR-92a［26］、miR-130a［27］、miR-205-5p［28］和miR-221［29］也可以負(fù)性調(diào)控PTEN 的蛋白表達(dá)，激活PI3K-AKT 信號通路而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是真核生物中最常見的mRNA 修飾［30-31］。甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3（methyltransferase like protein 3，METTL3）和METTL14，負(fù)責(zé)將m6A 共價修飾到mRNA 上。目前，m6A 修飾對PTEN mRNA的調(diào)控尚不清楚。但是，有研究報道METTL3 可以調(diào)控包括PTEN在內(nèi)的多種基因的表達(dá)［32］。而且，METTL3的缺失可以導(dǎo)致m6A 甲基化的PTEN mRNA水平降低，以及PTEN 蛋白表達(dá)下調(diào)。這提示m6A 甲基化或許參與PTEN表達(dá)的調(diào)控。

可變剪接（alternative splicing，AS）是常見的PTEN mRNA 轉(zhuǎn)錄后的加工修飾，增加了轉(zhuǎn)錄本的多樣性。PTEN 存在多種剪切異構(gòu)體（splice variant，SV）。早期的研究在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和前列腺細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的兩種PTEN SV 分別是PTEN-Δ和PTEN-B［33］。這兩種PTEN SV 都有C 端的缺失，由于穩(wěn)定性降低，降解迅速，所以幾乎沒有磷酸酯酶活性。近期研究提示，Cowden 綜合征的致病機制與PTEN SV 胚系異常有關(guān)，在部分患者中存在3、4 或6 號外顯子缺失的PTEN SV，導(dǎo)致PTEN 蛋白水平下調(diào)。但最近在腎細(xì)胞癌中的研究表明，PTEN-Δ 與全長的PTEN 類似，具有腫瘤抑制的作用，高表達(dá)PTEN-Δ的患者具有更好的無轉(zhuǎn)移生存期和總生存期［33］。PTEN-L 是最近發(fā)現(xiàn)的一種PTEN SV，包含了PTEN 所有的結(jié)構(gòu)域，但在N 端額外有一段173 個氨基酸的可變翻譯區(qū)域（alternately translated region，ATR）［34］。PTEN-L 的ATR 包含了可變剪切位點的信號肽，這使得PTEN-L可以被分泌至細(xì)胞外。在人血漿和血清及人源性細(xì)胞的培養(yǎng)上清中都可以檢測到PTEN-L。PTEN-L 的ATR 還包含一個類似于細(xì)胞滲入性多肽的聚精氨酸基序，使得PTEN-L 能夠進(jìn)入細(xì)胞。類似于胞內(nèi)的PTEN，外源性的PTEN-L能夠下調(diào)PI3K通路，影響細(xì)胞在體外的存活。因為PTEN-L 能夠脫離供體細(xì)胞，并作用于受體細(xì)胞，所以在腫瘤微環(huán)境中，間質(zhì)細(xì)胞PTEN的狀態(tài)可能會對腫瘤細(xì)胞PTEN的活性產(chǎn)生影響。PTEN-L 的旁分泌功能也許可以解釋之前存在的現(xiàn)象，即在體外PTEN的缺失對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯的影響，但是PTEN缺失的腫瘤細(xì)胞移植至小鼠體內(nèi)時腫瘤的生長并不一定存在差異［35］。

可變聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）是PTEN mRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾的另一種方式：通過在不同的APA 位點切割，然后添加polyA，豐富了PTEN轉(zhuǎn)錄本的多樣性。PTEN基因受APA調(diào)控的位點位于終止密碼子上游3 kb［36］、290 bp 及60 bp 處，可以導(dǎo)致PTEN 轉(zhuǎn)錄本的縮短［37-38］。有研究人員認(rèn)為PTEN 3′-UTR 的縮短可以限制miRNA 的結(jié)合，從而增加PTEN mRNA的穩(wěn)定性［39］。

3 PTEN的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控

上述PTEN 的調(diào)控都是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，而PTEN轉(zhuǎn)錄前的調(diào)控對PTEN的表達(dá)也發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報道，多種轉(zhuǎn)錄因子可以正向或負(fù)向調(diào)控PTEN的轉(zhuǎn)錄。其中p53、表皮生長因子1（epidermal growth factor 1，EGF1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）可以結(jié)合在PTEN的啟動子上，上調(diào)PTEN 的表達(dá)［40-41］。與之相反，SNAIL、c-Jun 和NF-κB 可以下調(diào)PTEN 的表達(dá)［42-43］。而NOTCH1既可以上調(diào)也可以下調(diào)PTEN 的表達(dá)，這取決于NOTCH1是與著絲粒結(jié)合因子1（centromere binding factor-1，CBF-1）相互作用還是與MYC相互作用［44-45］。

PTEN啟動子的表觀沉默是PTEN基因失活的另一種方式。PTEN啟動子CpG 島的異常高甲基化存在于多種腫瘤中，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤和胃癌等［46-50］。同時，PTEN的轉(zhuǎn)錄也受到組蛋白乙酰化的調(diào)控。有報道稱，轉(zhuǎn)錄因子SALI4 可以通過招募具有染色質(zhì)重塑作用的ATP 酶和具有組蛋白脫乙酰活性的核小體重構(gòu)及脫乙酰酶（nucleo?some remodeling and deacetylase，NuRD）復(fù)合體至PTEN的啟動子上，抑制PTEN的轉(zhuǎn)錄［51］。

4 恢復(fù)PTEN的治療措施和臨床轉(zhuǎn)化前景

恢復(fù)PTEN 功能的傳統(tǒng)臨床研究著重于拮抗PI3K 信號。這類研究的靶點涉及整個PI3K 通路的激酶，包括受體酪氨酸激酶、PI3K、AKT 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）［52］。而最近的研究將重點轉(zhuǎn)移到PTEN缺失對基因組穩(wěn)定性和使用PARP 抑制劑靶向PTEN缺失的腫瘤上［53］。在大量體外和體內(nèi)的臨床前研究中，PTEN基因的恢復(fù)能夠降低一些腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡［54-55］。然而這些模型依賴于PTEN基因的基因重組，目前尚不能在臨床上實施。

5 小結(jié)

本文對調(diào)控PTEN 表達(dá)和活性的機制進(jìn)行了總結(jié)。最近幾十年中，相關(guān)機制有了許多新的發(fā)現(xiàn)。但是目前這些調(diào)控機制尚未能為臨床治療提供很大幫助。不限于，但可能存在以下的原因造成了這一現(xiàn)象：（1）異質(zhì)性大：在不同類型的腫瘤中，甚至是同一種腫瘤的不同患者中，調(diào)控PTEN的機制都可能存在很大的異質(zhì)性；（2）機制定位難：PTEN 是一個穿梭在胞漿和胞核的蛋白，在不同部位發(fā)揮著不同的抑癌作用，但目前尚無有效的手段可以迅速對患者PTEN 調(diào)控機制異常進(jìn)行定位；（3）靶向性差，調(diào)控PTEN的上游通路往往同時調(diào)控著其他靶蛋白，而且PTEN 亦調(diào)控著下游眾多靶基因，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致藥物很難有準(zhǔn)確的靶向性。總之，對這一關(guān)鍵抑癌基因調(diào)控機制的全面了解或許可以指導(dǎo)開發(fā)更多有效的恢復(fù)PTEN抗腫瘤活性的藥物。