槲皮素通過PINK1/parkin通路激活線粒體自噬減輕大鼠腦缺血再灌注損傷*

魏思燦，林天來(lái)，黃 玲，蘇志偉，魏梅娟

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建泉州 362000）

缺血性腦卒中是腦卒中死亡的首要原因，具有高致死率和高致殘率等特點(diǎn)［1-2］。使缺血的腦組織恢復(fù)血液供應(yīng)，是急性腦梗死的主要治療目的，然而快速恢復(fù)缺血腦組織血液供應(yīng)過程中，會(huì)對(duì)腦組織造成一定損傷，故臨床稱之為腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［3-4］。I/R 的病理生理過程極為復(fù)雜，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬在I/R 和腦卒中過程發(fā)揮重要作用［5-6］。PTEN 誘導(dǎo)激酶1（PTEN-in?duced putative kinase 1，PINK1）和帕金蛋白（parkin）協(xié)同作用可啟動(dòng)線粒體自噬，特異性清除受損線粒體，保護(hù)組織免受損傷［7-8］。因此研究I/R過程中線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1/parkin 的表達(dá)及調(diào)控，對(duì)缺血性腦卒中的研究具有重要意義。槲皮素（querce?tin，QUE）是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多種生理活性，且對(duì)心、肝、皮、肺、腎及神經(jīng)系統(tǒng)等多種組織有保護(hù)作用，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能減輕心、腎及腦等組織缺血再灌注損傷［9-10］，但對(duì)組織缺血損傷過程中線粒體自噬通路的調(diào)控作用尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究建立大鼠I/R 腦損傷模型，在此基礎(chǔ)上探討槲皮素治療I/R 可能存在的新藥理機(jī)制，為臨床合理用藥提供參考。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)同遺傳背景SD 大鼠，體重200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SY2019071906。所有大鼠于本院動(dòng)物房中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25℃，相對(duì)濕度50%，噪音低于80 分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合3R原則。

1.2 主要試劑及儀器 槲皮素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，規(guī)格為20 mg，純度≥98%；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購(gòu)自Sig?ma；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司；丙二醛（malo?ndialdehyde，MDA）試劑盒購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海篤瑪生物科技有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海貝博生物科技公司；抗PINK1 和抗parkin、抗LC3-II 等抗體購(gòu)自Abcam；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶購(gòu)自Pierce。RM2125RTS 型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)和EM ACE900 型電子顯微鏡購(gòu)自Leica；SMZ745 型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自Nikon；1659001 型蛋白電泳儀和Trans-Blot SD 型半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad；GIS-500 型凝膠成像儀購(gòu)自杭州米歐儀器有限公司等。

2 方法

2.1 大鼠I/R 模型的建立及分組給藥 取SD 雄性大鼠60 只，將其分為假手術(shù)（sham）組、模型組（I/R組）、QUE 組（10 mg/kg）、3-MA 組和QUE+3-MA 組，每組12 只。槲皮素藥物參照文獻(xiàn)［11］用生理鹽水稀釋成1 g/L的溶液，3-MA參照文獻(xiàn)［12］用磷酸緩沖溶液配制成100 moL/L 的溶液；槲皮素組按10 mg/kg 的劑量灌胃給予槲皮素；3-MA 組經(jīng)腹腔注射給予3-MA 溶液2 μL；QUE+3-MA 組灌胃給予相應(yīng)劑量的槲皮素，并經(jīng)腹腔注射給予相應(yīng)劑量的3-MA溶液；sham組和I/R 組均灌胃給予生理鹽水，并經(jīng)腹腔注射給予磷酸鹽緩沖液。各組大鼠均給藥3 d，每次1 次。末次給藥30 min 后，除sham 組外，其于各組大鼠均參照文獻(xiàn)［10］構(gòu)建大鼠I/R 腦損傷模型。具體操作方法為：3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，于枕骨下第一頸椎正中切水平切口，并暴露第一頸椎橫突，通過翼小孔，將一直徑為0.5 mm 的電凝針插入橫突孔，將兩側(cè)椎動(dòng)脈電凝，永久性阻斷椎動(dòng)脈血流，縫合切口。24 h 后再次麻醉大鼠，監(jiān)測(cè)腦電圖，腦電圖恢復(fù)正常，暴露并游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉15 min（此時(shí)腦血供全部被阻斷造成全腦缺血，以腦電波變平為模型成功標(biāo)志），然后開放動(dòng)脈夾恢復(fù)血流灌注，縫合切口，待動(dòng)物清醒后回籠飼養(yǎng)。Sham組暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈以及頸總動(dòng)脈后予以縫合，待清醒后回籠飼養(yǎng)。各組大鼠在造模成功后，觀察神經(jīng)功能行為，麻醉處死，取材并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological deficit score，NDS） 各組大鼠在造模成功后24 h，參照文獻(xiàn)［13］，進(jìn)行NDS 評(píng)分。NDS 評(píng)分包含大體表現(xiàn)、腦干功能、運(yùn)動(dòng)評(píng)估、感覺功能、運(yùn)動(dòng)行為、行為學(xué)及驚厥情況七項(xiàng)功能，滿分80分，0分判定為腦死亡。

2.3 腦梗死體積的檢測(cè) 做完神經(jīng)功能缺損評(píng)分后，隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后立即取腦，迅速置于?20℃中冰凍。待組織凍硬后，在冰上將大腦由前向后做冠狀切片。放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的TTC 染液中，37℃避光染色20 min，隔10 min 翻動(dòng)一次。紅色為正常組織，白色為梗死灶。染色完成后，于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛中固定，4℃過夜后拍照。用ImageJ 1.41軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)腦片梗死面積及正常組織面積，并計(jì)算梗死體積百分比：V（%）=（Al+A2+…+An）/（BI+B2+…+Bn）（A 為每個(gè)腦片梗死區(qū)域面積，B為每個(gè)腦片梗死側(cè)大腦半球面積，n為腦片序號(hào)）。

2.4 大鼠海馬組織的透射電鏡觀察 每組隨機(jī)取6只大鼠，用3%戊巴比妥鈉麻醉，心臟灌注（穿刺灌注20 min，生理鹽水灌注50～100 mL，4%多聚甲醛灌注150 mL）后迅速斷頭、取腦，剪取0.5 g 海馬組織，置于?80℃冰箱保存?zhèn)溆?，其余組織迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h于冰上用雙面刀片切取海馬組織，切成5 μm 的切片，置于盛有預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛中，用電鏡觀察線粒體形態(tài)。

2.5 大鼠海馬組織IL-6、TNF-α、SOD 活性和MDA含量檢測(cè) 取2.4 中?80℃保存的海馬組織，于4℃條件下解凍后，通過勻漿器以1∶9 的比例均化樣品和生理鹽水制備腦勻漿（10%），3 000 r/min 冷凍離心4 min，獲得上清液，按ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)IL-6 和TNF-α 含量。按SOD 和MDA 試劑盒說明書分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸縮合法檢測(cè)海馬組織SOD 活性和MDA 含量。剩余腦組織勻漿液迅速置于?20℃冰箱中保存。

2.6 Western blot 檢測(cè)海馬組織PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平 取2.5 中剩余組織勻漿液，于4℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST 溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST 溶液清洗3 次后，加入Ⅰ抗［PINK1、parkin 和LC3-II 抗體1∶1 000 稀釋，β-actin（內(nèi)參照）抗體1∶2 000 稀釋］，4℃搖床中孵育過夜，加TBST 振洗后加入HRP 標(biāo)記羊抗鼠II 抗（稀釋倍數(shù)1∶2 000），37℃搖床中孵育1 h，TBST清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以ImageJ 軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠NDS評(píng)分結(jié)果

與sham組相比，I/R組、QUE+3-MA組、QUE組及3-MA組大鼠NDS評(píng)分降低（P＜0.05），腦梗死體積增大（P＜0.05）；與I/R 組和QUE+3-MA 組相比，QUE 組NDS 評(píng)分升高（P＜0.05），腦梗死體積減?。≒＜0.05），3-MA組NDS評(píng)分降低（P＜0.05），腦梗死體積增大（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA 組相比，上述指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表1。

2 各組大鼠腦梗死體積檢測(cè)結(jié)果

TTC 染色顯示，sham 組大鼠的大腦組織呈均勻淡紅色，無(wú)腦梗死病灶；與sham組相比，I/R組、QUE+3-MA 組、QUE 組及3-MA 組腦梗死部位被染成白色，且梗死體積增大（P＜0.05）；與I/R組及QUE+3-MA組相比，QUE 組腦梗死體積縮?。≒＜0.05），而3-MA 組腦梗死體積增大（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA 組相比，上述指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見圖1、表1。

3 各組大鼠海馬組織線粒體結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果

Sham 組大鼠海馬組織線粒體形態(tài)正常；I/R 組及QUE+3-MA 組海馬組織線粒體腫脹、內(nèi)部嵴破壞或消失嚴(yán)重，并有自噬溶酶體形成；與I/R組及QUE+3-MA組相比，QUE組海馬組織線粒體腫脹及內(nèi)部嵴破壞明顯減輕，形態(tài)較為正常，自噬溶酶體形成較多；而3-MA 組海馬線粒體結(jié)構(gòu)有空泡樣變性，且破壞明顯，見圖2。

Figure 1.TTC-stained cerebral infarction map of rats in each group.圖1 各組大鼠TTC染色腦梗死圖

表1 各組大鼠NDS評(píng)分和腦梗死體積的比較Table 1.Comparison of NDS and cerebral infarction volume of rats in each group（Mean±SD）

Figure 2.Ultrastructure of mitochondria in hippocampus tissues of various groups.The black arrows indicate mitochondria，and the red arrows indicate autophagolysosome.The scale bar=500 nm.圖2 各組大鼠海馬組織線粒體超微結(jié)構(gòu)圖

4 各組大鼠海馬組織氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白及炎癥因子表達(dá)的結(jié)果

與sham組相比，I/R組、QUE+3-MA組、QUE組及3-MA 組大鼠海馬組織的IL-6、TNF-α 和MDA 含量升高（P＜0.05），SOD 活性降低（P＜0.05）；與I/R 組和QUE+3-MA 組相比，QUE 組的IL-6、TNF-α 和MDA 含量降低（P＜0.05），SOD 活性升高（P＜0.05）；而3-MA組大鼠海馬組織的IL-6、TNF-α和MDA含量升高（P＜0.05），SOD活性降低（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA組相比，上述指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05），見表2。

5 各組大鼠海馬組織PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白的表達(dá)結(jié)果

與sham 組相比，I/R 組、QUE+3-MA 組、QUE 組及3-MA 組大鼠海馬組織的PINK1、parkin 和LC3-II蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與I/R組和QUE+3-MA組相比，QUE 組海馬組織的PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），而3-MA 組的PINK1、parkin、LC3-II 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；I/R 組與QUE+3-MA組相比，上述指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。見圖3、表3。

表2 各組大鼠海馬組織IL-6、TNF-α和MDA含量及SOD活性比較Table 2.Comparison of IL-6，TNF-α，MDA and SOD levels in hippocampus tissues of various groups（Mean±SD. n=6）

Figure 3.Western blot for protein expression of PINK1，parkin and LC3-II in hippocampus tissue of rats.圖3 各組大鼠海馬組織PINK1、parkin和LC3-II的蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠海馬組織PINK1、parkin和LC3-II蛋白表達(dá)比較Table 3.The protein expression of PINK1，parkin and LC3-II in the hippocampus of rats（Mean±SD. n=6）

討 論

I/R 過程中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，會(huì)引起腦組織損傷，造成患者癱瘓、視聽覺消失及癡呆等行為，而運(yùn)動(dòng)、感覺及認(rèn)知等神經(jīng)功能異常行為，可間接反映大鼠腦損傷程度［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，I/R模型組大鼠NSD 評(píng)分明顯降低，腦梗死體積增大，海馬組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 活性降低，MDA 含量升高，炎癥指標(biāo)IL-6 和TNF-α 含量均升高，提示I/R 組大鼠腦組織可能發(fā)生炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能受損及腦組織損傷，表明造模成功。

槲皮素具有抗炎和抗氧化作用，近年發(fā)現(xiàn)其可抵抗I/R 腦損傷，且受到研究者的關(guān)注。黃超等［15］發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、拮抗炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡等途徑治療創(chuàng)傷性腦損傷。楊青麗等［16］發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)缺氧缺血性腦損傷神經(jīng)元細(xì)胞有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R 模型組相比，槲皮素組大鼠NSD 評(píng)分升高，全腦梗死體積、IL-6、TNF-α及MDA含量降低，SOD活性升高，表明槲皮素可抑制I/R 模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥損傷，減輕腦組織損傷，與上述文獻(xiàn)研究一致。

線粒體功能紊亂，也是腦I/R 中腦組織及細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素之一［5］。但線粒體自噬在I/R 過程中的作用也一直存在爭(zhēng)議，李翔等［17］發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬可抑制腦I/R 中神經(jīng)細(xì)胞損傷和組織損傷，左瑋等［18］發(fā)現(xiàn)通過激活線粒體自噬，可改善I/R。而Shi 等［19］及Zhou 等［20］發(fā)現(xiàn)抑制線粒體自噬，可達(dá)到抑制自噬性細(xì)胞死亡的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham 組相比，I/R模型組大鼠腦組織出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)部嵴破壞或消失、結(jié)構(gòu)空泡樣等嚴(yán)重病理變化，提示I/R 模型大鼠線粒體結(jié)構(gòu)及功能損傷，自噬清除受損細(xì)胞功能受到抑制。有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可激活線粒體自噬，緩解組織損傷。馬玉珍等［21］發(fā)現(xiàn)槲皮素可促進(jìn)骨骼肌線粒體自噬蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)；黃超等［15］發(fā)現(xiàn)槲皮素可改善腦創(chuàng)傷性損傷組織中線粒體能量代謝，保護(hù)腦組織。然而，槲皮素對(duì)腦I/R 過程中線粒體功能的影響還未見報(bào)導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，與I/R 模型組相比，槲皮素組大鼠海馬組織線粒體病理變化明顯減輕，表明槲皮素可減輕I/R 模型大鼠腦組織中線粒體損傷，保護(hù)線粒體功能。而槲皮素保護(hù)和改善I/R 腦組織線粒體功能的具體機(jī)制還不明確。

PINK1 是線粒體外膜蛋白，可作為線粒體受損的分子感受器，parkin 介導(dǎo)底物泛素化后，與LC3-II及ATP 酶增強(qiáng)子連接，產(chǎn)生線粒體自噬體［22］。葉亮等［12］發(fā)現(xiàn)抑制PINK1/parkin 通路蛋白表達(dá)，可使線粒體自噬水平降低，線粒體損傷及腦損傷加重。Wu等［23］發(fā)現(xiàn)激活PINK1/parkin 通路，可抑制腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與sham 組相比，I/R 模型組大鼠海馬組織PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白表達(dá)均增高，表明I/R 模型大鼠機(jī)體腦組織中線粒體自噬水平升高。而槲皮素組大鼠海馬組織PINK1、parkin 及LC3-II 蛋白表達(dá)均明顯高于I/R 模型組，推測(cè)槲皮素可進(jìn)一步促進(jìn)線粒體自噬，來(lái)抵抗I/R 大鼠腦組織氧化應(yīng)激及炎性損傷，表明槲皮素可能是通過促進(jìn)PINK1、parkin 蛋白表達(dá)，激活線粒體自噬來(lái)抵抗腦組織損傷的。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究設(shè)置PINK1/parkin 通路抑制劑3-MA 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與I/R 模型組及槲皮素組相比，3-MA 組大鼠PINK1、parkin 和LC3-II 蛋白均顯著降低，且NSD 評(píng)分降低，腦梗死體積增大，海馬組織中SOD 活性降低，MDA、IL-6 和TNF-α 含量均升高，海馬組織線粒體病理變化進(jìn)一步加重，表明采用PINK1/parkin 抑制劑抑制線粒體自噬激活，可加重腦組織氧化應(yīng)激及炎癥損傷，從而加重腦組織損傷。而3-MA 與槲皮素聯(lián)合應(yīng)用后，大鼠上述指標(biāo)與I/R 模型組相比無(wú)明顯差異，表明3-MA 可逆轉(zhuǎn)槲皮素激活I(lǐng)/R 模型大鼠腦組織線粒體自噬及改善腦損傷的作用，進(jìn)一步證明槲皮素可能通過激活PINK1/parkin 通路，激活線粒體自噬，進(jìn)而減輕腦I/R損傷。

綜上所述，槲皮素可通過調(diào)控PINK1/parkin 通路蛋白表達(dá)，激活線粒體自噬，減輕腦I/R 損傷，為闡明和開發(fā)槲皮素治療I/R 損傷提供一定參考。但腦I/R 過程中線粒體自噬體系相當(dāng)復(fù)雜，而槲皮素調(diào)控線粒體自噬緩解腦I/R 損傷的其他分子生物學(xué)機(jī)制有待后續(xù)繼續(xù)深入研究。