殼聚糖季銨鹽的制備及抑菌性能研究

包艷玲（武漢輕工大學(xué)，湖北武漢430000）

0 引言

無論是殼聚糖還是殼聚糖季銨鹽，其分子量都是影響其抗菌活性的重要因素。據(jù)報(bào)道，殼聚糖的分子量在104～105之間，有利于抑制細(xì)菌的生長。程國軍等人發(fā)現(xiàn)殼聚糖分子量為2.2 x 104時(shí)，其抗菌活性較高。Tokura 等人發(fā)現(xiàn)平均分子量9.3 x 103的殼聚糖對大腸桿菌有抑制作用，而分子量為2.2 x 104的殼聚糖能促進(jìn)大腸桿菌生長。目前，關(guān)于CTS-QTS的性能還沒有一個(gè)統(tǒng)一的結(jié)論，存在很多爭議。

以殼聚糖衍生季銨鹽抗菌劑是殼聚糖衍生物研究的熱點(diǎn)，但目前對殼聚糖及其季銨鹽衍生物的抗菌機(jī)理的研究還不深入，而進(jìn)一步提高抗菌性能，必須以全面、深層次認(rèn)識其抗菌機(jī)理為基礎(chǔ)。從化學(xué)結(jié)構(gòu)方面來看，含吡啶的季銨鹽、雙季銨鹽等具有更高殺菌活性，與殼聚糖反應(yīng)，有望制得具有更好抗菌效果的殼聚糖衍生物抗菌劑。

HACC 作為一種高分子聚合物，具有良好的抗菌抑菌、保濕、易溶等性能，因此可作為瘢痕及創(chuàng)傷修復(fù)、抗感染、調(diào)脂、載藥及藥物控釋等產(chǎn)品應(yīng)用。而HACC 的這些性能與CTS 的季銨化改性有著密切的聯(lián)系，但人們對于這種關(guān)聯(lián)的研究目前還不是很深入，為進(jìn)一步提高HACC 的擴(kuò)展應(yīng)用，有必要加大對CTS 季銨化的了解和探究，以便提高和改善HACC的性能。

由于殼聚糖分子中存在氨基和羧基使得殼聚糖易于進(jìn)行物理和化學(xué)改性，可以引入例如環(huán)氧乙烷、乙酸、二硫化碳等化學(xué)物質(zhì)對其進(jìn)行改性，以改善其物理和化學(xué)性質(zhì)。銨與鹵代烴反應(yīng)可以制取季銨鹽，季銨鹽易溶于水且具有較強(qiáng)的抗菌性，因這一性能被廣泛用于各種化合物改性中。目前季銨鹽類消毒劑在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域、生物制劑領(lǐng)域以及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中都被廣泛應(yīng)用。利用季銨鹽對殼聚糖進(jìn)行改性，若兩者結(jié)合既能保留季銨鹽易溶于水的特性又能增強(qiáng)兩者都具有的抗菌性能，就會有更廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)以環(huán)氧丙基三甲基氯化銨為原料，在殼聚糖的氨基上發(fā)生加成反應(yīng)生成了殼聚糖季銨鹽。研究不同條件對殼聚糖季銨鹽合成效果的影響，研究了殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1 合成殼聚糖季銨鹽

首先進(jìn)行過濾，檢查裝置氣密性；然后把濾紙修剪成合適的大小，最好與布氏漏斗大小相似而略小于布氏漏斗。倒入適當(dāng)?shù)恼麴s水使濾紙與布氏漏斗完全貼合住，打開抽濾泵開關(guān)開始抽濾，將ph為7左右的殼聚糖溶液倒入布氏漏斗進(jìn)行抽濾得到白色膠狀物，放入250ml圓底燒瓶中備用；

在45～85℃下以不同摩爾比加入環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTA)，再加入100ml異丙醇。然后在恒溫?cái)嚢?～10小時(shí)。由于異丙醇沸點(diǎn)較低，所以采用回流裝置。反應(yīng)結(jié)束后，在混合溶液中加入適量丙酮使產(chǎn)物沉淀。沉淀物先進(jìn)行抽濾，后用甲醇洗滌、抽濾，最后用丙酮-乙醇混合溶液(體積比為4：1)洗滌、抽濾。然后把設(shè)置烘箱溫度為120℃，在空氣干燥箱中放置12小時(shí)，干燥后得到殼聚糖季銨鹽。

1.2 檢測溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響

開啟恒溫加熱磁力攪拌器，搭建冷凝回流裝置，分別在55、65、75 和85℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，在上述圓底燒瓶中加入環(huán)氧丙基三甲基氯化銨15g，再加入100ml異丙醇，恒溫?cái)嚢?小時(shí)。

1.3 檢測不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響

打開恒溫加熱磁力攪拌器，設(shè)定溫度為75 攝氏度，搭建冷凝回流裝置，待升溫至75℃后在上述圓底燒瓶中分別加入環(huán)氧丙基三甲基氯化銨5g、10g、15g、20g，再加入100ml異丙醇，恒溫?cái)嚢?小時(shí)，研究CTS與GTA的不同摩爾比對產(chǎn)物的影響。

1.4 殼聚糖季銨鹽的抗菌性能檢測

（1）培養(yǎng)基的配置：將將10 g 蛋白胨、5 g 牛肉膏、5 g 氯化鈉、20 g 瓊脂粉加入到1000 mL 蒸餾水中，充分混合后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 值至7.0 ～7.2，加熱充分溶解，于121 ℃下高溫滅菌20min；

（2）倒平板：在超凈工作臺下將滅菌后的混合溶液倒入平板中，等待冷卻，制成固體培養(yǎng)基；

（3）冷卻后翻轉(zhuǎn)平板，在平板上畫線，分四個(gè)區(qū)域；

（4）在超凈工作臺上把大腸桿菌用移液槍放入平板中，用涂布棒進(jìn)行涂布，涂布要均勻、充分，在酒精燈下進(jìn)行涂布操作；

（5）涂布完成后，用滅菌過的移液槍吸取適量樣品于平板中的指定區(qū)域內(nèi)；

（6）把平板倒扣放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 小時(shí)后，觀察樣品的抑菌情況。

2 結(jié)果分析

2.1 分析不同條件對殼聚糖季銨鹽合成的影響

2.1.1 溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響

反應(yīng)時(shí)間定為8h，CTS與GTA的摩爾比定為1：3，測量不同溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響

結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)溫度不斷提高，殼聚糖季銨鹽的溶解度也隨之增大，但這種線性關(guān)系到75℃之后開始改變，75 攝氏度時(shí)殼聚糖季銨鹽溶解度達(dá)到最大，而繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，殼聚糖季銨鹽溶解度呈下滑趨勢，分析其原因可能是溫度過高，導(dǎo)致了殼聚糖季銨鹽的分子鏈發(fā)生裂解，從而導(dǎo)致殼聚糖季銨鹽的溶解度降低。而且反應(yīng)溫度過高可能會使環(huán)氧丙基三甲基氯化銨中的環(huán)氧鍵發(fā)生斷裂，GTA分子之間可能發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，使得相對較少的GTA 分子與殼聚糖發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致殼聚糖季銨鹽的合成較少。從而溶解度降低。故選擇反應(yīng)溫度75℃為宜。

2.1.2 殼聚糖與環(huán)氧丙基三甲基氯環(huán)的不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響

反應(yīng)時(shí)間定為8h，溫度定為75攝氏度，測量殼聚糖與環(huán)氧丙基三甲基氯環(huán)的不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響。結(jié)果顯示，隨著殼聚糖與環(huán)氧丙基三甲基氯環(huán)的摩爾比不斷增加，殼聚糖季銨鹽的溶解度也不斷增加，但當(dāng)殼聚糖與環(huán)氧丙基三甲基氯環(huán)的摩爾比大于3時(shí)，殼聚糖季銨鹽的溶解度增加緩慢趨于穩(wěn)定，最終不再增加。故選擇CTS 與GTA 的摩爾比為1：3。

2.1.3 殼聚糖季銨鹽的抑菌性能分析

第一次抑菌試驗(yàn)采用75℃下反應(yīng)6 小時(shí)，CTS 與GTA 摩爾比為1：1 的殼聚糖季銨鹽進(jìn)行檢測，殼聚糖季銨鹽溶液濃度為0.03%，用濾膜浸染季銨鹽殼聚糖溶液放入平板內(nèi)，用報(bào)紙把平板包好，放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

我們可以看出，浸染了殼聚糖季銨鹽溶液的濾膜上有菌產(chǎn)生但是很少量，而沒有侵染溶液的濾膜與空白對照處都長滿了大腸桿菌，證明0.03%殼聚糖季銨鹽溶液有抑菌效果但抑菌效果不好，分析可能是因?yàn)槿芤簼舛冗^低而導(dǎo)致抑菌效果不明顯。

第二次抑菌實(shí)驗(yàn)采用了75℃下反應(yīng)6 小時(shí)，CTS 與GTA 摩爾比為1：1的殼聚糖季銨鹽進(jìn)行檢測，殼聚糖季銨鹽溶液濃度為0.05%，用滅菌過的移液槍向平板內(nèi)滴加殼聚糖溶液、0.05%殼聚糖季銨鹽溶液和0.05%環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶液，放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

可以看出，左上角滴加殼聚糖溶液的部分有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，證明殼聚糖溶液具有良好的抑菌效果；而右上角滴加0.05%殼聚糖季銨鹽溶液的部分也有抑菌圈出現(xiàn)，但抑菌圈較小且不是特別明顯；左下角的0.05%環(huán)氧丙烷三甲基氯化銨溶液與右下角空白對照組相同，平板上均長滿了大腸桿菌，證明環(huán)氧丙基三家基氯化銨完全沒有抑菌性。

第三次抑菌實(shí)驗(yàn)的殼聚糖季銨鹽的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為75℃，反應(yīng)時(shí)間為8h，CTS與GTA 摩爾比為1：3，稱取3g樣品與100ml水中充分溶解，配置3.00%的殼聚糖季銨鹽溶液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

平板中分為四片區(qū)域，上方是環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶液，下方為無任何溶液滴加的空白對照組，平板左邊為殼聚糖溶液，右邊為3.00%的殼聚糖季銨鹽溶液。我們可以明顯的看出，滴加環(huán)氧丙基三甲基氯化銨處的平板長滿了大腸桿菌，證明其毫無抑菌效果。而殼聚糖溶液與殼聚糖季銨鹽溶液均有抑菌效果，且滴加殼聚糖季銨鹽溶液處的平板抑菌圈較大，抑菌效果相對明顯，滴加殼聚糖季銨鹽溶液的部分已完全沒有菌生長。較之前的兩次實(shí)驗(yàn)相比較，我們可以發(fā)現(xiàn)，殼聚糖季銨鹽的濃度對抑菌效果影響較大。

3 結(jié)語

文章以殼聚糖為研究對象，用環(huán)氧丙基三甲基氯化銨作為化學(xué)改性劑對殼聚糖進(jìn)行改性，反應(yīng)生成殼聚糖季銨鹽。研究反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、殼聚糖與環(huán)氧丙烷三甲基氯化銨的不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響，最后檢測不同濃度不同條件合成的殼聚糖季銨鹽的抑菌效果。通過研究，結(jié)論如下：

溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響較明顯，隨著溫度的升高，殼聚糖季銨鹽的溶解度不斷提高，反應(yīng)溫度為75攝氏度時(shí)溶解度達(dá)到最高，但再升高溫度殼聚糖季銨鹽分子鏈就會發(fā)生降解，溶解度開始下降。隨著反應(yīng)時(shí)間不斷增加，殼聚糖季銨鹽的溶解度也隨之增大，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到8小時(shí)時(shí)殼聚糖季銨鹽溶解度達(dá)到最大，反應(yīng)基本完全，反應(yīng)8小時(shí)以上溶解度基本無變化。CTS與GTA的摩爾比為1：3時(shí)二者反應(yīng)基本完全。殼聚糖與殼聚糖季銨鹽均有抑菌效果。隨著溶液濃度升高，抑菌效果越來越明顯。