靶向ROR1腫瘤免疫治療的研究進展

周 琪 (成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，成都 611137)

癌基因受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1,ROR1) 是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)家族成員之一，與生長因子受體的酪氨酸激酶結構域具有很高的同源性，低表達于胚胎發(fā)育過程中[1,2]，而高表達于多種惡性腫瘤或組織中，如慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺腺癌等[3-9]。因此，ROR1是一種在腫瘤生物學中具有新興作用的胚胎蛋白，其具有高度識別性，已成為腫瘤特異性標志物[2]。大量數(shù)據(jù)顯示，ROR1在促進腫瘤的生長和轉移、誘導腫瘤細胞耐藥和抑制細胞凋亡等方面起到了不可小視的作用[7,9-12]。人ROR1分子由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。胞外區(qū)包括一個免疫球蛋白樣結構域(immunoglobulin-like domain,Ig-like)、兩個富含半胱氨酸卷曲的結構域(cysteine-rich domain or frizzled,CRD or FZD)和一個kringle(KNG)結構域(KRD)；胞內(nèi)區(qū)，含有一個酪氨酸激酶結構域(tyrosine kinase domain,TKD)、兩個富含絲氨酸/蘇氨酸的結構域(serine/threonines-rich domain,Ser/ThrD)和一個富含脯氨酸富集結構域(proline-rich domain,PRD)[2,13-15]。

近幾年，無論是雜交瘤單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)還是基因工程抗體都已經(jīng)被廣泛運用于腫瘤免疫治療中，其制備技術也已經(jīng)比較成熟[16,17]。基因工程抗體包括多種單鏈片段可變抗體(single-chain fragment variables，scFvs)、嵌合抗體(chimeric antibody)、Fab類抗體、抗體藥物偶聯(lián)物(antibody-drug conjugate，ADC)、嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T)和雙特異性抗體(bispecific antibody，BiAb)等[16,18-22]。靶向ROR1抗體已成為腫瘤免疫治療的發(fā)展趨勢，不僅具有特異性識別腫瘤抗原的特點，還具有高效、低毒殺死腫瘤細胞的功效。比如：靶向腫瘤ROR1胞外區(qū)Ig-like、FZD或KRD制備的抗ROR1 mAb，這些抗體能特異性地識別腫瘤抗原ROR1并與之結合，而且大部分抗體還能介導腫瘤細胞產(chǎn)生抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)，促進細胞凋亡[23]；或者靶向ROR1胞外區(qū)Ig-like的scFv可以明顯地抑制血液系統(tǒng)惡性腫瘤細胞，呈劑量遞呈性，而且這種抑制作用可以促進細胞凋亡[24，25]。甚至靶向ROR1胞外區(qū)Ig-like和FZD的特定位點制備的CAR-T能加大其抗體對ROR1的識別性，同時也能擴大其T細胞抗腫瘤的生物學效應[26]；而且，靶向ROR1 KRD中膜近端表位的BiAb，其特異性連接的T細胞比與膜遠端表位結合時其T細胞更能發(fā)揮抗腫瘤效應[27]；以及靶向ROR1 FZD的BiTE比靶向Ig-like的BiTE在ROR1+癌細胞株中更能產(chǎn)生持續(xù)優(yōu)越且可重復的細胞毒性等[28]。本文主要綜述靶向ROR1腫瘤免疫治療的研究進展。

1 單克隆抗體(mAb)

Daneshman等[23]利用雜交瘤細胞制備抗體的生物學技術針對ROR1胞外段的Ig-like、CRD和KRD分別制備了五株mAb，在模擬臨床條件中，它們都能針對CLL細胞誘導產(chǎn)生ADCC或CDC，促進細胞快速凋亡，卻不會誘導正常B淋巴細胞凋亡。其中最有效的抗CRD和KNG的mAb顯著優(yōu)于已批準臨床使用的CLL治療藥物利妥昔單抗(P<0.005)。此外，Cui等靶向ROR1胞外區(qū)制備多種mAb，并選擇了一種mAb D10，研究發(fā)現(xiàn)該抗體在37℃條件中可以迅速下調(diào)ROR1以及抑制體內(nèi)ROR1+乳腺癌細胞的轉移[29]。Widhopf等[30]進一步鑒定mAb D10時發(fā)現(xiàn)，盡管D10是一株親和力相對較低的mAb，但是其在CLL的ROR1轉基因小鼠模型中卻能明顯地抑制AKT的激活和ROR1+白血病細胞的植入。

2 單鏈片段可變抗體(scFv)

scFv是利用柔性連接肽(peptide linker)把重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因連接起來(VH-VL)[31]，其主要由噬菌體展示技術(phage display technology)制備。與mAb相比，scFv的免疫原性小，半衰期較短以及藥代動力學和藥效學具有潛在優(yōu)勢[18]。Maleki等[24]從噬菌體人類scFv庫I+J(Tomlinson I+J)中成功篩選出一種靶向ROR1胞外區(qū)Ig-like肽段的scFv。在體外實驗證實這種新的scFv通過與ROR1特異性結合后可以對血液系統(tǒng)惡性腫瘤CLL和RPMI8226細胞的生長具有明顯的抑制作用，呈劑量遞呈關系，而且這種抑制作用可促進細胞凋亡。然而，還需要進一步的研究來評估這種scFv的體內(nèi)腫瘤抑制作用。此外，scFv與之前報道的小鼠、嵌合體和人源化的抗ROR1抗體相比，其優(yōu)點是體積更小，對ROR1的親和力高，成本低，且易于生產(chǎn)[25]。

3 嵌合抗體(chimeric antibody)

Widhopf等[29]基于mAb D10獨特生物活性的特性，利用mAb D10結合ROR1時映射的表位，制備出具有高親和力且可變區(qū)人源化的mAb，這種mAb被命名為cirmtuzumab或UC-961[30]。Choi等[32]在臨床前研究結果中指出，cirmtuzumab在使用過程中具備安全可靠性，因為大體動物病理檢查結果顯示正常，未見其不良反應。以此，cirmtuzumab已經(jīng)進入臨床第1階段試驗。隨后，多項研究結果提出cirmtuzumab抗腫瘤活動中效應機制，例如：cirmtuzumab可以阻斷Wnt5A誘導的Rac1活化，增強ibrutinib治療CLL患者療效[33]；還可以增強Bcl-2抑制劑venetoclcax對ROR1+CLL細胞的細胞毒性[34]。以及通過抑制Wnt5a誘導的乳腺癌中Rho-GTPases、Hippo-Yap/TAZ和Bmi1的激活，阻止乳腺癌患者來源的異種移植(PDX)瘤在小鼠體內(nèi)再植入，而且還逆轉乳腺癌干細胞的耐藥性，改善乳腺癌患者化療的副反應[35]。

4 Fab類抗體

Fab抗體是由重鏈(VH-CH1)的Fd片段和完整的輕鏈(VL-CL)結合組成，隨著基因工程抗體技術的進步，F(xiàn)ab基因表達不斷被優(yōu)化，功效也被提高[19]。Yin等[36]以VH-CH1和VL-CL為模板，在體外構建的一組抗ROR1嵌合Fab抗體(ROR1-cFab)，可以特異性地結合ROR1蛋白和ROR1+卵巢癌A2780細胞，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡，呈劑量依賴性。然而，ROR1-cFab卻不能抑制ROR1-卵巢癌Iose386細胞的惡性行為。隨后，以ROR1-cFab的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)為模板，成功構建一組抗ROR嵌合IgG抗體(ROR1-IgG)。研究結果表明，ROR1-IgG與ROR1+卵巢癌細胞(HO8910和A2780)特異性結合，在PDX瘤中能有效抑制Bcl-2的表達，促進Bax明顯升高，起到抗增殖與促凋亡的作用。與ROR1-cFab相比，ROR1-IgG表現(xiàn)出更高的親和力和無明顯的免疫排斥反應，這不僅保留了Fab片段特異性抗原識別的特點，還執(zhí)行了抗體的其他生物學功能，如免疫調(diào)節(jié)、激活CDC或ADCC等[37]。

5 抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)

ADC是一種副作用小的新型免疫毒素。在腫瘤細胞分子水平基礎上，將具有生物活性的小分子藥物經(jīng)化學方法鏈接到mAb或scFv上，其抗體分子作為主要載體將小分子藥物載向目標細胞或分子，由小分子藥物選擇性地發(fā)揮抗腫瘤的毒性作用的機制[20]。Peyman等[38]在抗ROR1 ScFv-內(nèi)切酶G(anti ROR1 scFv-endog)蛋白的三維結構模型中，將一種靶向ROR1胞外區(qū)的治療型免疫毒素-非免疫原性人內(nèi)切酶G酶選擇性地傳遞到ROR1+腫瘤細胞中時，這種屬于終末期凋亡分子的免疫毒素可以快速導致腫瘤細胞凋亡。然而，ADC中某些偶聯(lián)藥物在抗腫瘤活動中可能存在副作用需要我們認真對待，比如蒽環(huán)類藥物可能導致心臟的毒副作用[39]；甚至還有報道指出抗體藥物偶聯(lián)T-DM1在治療人表皮生長因子受體2(HER2)陽性的乳腺癌時，通過ROR1激活Hippo轉錄共激活因子YAP1，誘導產(chǎn)生腫瘤耐藥性[40]。

6 嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)

嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T療法)，其基本概念是利用基因工程技術將CARs修飾腫瘤患者自身T細胞[41,42]，以激活效應細胞達到有效殺傷腫瘤細胞的作用，這是一種能夠精準、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤細胞免疫方法[43-45]。有多項研究指出，CARs的功能通常集中在細胞內(nèi)信號轉導領域，研究者們重申應堅持為胞外間隔的每個目標分子和表位進行獨立定制的原則，并強調(diào)相互作用的CAR-T與腫瘤細胞之間存在重要的空間需求[26]。

早期，Hudecek等[46]在臨床試驗中將特異性ROR1 CAR-T靶向ROR1+B型急性淋巴細胞白血病(B-acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)產(chǎn)生了前所未有的抑癌效果。在此基礎上，利用靶向ROR1胞外Ig-like/FZD的mAb 2A2制備2A2 CAR-T,并截短其間隔域,獲得對ROR1+腫瘤的識別。進一步研究發(fā)現(xiàn)，利用靶向ROR1 Ig-like和FZD上的一個獨立表位的兔抗人ROR1 mAb R12制備R12 CAR-T，與2A2 CAR-T相比較時，展現(xiàn)出了更高的親和性[47,48]；而且針對體內(nèi)ROR1+B細胞淋巴瘤和體外多種上皮性腫瘤都表現(xiàn)出了很好的反應活性[26]；隨后，通過改造與修飾R12 CAR-T的空間間隔，明顯地提升其對ROR1+腫瘤的識別及擴大T細胞的生物學效應[49]。以此，Berger等[50]進一步研究證實，R12 CAR-T產(chǎn)生的生物效應在針對人類和非人類靈長類動物之間的同源腫瘤相關分子中具有實用安全性。這項技術成果已被轉化運用于臨床I期。此外，Peng等[48]發(fā)現(xiàn)，與R12有重疊表位的XBR1-402 CAR-T，其CAR-T細胞和靶細胞膜之間的最佳間距為短間隔時產(chǎn)生效應T細胞的增殖速度比長間隔區(qū)的更快，IFN-γ和IL-2的分泌也增多，可是其體外細胞毒性是等效的。與抗人ROR1 mAbR11有重疊表位的XBR1-401 CAR-T的最佳間距卻是長間隔[47]。另外，陳玥等[51]成功構建的靶向ROR1 CAR-T，在多種ROR1+實體瘤細胞中也表現(xiàn)出了顯著的腫瘤殺傷效果。但是，值得注意的是，CAR-T細胞清除腫瘤的持續(xù)時間還有待確定[50]。

7 雙特異性抗體(BiAb)

BiAb由兩條不同的重鏈(VH)和輕鏈(VL)組成，可結合2個不同的特異性抗原表位，選擇性地激活免疫反應，介導細胞凋亡，是靶細胞和功能單位分子之間的一座重要橋梁[22,52]。BiAb特異性連接T細胞，其作用機制與CAR-T相似，主要利用T細胞來對抗腫瘤細胞；但與CAR-T不同的是，其制備和給藥方式卻類似于常規(guī)單抗，并能從患者體內(nèi)清除。Qi等[53]根據(jù)雙抗CD19×CD3 BITE的原理設計，生產(chǎn)的一組異二聚體和糖基化形式的雙特異性ROR1×CD3 ScFv-Fc，其可以延長循環(huán)T1/2近1周和減少系統(tǒng)性T細胞激活引起的副作用。而且，在血液和實體惡性腫瘤細胞中，針對ROR1 KRD中膜近端表位結合的R11 BiAb比膜遠端表位結合的R12 BiAb，其T細胞具有更大的選擇性與抗腫瘤效應,這主要取決于雙抗的ROR1-和CD3-接合臂之間的間距以及其表位在ROR1和CD3上的位置[27]。

8 雙特異性T細胞銜接器(bi-specific T-cell engager，BiTe)

結合BiAb理論，人們不僅提出BiTE的設計思路，還拓展其在臨床治療的應用范圍。與BiAb相比較，BiTE沒有FC結構域，其表現(xiàn)簡單且靈活度非常高，一只手臂連接著腫瘤抗原，另一只手臂關聯(lián)著特異性CD3亞基。在體內(nèi)，這樣的構造設計不需要共刺激或常規(guī)MHC識別，而只是定向于腫瘤部位募集和激活多克隆T細胞去發(fā)揮多樣性免疫效應[54]。Gohil等[28]利用一組與ROR1 Ig-like或FZD結合的抗ROR1抗體分別制備特異性的scFv與小鼠CD3 scFv成功構建ROR1 BiTE，這些CD3scFv都能特異性地結合人T細胞；而且靶向ROR1 FZD的BiTE比靶向Ig-like的BiTE在ROR1+癌細胞株中更能產(chǎn)生持續(xù)優(yōu)越且可重復的細胞毒性；此外，這種靶向ROR1 FZD的BiTE，在ROR1+胰腺癌細胞、卵巢癌細胞以及一系列不同組織學形態(tài)的實體腫瘤細胞中，均能激活T細胞介導細胞毒性效應。

9 結語

無論是雜交瘤單克隆抗體技術還是基因抗體工程技術，靶向ROR1結構域關鍵功能區(qū)制備的抗體在腫瘤免疫治療方面均表現(xiàn)出與腫瘤抗原的高度識別性以及顯著抗腫瘤活性的效果。由此可以看出，靶向ROR1的腫瘤免疫治療已經(jīng)發(fā)展成為一種有希望的防癌與治癌措施。