SNP分子標(biāo)記在蜜蜂中的應(yīng)用

陳孝梅 李永勝 藺哲廣 吉挺

（1 揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚州 225009；2 安徽黃山市畜牧技術(shù)推廣中心，黃山 245000）

1 SNP的概念

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP），指由染色體基因組中單個核苷酸的突變而引起的DNA的多態(tài)性，包括單堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等形式[1]。一般而言，上述形式中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1%[2]，但在某種特殊情況下（如cDNA）也可以小于1%[3]。SNP在基因組內(nèi)可以劃分為兩種形式：一是遍布于基因組的大量單堿基變異，二是基因編碼區(qū)的功能性突變，由于分布在基因編碼區(qū)（coding region），故稱其為cSNP。SNP在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的[4]，在非編碼序列中發(fā)生的頻率要高于編碼序列，而且非同義突變（導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變的堿基突變）發(fā)生的頻率要比其他方式突變的頻率低得多。一般情況下，SNP多發(fā)生在非編碼區(qū)[5]。

2 SNP的特點

2.1 遺傳穩(wěn)定性高

SNP是基于單核苷酸的突變，點突變率通常為10-9，遺傳穩(wěn)定性遠大于微衛(wèi)星等重復(fù)序列標(biāo)記[6]。

2.2 位點豐富且分布廣泛

SNP幾乎遍布整個基因組，而不同基因組之間、同一基因組不同染色體之間及編碼區(qū)與非編碼區(qū)之間的SNP分布頻率都不同。據(jù)估計人類基因組大約平均每1000bp就會出現(xiàn)一個SNP，這樣在整個基因組的分布就多達300萬個[7]。玉米1號染色體中每104個堿基就出現(xiàn)一個SNP[8]。在大豆基因中，SNP標(biāo)記的平均密度約為272bp出現(xiàn)一個SNP[9]。Nasu[10]等分析了三個粳稻品種、兩個秈稻品種和一個野生稻之間SNP發(fā)生的頻率，發(fā)現(xiàn)每232個堿基存在一個SNP。Kanazin[11]等分析五個大麥品系的54個基因時，發(fā)現(xiàn)大麥的38個基因中存在112個SNP。晏勵民[12]等收集了強抗病幼蟲個體（6只）和易感病幼蟲個體（6只），經(jīng)SNP測序，獲得位于mRNA的與蜜蜂抗白堊病相關(guān)的SNP位點696個，與蜜蜂易感白堊病相關(guān)的SNP位點102個，最終共篩選出71個與蜜蜂幼蟲抗白堊病性狀相關(guān)的SNP位點。在其他哺乳動物中SNP的頻率為每500~1000bp出現(xiàn)一次[13]。

2.3 具有代表性

某些位于基因內(nèi)部的SNP有可能直接影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達水平，從而使生物體發(fā)生變異或病變，因此，它們可能代表疾病遺傳機理中的重要因素。

2.4 檢測快速，易實現(xiàn)自動化分析

SNP標(biāo)記與RFLP、SSR等傳統(tǒng)的分子標(biāo)記方法差異很大。在開發(fā)檢測技術(shù)上，過去一般是建立在凝膠電泳基礎(chǔ)上對多個個體進行分析的方法[14]，操作步驟繁瑣，效率相對較低，成本也較高。Quinton[15]表示SNP通常是一種雙等位基因的遺傳變異，在檢測時無需測量片段的長度，只利用“+/-”或“全或無”分析的方式，經(jīng)測序直接進行序列比對來發(fā)現(xiàn)差異，因此SNP在技術(shù)上有著較大的優(yōu)勢，加上近年來各種新興技術(shù)的問世，提高了自動化檢測水平。

3 SNP的檢測方法及分析

SNP有多種檢測方法，學(xué)者按不同分類標(biāo)準(zhǔn)將其分為不同的類型。董文甫[16]等認為SNP的檢測方法大致可歸結(jié)為兩類：一類是引物延伸，另一類是異源雙鏈DNA的識別，有時兩者相互連用。曲娟娟[17]等認為SNP分析技術(shù)按其研究對象主要分為兩大類：尋找未知的SNP或確定某一未知SNP與某遺傳性狀的關(guān)系；對不同群體已知SNP遺傳多樣性檢測或?qū)σ阎虏』蜻M行診斷。張必弦[18]等將SNP標(biāo)記的研究方法分為四大類：利用基因測序（Sequencing）的研究、利用化學(xué)方法的研究、利用電泳方法的研究和利用雜交方法的研究。許家磊[19]等認為根據(jù)是否需要凝膠電泳和自動化程度的高低，大致可以把SNP的檢測方法分為兩大類，即基于凝膠電泳的SNP檢測方法和高通量、自動化程度較高的SNP檢測方法。

具體的檢測方法，目前常用的有：直接測序法、DNA芯片、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）。

3.1 直接測序法

直接測序法是最容易實施的SNP檢測方法。首先，利用DNA測序技術(shù)獲得目的片段的堿基序列，然后利用生物信息學(xué)軟件進行序列間比對，直觀地尋找SNP，檢出率高達100%。用此方法還可獲得SNP分型時所需要的重要信息，如SNP的類型和準(zhǔn)確的位置。但該法也存在缺點，即不能從序列誤差中鑒別出雜合子個體，但可以通過設(shè)計重復(fù)試驗和確認試驗來解決此類問題[20]。通過該技術(shù)，在人類的全基因組中檢測到47172個SNP，為人類高密度SNP圖譜的建立奠定了基礎(chǔ)[21]。

3.2 DNA芯片

DNA芯片，是用標(biāo)記的探針與特定的DNA樣品雜交，然后通過檢測雜交信號的強弱判斷樣品中靶分子的數(shù)量[22]。該方法實現(xiàn)了快速、高效、并行的多態(tài)性信息分析，是基于固態(tài)介質(zhì)進行分子雜交和原位熒光檢測的一種高通量的SNP分析方法[23]?；蛐酒夹g(shù)已廣泛應(yīng)用在SNP檢測和多態(tài)性分析等領(lǐng)域，但其大規(guī)模應(yīng)用和發(fā)展中也存在諸多不足，如檢測分析范圍較窄、多態(tài)性差和靈敏度等[24]。

3.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）

單鏈構(gòu)象多態(tài)性是指單鏈DNA由于堿基序列不同而引起空間構(gòu)象差異，這種差異會導(dǎo)致相同或相近長度單鏈DNA電泳遷移率的不同，從而可以通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行有效檢測[19]。該技術(shù)主要是用內(nèi)切酶對DNA樣品進行變性處理，經(jīng)過非變性PAGE電泳，由于單鏈DNA鏈內(nèi)的堿基會互作從而發(fā)生卷曲，形成較為穩(wěn)定的空間構(gòu)象，而DNA堿基序列差異會使DNA卷曲的分子構(gòu)象發(fā)生變化。因此，DNA序列在電泳中所受阻力不同，導(dǎo)致的電泳速度也不同，從而可鑒定出堿基差異的序列[18]。Orita[25]等進一步將SSCP用于PCR擴增產(chǎn)物的基因突變檢測，通過PCR結(jié)合SSCP使得分析的靈敏度得到了很大程度的提高。目前，PCR-SSCP技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域，被認為是一種SNP的經(jīng)典檢測方法[26]。

3.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

變性梯度凝膠電泳是Fisher和Lerman[27]在1979年提出的用于檢測DNA突變的一種電泳技術(shù)。通過設(shè)置變性劑濃度梯度，單堿基突變的DNA因解鏈行為不同導(dǎo)致遷移率不同，從而達到分離目的[28]。DGGE能夠檢測長達1kb的DNA片段，如果SNPS恰好出現(xiàn)在發(fā)生部分解旋的DNA區(qū)域內(nèi)，其檢出率可達100%，尤其是100~500bp長度的片段[29]。因此，DGGE已被廣泛應(yīng)用于SNP的檢測。但該方法只能對突變進行粗略檢測，一般不能確定突變的位置和類型，最終還是要依賴于DNA測序[30]。

4 SNP在蜜蜂中的應(yīng)用

近年來，SNP標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于動植物的研究中，對動植物遺傳育種、種質(zhì)資源管理、物種進化等領(lǐng)域作出了巨大貢獻，已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的工具[31-33]。

SNP標(biāo)記技術(shù)在蜜蜂中的應(yīng)用近年間也已取得一定的進展。石元元[34]以中華蜜蜂為實驗材料，利用SNP技術(shù)判定了103只工蜂的126990個位點的基因型，篩選出3000個候選SNPs位點，最后選取1535個SNPs標(biāo)記構(gòu)建了東方蜜蜂的第一張遺傳圖譜，該圖譜包含了1535個遺傳標(biāo)記和16個連鎖群，其總的遺傳距離是3942.7cm，最大連鎖群的長度是574.5cm（包含180個標(biāo)記），每個標(biāo)記的平均遺傳距離是2.6cm。Sim?es[35]等和Evans[36]等用基因芯片對發(fā)育期的蜂王和工蜂進行研究，蜂王中上調(diào)表達的基因多數(shù)與機體的生理代謝相關(guān)，而工蜂中上調(diào)表達的基因則與工蜂的形態(tài)特征及行為特征密切相關(guān)。Ament[37]等用基因芯片技術(shù)在哺育蜂和采集蜂的腦部發(fā)現(xiàn)大量有關(guān)能量代謝的差異表達基因，采集蜂腦部和腹部的胰島素生長因子信號表達水平顯著高于哺育蜂，可能通過抑制與胰島素相關(guān)的代謝途徑，推遲蜜蜂采集行為的時間。潘嬌[38]等用蜜蜂幼蟲中新檢測的1722條基因和175條與王漿分泌可能緊密相關(guān)的基因，設(shè)計和制備了蜜蜂基因芯片，分別與王漿高產(chǎn)蜜蜂及王漿低產(chǎn)蜜蜂中的哺育蜂的頭部cDNA進行雜交，初步篩選出369條差異表達的基因，并獲得潛在作為王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的10個候選基因。Kim[39]等鑒定出的SNP標(biāo)記AmD9成功區(qū)分了近親交配的蜜蜂品系，可以直接用于基因分型和育種應(yīng)用。Kadri[40]對30個巴西非洲化蜜蜂群的360只工蜂進行了高覆蓋率的重復(fù)測序，產(chǎn)生了高密度數(shù)據(jù)集，每個讀取點的平均讀取深度為20.25，該數(shù)據(jù)是非洲化蜜蜂可用的最大基因組資源，能夠?qū)Υ松锶肭终叩姆N群動態(tài)、進化和遺傳進行高分辨率的研究。Parejo[41]等表示一個低密度的SNP小組可以成為授粉媒介的保護管理工作的一個精確且具有成本效益的工具。

5 展望

作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，SNP已廣泛用于蜜蜂的遺傳圖譜、形態(tài)和行為特征、基因分型、種群動態(tài)及進化等方面。隨著基因組計劃的逐步深入、SNP檢測分析技術(shù)的快速發(fā)展、高通量測序成本的降低，相信SNP標(biāo)記技術(shù)會為蜜蜂的基因、遺傳、進化及保種等領(lǐng)域做出更大的貢獻。