副豬嗜血桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，國家民委中獸藥重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁 554300）

副豬嗜血桿菌（haemophilus parasuis，HPS）可引起以豬纖維素性多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的副豬嗜血桿菌病，也稱為豬革拉瑟氏?。╣lasser's disease，屬于多發(fā)性全身性疾?。1-3]。HPS 屬于革蘭氏陰性菌，隸屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是一種NAD 依賴型、不運(yùn)動(dòng)的細(xì)小桿菌。HPS 是一種條件性致病菌，正常存在于常規(guī)豬群上呼吸道中，在豬抵抗力低下或?qū)Νh(huán)境耐受減弱時(shí)，可侵入機(jī)體各器官引起發(fā)病。HPS 主要危害2周齡至4月齡的豬群，尤其對(duì)保育期和斷奶前后仔豬危害嚴(yán)重，發(fā)病率為10%～15%，病死率可高達(dá)50%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

近年來，副豬嗜血桿菌病在我國流行日趨嚴(yán)重，在四川、河北、湖南、湖北、寧夏、廣東等多個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)）均有發(fā)生[1，4]。副豬嗜血桿菌病防控的關(guān)鍵在于及時(shí)確診并采取相應(yīng)的防治措施。臨床上可根據(jù)發(fā)病豬群的病史、臨床癥狀和剖檢病理變化以及該病的流行病學(xué)特點(diǎn)作出初步診斷，然后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以確診。目前，副豬嗜血桿菌病常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有細(xì)菌分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。本文對(duì)副豬嗜血桿菌病的診斷方法進(jìn)行全面綜述，以期為該病防控提供參考。

1 細(xì)菌分離鑒定

HPS 生長要求條件較高，培養(yǎng)較為困難，通常選擇含有血清和NAD 的TSA、TSB 培養(yǎng)基或巧克力瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。該菌非常脆弱，在外界環(huán)境中很容易死亡，所以HPS 的成功分離培養(yǎng)常作為鑒定副豬嗜血桿菌病的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌分離鑒定時(shí)的病料應(yīng)采集于未經(jīng)抗生素治療過的急性期病豬，主要包括肺臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液、心包液和腦脊液等。僅從鼻腔、扁桃體和氣管中分離出細(xì)菌無法評(píng)估疾病是由HPS 引起的。采集的病料應(yīng)盡快送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，一般不得超過24 h。利用添加了血清和NAD 的TSA 培養(yǎng)基純化分離菌株時(shí)，挑取單個(gè)無色透明、針尖大小，呈圓形、邊緣整齊、光滑濕潤的可疑菌落涂片后進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察是否為革蘭氏陰性短小桿菌[6]。挑取上述可疑菌落水平劃線接種于不含NAD 的鮮血平板上，然后用金黃色葡萄球菌垂直劃線接種培養(yǎng)48 h，觀察是否出現(xiàn)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象[6]。挑取上述可疑菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、尿素酶、甘露醇和硝酸鹽（還原）等。綜合菌落形態(tài)、細(xì)菌染色鏡檢形態(tài)和生化試驗(yàn)結(jié)果可確診[7]。

細(xì)菌分離鑒定不足之處在于操作復(fù)雜，用時(shí)較長，所需試劑盒儀器較多，無法滿足快速檢測(cè)的要求。盡管細(xì)菌分離鑒定有很多不足之處，但是該方法特異性較強(qiáng)，在細(xì)菌培養(yǎng)過程中能夠發(fā)現(xiàn)共同感染的其他病原微生物，而且細(xì)菌分離鑒定是其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。

2 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是利用抗原抗體的特異性結(jié)合，對(duì)樣本中抗原或抗體進(jìn)行定性和定量的一種分析檢測(cè)方法。目前血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)很多，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme labeled immunosorbent assay，ELISA），間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination assay，IHA）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement fixation test，CF）是比較常見的HPS 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

鄭新添等[8]以HPS 外膜蛋白Omp16 為包被抗原，建立了檢測(cè)HPS 的間接ELISA 方法。該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，與進(jìn)口商品化試劑盒有較高的一致性。石保秋[6]用HPS 的細(xì)胞致死膨脹素（cytolethal distending toxin，CDT）中一個(gè)免疫原性最好的C 亞基（CdtC 蛋白）作為包被抗原，建立了HPS 間接ELISA 檢測(cè)方法。該方法重復(fù)性好，無交叉反應(yīng)，敏感性高（100%）、特異性好（92.9%）。王正皓[9]通過原核表達(dá)和純化HPS 的YfeA 蛋白，構(gòu)建了基于該蛋白的抗體檢測(cè)間接ELISA 方法。該方法具有良好的重復(fù)性、特異性和穩(wěn)定性，與進(jìn)口商品化試劑盒的陽性和陰性符合率較高。朱曉明等[10]以錳依賴的超氧化物歧化酶（manganese-dependent superoxide dismutase，MSD）作為包被抗原，建立了HPS 間接ELISA 檢測(cè)方法，但該方法只能保證對(duì)HPS的4、5 和12 血清型進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。石碧等[11]提取了HPS 血清5 型菌株的莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS），并以其為抗原分別建立了IHA 和間接ELISA 兩種抗體檢測(cè)方法。兩種檢測(cè)方法的特異性都很好，但ELISA 檢測(cè)方法敏感性是IHA 的5～10 倍。徐引弟等[12]選用HPS 的4、5和13 型3 種血清型為抗原，建立了一種檢測(cè)HPS抗體的IHA 檢測(cè)方法。該方法敏感性較瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)高，但特異性不太強(qiáng)，仍然將胸膜肺炎放線桿菌檢測(cè)為陽性。

與IHA 和CF 方法相比，ELISA 檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性高，而且具有穩(wěn)定、簡單、特異、快速、靈敏和易于自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)，而且1 d 內(nèi)能夠檢測(cè)幾百甚至上千份樣本，是一種良好的早期診斷方法。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)

由于HPS 在外界環(huán)境中容易死亡，且生長條件苛刻，所以臨床上很難通過病原分離來確診，血清學(xué)檢測(cè)也存在一定的不確定性，而分子生物學(xué)檢測(cè)方法的引入大幅提高了診斷的準(zhǔn)確性。近年來，隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，針對(duì)HPS核酸建立了多種檢測(cè)方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），熒光定量PCR 技術(shù)，數(shù)字PCR 技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等。

3.1 普通PCR 技術(shù)

馬超鋒等[13]根 據(jù)GenBank 中HPS 的16SrRNA 基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了1 對(duì)特異性引物，構(gòu)建了檢測(cè)HPS 的PCR 方法。該方法敏感、快速、特異，對(duì)于病原的最小檢出量為7.2×10-6μg/mL，可用于臨床上HPS 感染的快速檢測(cè)。梁喬等[14]根據(jù)HPS 的infB基因序列設(shè)計(jì)合成1 對(duì)特異性引物，建立了一種針對(duì)HPS 的PCR 鑒別診斷方法。該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)，能檢測(cè)到的最低DNA 濃度為18.1×10-6μg/mL，可用于HPS 的實(shí)驗(yàn)室診斷。萬世平等[15]針對(duì)HPS的16SrRNA 基因設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，建立了一種能夠快速檢測(cè)HPS 的PCR 方法。該方法最低檢出量達(dá)10-3ng，且與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)。

除了單獨(dú)檢測(cè)HPS 的PCR 方法，還有能同時(shí)檢測(cè)多種病原的多重PCR 方法。朱新貴等[16]根據(jù)GenBank 中HPS 的16SrRNA、PILA、LIPO基 因保守序列和豬多殺性巴氏桿菌的16SrRNA、KMT1基因保守序列，同時(shí)建立了雙重及多重PCR 檢測(cè)方法。所建立的雙重及多重PCR 檢測(cè)方法具有準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)、快速的優(yōu)點(diǎn)，可用于HPS 和豬多殺性巴氏桿菌的臨床快速診斷。任梅滲等[17]根據(jù)HPS、豬多殺性巴氏桿菌、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株序列，以及各病毒和細(xì)菌的保守序列，分別設(shè)計(jì)7 對(duì)特異性引物，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)導(dǎo)致豬呼吸道綜合征疾病的7 種病原的多重PCR 方法。該方法靈敏、快捷、特異，能檢測(cè)出病原的多種血清型，為上述7 種病原的臨床診斷和流行病學(xué)研究提供了技術(shù)支撐。

PCR 檢測(cè)技術(shù)無須進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，只需從病料中提取DNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲取目的片段就可以作出診斷。PCR 檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以獲得檢測(cè)結(jié)果，很大程度上縮短了病原檢測(cè)時(shí)間。

3.2 熒光定量PCR 技術(shù)

于江等[18]根據(jù)GenBank 中的HPSinfB基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，建立了一種檢測(cè)HPS的熒光定量PCR 檢測(cè)技術(shù)。該方法對(duì)HPS 具有良好的特異性，不與其他豬源細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)，敏感性比普通PCR 高100 倍，而且非常穩(wěn)定，重復(fù)性較好，批間與批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2.5%。本方法的建立滿足了HPS 快速診斷和定量檢測(cè)的需求。苗立中等[19]根據(jù)GenBank 中HPSinfB基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建了一種快速檢測(cè)HPS 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法。該方法敏感性達(dá)10 copies/μL，比普通PCR 高100 倍，重復(fù)性較好，重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2.5%，同時(shí)對(duì)HPS 具有良好的特異性，與其他病原均無交叉反應(yīng)，可用于臨床上HPS 的快速診斷和定量檢測(cè)。崔沛等[20]根據(jù)GenBank 中HPS 的16SrRNA 基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物和1 條特異性TaqMan-MGB 探針，建立了一種檢測(cè)HPS 的熒光定量PCR方法。該方法穩(wěn)定性強(qiáng)、特異性好、敏感性高，適用于臨床上HPS 感染的早期檢測(cè)，對(duì)HPS 的快速診斷和綜合防控均有重要意義。龐琳琳等[21]根據(jù)GenBank 中HPS 不同血清型的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了一種檢測(cè)HPS 的熒光定量PCR 方法。該方法具有較高的重復(fù)性、特異性和敏感性，組內(nèi)差異性小于2.5%，組間差異性小于4%，敏感性是普通PCR 的100 倍，適用于HPS 感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

采用熒光定量PCR 方法也可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種病原。姜睿姣等[22]根據(jù)HPS 的OmpP2基因序列和多殺性巴氏桿菌的PlpE基因序列分別設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，建立了一種能同時(shí)檢測(cè)HPS和多殺性巴氏桿菌的雙重?zé)晒舛縋CR方法。該方法和單一熒光定量PCR 最低檢測(cè)限相同，對(duì)HPS 及多殺性巴氏桿菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)濃度分別為5.60×10-2和7.58×10-2copies/μL，是常規(guī)PCR 的100 倍，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2.5%，能夠用于這兩種疾病的同時(shí)檢測(cè)。

熒光定量PCR 技術(shù)的靈敏度比普通PCR 提高了100 倍，很大程度上減少了假陽性概率，檢測(cè)結(jié)果判斷不用借助電泳分析，不但減少了溴化乙錠等核酸染料對(duì)試驗(yàn)人員身體的致癌危害和環(huán)境污染，而且還縮短了檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)結(jié)果更直觀，因而是一種安全且快速的診斷方法。

3.3 數(shù)字PCR 技術(shù)

數(shù)字PCR 技術(shù)是近年發(fā)展起來的第3 代PCR技術(shù)。它的原理是將預(yù)混的PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，形成幾萬至幾十萬個(gè)油包水的液化微滴，使每個(gè)微滴中只有1 個(gè)或不含有核酸模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，熒光檢測(cè)每個(gè)微滴中的陽性微滴數(shù)和陰性微滴數(shù)，然后根據(jù)泊松公布原理即可計(jì)算出核酸模板的初始拷貝數(shù)[23-24]。

石磊等[25]參考HPSOmpP2基因的保守序列設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan 探針，建立了一種能對(duì)HPS 準(zhǔn)確定量的微滴數(shù)字PCR 檢測(cè)方法。該方法與其他豬源的病原微生物均無交叉反應(yīng)，陽性質(zhì)粒的最低檢測(cè)濃度可達(dá)到2.647 copies/μL，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法相比，靈敏度和實(shí)際檢出率均有一定程度提高。該方法重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)，可用于HPS 低含量樣品檢測(cè)和定量檢測(cè)。數(shù)字PCR 的建立為HPS 檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了另外一種切實(shí)可行的方法。

與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)相比，數(shù)字PCR 技術(shù)具有精準(zhǔn)、靈敏度超高和不易受PCR 抑制物影響等優(yōu)點(diǎn)[26-28]。這可能是因?yàn)閿?shù)字PCR 技術(shù)直接計(jì)算目標(biāo)分子數(shù)而不依賴任何校準(zhǔn)物或者外標(biāo)，直接通過計(jì)算單個(gè)分子實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。但是數(shù)字PCR 技術(shù)也存在一些不足，比如：檢測(cè)所需時(shí)間較長，是實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的2～3 倍；檢測(cè)樣本需要稀釋到一定濃度才可檢測(cè)；單個(gè)樣本檢測(cè)成本高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，所需儀器設(shè)備昂貴。

3.4 LAMP 技術(shù)

LAMP 技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)[29-30]。該技術(shù)主要利用BstDNA 聚合酶的鏈置換作用進(jìn)行DNA 擴(kuò)增，需選取靶基因上6 個(gè)特定的區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，所以LAMP 技術(shù)引起非特異性擴(kuò)增的概率極小，特異性較強(qiáng)。LAMP 技術(shù)敏感性較高，而且反應(yīng)所需時(shí)間較短，在恒溫條件下1 h 之內(nèi)即可完成，擴(kuò)增量可達(dá)到1010倍。另外，LAMP技術(shù)的反應(yīng)結(jié)果便于觀察，適用于臨床上的快速檢測(cè)。

車勇良等[31]參考GenBank 中HPS 的肽聚糖相關(guān)脂蛋白（peptidoglycan associated lipoprotein，PalA）基因序列，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了一種HPS 可視化LAMP 檢測(cè)方法。該方法的DNA最小檢測(cè)限為40 fg，敏感度較高，是普通PCR 檢測(cè)方法的100 倍；整個(gè)檢測(cè)反應(yīng)只需要在55 ℃水浴1 h 即可；反應(yīng)結(jié)束后只需向反應(yīng)液中加入熒光染料，通過肉眼就能辨別檢測(cè)結(jié)果。該方法檢測(cè)快速、簡便，適合在養(yǎng)殖場(chǎng)和獸醫(yī)基層推廣使用。劉亞娟等[32]根 據(jù)GenBank 中HPS 的16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)6 條引物，建立了一種檢測(cè)HPS 的LAMP 方法。該方法僅需在65 ℃下反應(yīng)15 min，便能實(shí)現(xiàn)肉眼可視化直接判定結(jié)果，并且具有較高的靈敏度，最低DNA 可檢測(cè)濃度為0.175 fg/μL，比普通PCR 高104倍，重復(fù)性和穩(wěn)定性均在95%以上，對(duì)可疑臨床樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確率為100%，適用于養(yǎng)殖場(chǎng)和基層的HPS 快速鑒別診斷。

采用LAMP 檢測(cè)方法也可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種病原。劉博婷等[33]根據(jù)HPS 的infB基因和豬鏈球菌2 型的Cps2j基因分別設(shè)計(jì)1 套LAMP 引物，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)HPS 和豬鏈球菌的雙重LAMP 檢測(cè)方法。該方法的靈敏度較常規(guī)PCR 提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，而且與其他病原菌無交叉反應(yīng)。采用普通PCR 方法和該雙重LAMP 方法同時(shí)對(duì)同一批臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出率分別為17.0%和31.0%。這說明該雙重LAMP 方法具有良好的靈敏度和特異性，可實(shí)現(xiàn)兩種病原的同步快速檢測(cè)，對(duì)臨床上這兩種病原共同感染的檢測(cè)有很大幫助。

到目前為止，LAMP 技術(shù)是檢測(cè)HPS 所需時(shí)間最短的一種檢測(cè)方法，且靈敏度高于PCR 技術(shù)，一般是PCR 技術(shù)的102～104倍。LAMP 技術(shù)具有所需設(shè)備簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)迅速、操作簡單、產(chǎn)物檢測(cè)方便等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些不足，比如引物設(shè)計(jì)和篩選難度大，因靈敏度高易出現(xiàn)假陽性等。

4 小結(jié)與展望

目前，副豬嗜血桿菌病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法正由傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定轉(zhuǎn)向血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等更加快速、簡單和精確的方法。由于細(xì)菌分離鑒定耗時(shí)較長，無法滿足快速檢測(cè)需求，所以細(xì)菌分離鑒定在臨床診斷上的應(yīng)用受到一定的限制。IHA、CF 和ELISA 等血清學(xué)檢測(cè)方法操作簡便、快速，但由于其特異性和敏感性不高，主要適用于豬群的群體篩查。與細(xì)菌分離鑒定和血清學(xué)鑒定等檢測(cè)方法相比，分子生物學(xué)檢測(cè)方法具有快速、特異、敏感和穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且在混合感染檢測(cè)上更有優(yōu)勢(shì)，尤其是普通PCR 檢測(cè)技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到副豬嗜血桿菌病的臨床檢測(cè)。因數(shù)字PCR 檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)所需時(shí)間較普通PCR 和熒光定量PCR 長，LAMP 檢測(cè)技術(shù)所需引物設(shè)計(jì)和篩選難度大，所以這兩種分子生物學(xué)檢測(cè)方法在臨床診斷上還未得到廣泛推廣。在未來，數(shù)字PCR 檢測(cè)技術(shù)和LAMP 檢測(cè)技術(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化。各種特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好和快速的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立和改進(jìn)，對(duì)疫苗免疫后的抗體水平檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的幫助，在指導(dǎo)副豬嗜血桿菌病的防控上具有重要意義。