簡(jiǎn)論高效液相色譜峰異?，F(xiàn)象

趙勝延，張秉慧，宋艷真，付夢(mèng)飛，施 萍

（1.河南省畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心許昌分中心，河南 許昌461000；2 許昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 許昌461000）

液相色譜是利用混合物中各組份在不同兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異，當(dāng)兩相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離，兩相中有一相是固定的，叫作固定相，有一相是流動(dòng)的，稱為流動(dòng)相。該方法逐漸更多地收編入《中華人民共和國(guó)獸藥典》，廣泛應(yīng)用獸藥檢驗(yàn)檢測(cè)中，如中藥黃芪多糖注射液、板藍(lán)根注射液的含量檢測(cè)，部分獸藥的性狀鑒別。該方法是一種在定性基礎(chǔ)上需有純物質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)定量分析。大多情況下，只要檢測(cè)方法、儀器條件設(shè)置正確，都能達(dá)到理想分析結(jié)果，但實(shí)踐中由于種種原因，存在目標(biāo)峰未出現(xiàn)、峰形異常、保留時(shí)間漂移等現(xiàn)象?，F(xiàn)就筆者工作中遇到的問(wèn)題，進(jìn)行歸納、整理、分析，總結(jié)如下，供同行參考。

1 未出現(xiàn)目標(biāo)峰

1.1 色譜柱的選擇 如方法規(guī)定C18 色譜柱，由于粗心錯(cuò)用了C8 色譜柱，因固定相的不同，使樣品中被測(cè)成分不能在固定相中被分離和吸附。

1.2 流動(dòng)相使用不當(dāng) 流動(dòng)相是攜帶待測(cè)物質(zhì)向前移動(dòng)的物質(zhì)，對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有一定的溶解能力，且不與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，若流動(dòng)相選擇錯(cuò)誤，致使待測(cè)物質(zhì)不能在固定相中被吸附和分離。

1.3 檢測(cè)器選擇不當(dāng) 檢測(cè)器大致分紫外、熒光、示差、二極管檢測(cè)器等，每種物質(zhì)都有自身特性，有的有紫外吸收基團(tuán)，有的是熒光基團(tuán)，具有熒光性的物質(zhì)，需要激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，如檢測(cè)雞蛋中氟喹諾酮類物質(zhì)，物質(zhì)的自身特性，只能用熒光檢測(cè)器時(shí)行檢測(cè)。

1.4 進(jìn)樣問(wèn)題 未進(jìn)樣或樣品分解，日常工作中，有時(shí)會(huì)工作疏忽，未設(shè)置進(jìn)樣體積，或樣品處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，比如注射用青霉素，樣品處量后長(zhǎng)時(shí)間未能及時(shí)進(jìn)樣，造成主藥成分降解。

2 峰形異常

2.1 雙肩峰或分叉 雙肩峰的出現(xiàn)，不但改變了形狀，保留時(shí)間也不穩(wěn)定。樣品在處理時(shí)濃度過(guò)大或進(jìn)樣體積過(guò)大而導(dǎo)致的過(guò)載、預(yù)柱或色譜柱污染、柱塌陷、進(jìn)樣器損壞都會(huì)出現(xiàn)這種情況。消除辦法：降低樣品濃度、更換色譜柱、更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子。

2.2 前伸峰 前伸峰的出現(xiàn)，使峰形嚴(yán)重不對(duì)稱，影響積分?jǐn)?shù)據(jù)處理，造成檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差。多見(jiàn)于進(jìn)樣量或樣品濃度過(guò)大、溶樣的溶劑相對(duì)于流動(dòng)相太強(qiáng)、保護(hù)柱或色譜柱污染或失效、柱溫等有關(guān)。因此樣品在處理時(shí)要用流動(dòng)相作溶劑，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定進(jìn)樣量。

2.3 拖尾峰 拖尾峰形狀與前伸峰形狀相反，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的影響相同，形成原因，多與柱超載、峰干擾、死體積過(guò)大、柱效下降、柱塌陷、檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確等有關(guān)、消除辦法：選擇合適樣品量，清潔樣品、調(diào)整流動(dòng)相，連接點(diǎn)降至最低，更換色譜柱等。

2.4 色譜峰出現(xiàn)多峰現(xiàn)象 檢測(cè)檢驗(yàn)中往往會(huì)出現(xiàn)比目標(biāo)峰多的峰，這些峰的出現(xiàn)，有時(shí)并不影響對(duì)檢測(cè)結(jié)果的積分定量，但會(huì)干擾對(duì)主峰的判斷。原因：未充分平衡進(jìn)樣器LOOP 管、進(jìn)樣器污染、前次進(jìn)樣的后流物未被沖洗出來(lái)、保護(hù)柱臟、色譜柱污染、流動(dòng)相被污染或用錯(cuò)流動(dòng)相、樣品分解或制樣進(jìn)引入了雜質(zhì)。認(rèn)真分析都不難排查和解決。我們?cè)谥茦迎h(huán)節(jié)做到一樣品一清理，保證樣品無(wú)污染。洗針液要用強(qiáng)洗液，并保證洗針液數(shù)量充足。進(jìn)樣時(shí)間設(shè)置合理，使目標(biāo)物的出峰時(shí)間足夠長(zhǎng)。流動(dòng)相用前過(guò)0.2um 膜過(guò)濾，除雜質(zhì)，保證保護(hù)柱干凈。樣品的濃度和進(jìn)樣量不能過(guò)高，避免色譜柱污染。

3 保留時(shí)間漂移

樣品在進(jìn)樣過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)被測(cè)物質(zhì)的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相差較大，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建處理方法進(jìn)行積分時(shí)，出現(xiàn)樣品峰丟失，導(dǎo)致無(wú)法積分定量，影響結(jié)果分析。形成原因：柱子平衡時(shí)間不充分，系統(tǒng)不穩(wěn)定。泵頭里有氣泡，造成泵壓力不穩(wěn)，脫氣機(jī)故障，脫氣不充分。溫度波動(dòng)過(guò)大，尤其樣品量大時(shí)，運(yùn)行時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，當(dāng)溫度降低或升高時(shí)，往往會(huì)造成保留時(shí)間向后或向前漂移。樣品濃度或進(jìn)樣體積過(guò)大。另外流動(dòng)相混合不均勻、色譜柱污染時(shí)，都會(huì)造成保留時(shí)間不穩(wěn)定。所以在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，上機(jī)前要充分混合流動(dòng)相。平衡色譜柱之前，一定要進(jìn)行充分濕沖或干沖，達(dá)到充分排氣，同時(shí)要開(kāi)啟脫氣機(jī)，保證整個(gè)液路無(wú)氣泡。平衡色譜柱時(shí)，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間不用的，進(jìn)樣前要平衡至少1 小時(shí)，經(jīng)常使用的儀器，要平衡至少半個(gè)小時(shí)。開(kāi)機(jī)同時(shí)，要保證室溫度穩(wěn)定，對(duì)附帶有柱溫箱的儀器，要在儀器方法中設(shè)定合適溫度。樣品的上機(jī)濃度要嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)要求，不可隨意增大濃度或進(jìn)樣體積。樣品量過(guò)多時(shí)，進(jìn)樣時(shí)要每隔10 針運(yùn)行一針標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

4 總結(jié)體會(huì)

峰異?，F(xiàn)象的產(chǎn)生，來(lái)自很多方面，如流動(dòng)相的選擇、溫度、進(jìn)樣量、樣品濃度，儀器方法的設(shè)置、柱子的選擇、污染或損壞等，所以工作中，只要檢驗(yàn)態(tài)度嚴(yán)謹(jǐn)，只要認(rèn)真按照標(biāo)準(zhǔn)方法操作，這些異?，F(xiàn)象都不難避免。