眼針對CIRI大鼠抗焦亡作用的機(jī)制研究①

劉昱麟 馬賢德 宋采秋 徐 暢 張雙雙 王 哲

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847)

中風(fēng)是近年來在老年人群中發(fā)病率較高的一種疾病，并且患者發(fā)病后往往伴隨著終身殘疾，這給患者和患者家庭帶來了嚴(yán)重的心理創(chuàng)傷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因患中風(fēng)而死亡的人數(shù)約600萬人，預(yù)計(jì)到2030年，中風(fēng)患病人數(shù)將增加20%，花費(fèi)也將達(dá)到2010年的2倍以上，因此中風(fēng)的防治方法將是未來幾年的人類社會(huì)一大難題[1，2]。西醫(yī)的經(jīng)典溶栓方案受到多種條件的限制，只有少數(shù)患者能符合條件，唯一被FDA批準(zhǔn)治療急性缺血性腦卒中的藥物僅有重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissue type plasminogen activator，rt-PA)。更值得注意的是，抗缺血性腦卒中藥物的研發(fā)也屢屢受挫。眼針療法為彭靜山教授根據(jù)“五輪八廓”，“全身精氣上注于目”及經(jīng)脈循行等理論為指導(dǎo)核心，所創(chuàng)立的一種微針療法。中醫(yī)認(rèn)為，腎精虧耗，水不涵木，肝陽偏亢，內(nèi)風(fēng)遂即而生，而眼針針刺肝區(qū)、腎區(qū)、上下焦區(qū)等能平肝潛陽，滋補(bǔ)腎精，平衡陰陽。而眼針在40余年缺血性中風(fēng)疾病的治療中也取得了顯著療效，因此我們認(rèn)為，眼針療法可能成為缺血性中風(fēng)新的防治手段。

研究表明，當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，細(xì)胞間信號傳遞迅速發(fā)生變化，機(jī)體可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)啟動(dòng)炎癥模式，隨著大腦細(xì)胞內(nèi)外炎癥相關(guān)因子過度表達(dá)，炎癥反應(yīng)也隨之產(chǎn)生。炎癥反應(yīng)是組織器官缺血再灌注后最重要的病理生理過程，在腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制中占據(jù)重要地位。而報(bào)道顯示，炎癥信號的大量激活可以誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC的產(chǎn)生，誘發(fā)炎癥小體形成，刺激caspase-1激活，使細(xì)胞向外分泌IL-1β、IL-18從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，同時(shí)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，加重腦缺血再灌注損傷[3,4]。研究表明，格列本脲是NLRP3的抑制劑，能阻斷NLRP3的表達(dá)，抑制炎癥小體形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]，且格列本脲可以改善缺血性腦中風(fēng)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目降低[6]，保護(hù)腦缺血時(shí)腦損傷的發(fā)生[7]。因此探明在腦缺血再灌注發(fā)生時(shí)，眼針療法對焦亡過程是否有調(diào)控作用有極為重要的意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)采用雄性SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠85只，體重(280±20)g，購自遼寧長生生物有限公司。實(shí)驗(yàn)中心許可證編號：SCXK(遼)2015-0001。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查后(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理審查編號：21000092017048)開始飼養(yǎng)。使用大鼠生長、繁殖用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)；喂養(yǎng)期間自由飲水，室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度45%。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 Anti-P2X7 antibody(貨號ab48871)，Anti-NLRP3 antibody(貨號ab214185)，Anti-pro Caspase-1 antibody(貨號ab179515)，Anti-TMS1/ASCantibody(貨號ab175449)，Anti-Caspase-1 antibody(貨號ab1872)，大鼠IL-1 beta ELISA試劑盒(貨號ab100768)和大鼠IL-18 ELISA試劑盒(貨號ab213909)購自abcam公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司。蛋白提取試劑和蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1分組方法 將85只SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)表法，分為假手術(shù)組(16只)和造模組(69只)，將造模成功的大鼠再次隨機(jī)均分為：模型對照組、眼針組、抑制劑組。

1.2.2模型復(fù)制 采用線栓法復(fù)制CIRI大鼠模型，方法參考馬賢德等[8]的研究方法。方法如下：采用10%水合氯醛，按照大鼠體重，0.3 ml/100 g給藥；大鼠麻醉仰臥于手術(shù)臺上固定，頸部備皮，在大鼠氣管旁開0.5 cm出剪開一條3 cm左右的切口，分離頸部肌肉，使頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈充分暴露，動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端后，電凝頸外動(dòng)脈并剪斷，在頸外動(dòng)脈游離端剪一“V”字口，使用帶有標(biāo)記的魚線(2.5號；直徑0.28 mm；魚線頭部打磨，分別于0.6 cm處、1.8 cm 和2.2 cm 處做標(biāo)記，以便判斷栓塞位置)從“V”字口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，感受到阻力后檢查魚線標(biāo)記，到達(dá)標(biāo)記后即為栓塞正確。

假手術(shù)組大鼠采用上述相同的術(shù)式進(jìn)行手術(shù)，但魚線栓塞深度僅為1 cm。

1.2.3模型評價(jià)

1.2.3.1行為體征評分 參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)[9]:0分為無癥狀；1分表現(xiàn)為對側(cè)前爪不能完全伸展；2分表現(xiàn)為肢體旋轉(zhuǎn)；3分表現(xiàn)為肢體不協(xié)調(diào)向?qū)?cè)傾倒；4分表現(xiàn)為不能自主行走，無意識。大鼠模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：缺血2 h后對大鼠進(jìn)行再灌注，再灌注后評價(jià)神經(jīng)功能缺損程度，將評分為1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。正常組未做處理。

1.2.3.2腦組織TTC染色 大鼠完成神經(jīng)功能缺損評分后過量麻醉后處死，取完整腦組織，-20冷凍30 min，從冰箱取出后均勻切成1.5 mm切片，水平放置于培養(yǎng)皿，加入2%TTC染液，于溫箱中37℃孵育40 min，中間翻轉(zhuǎn)組織切片一次。完成后拍照保存。

1.2.4干預(yù)措施 假手術(shù)組：大鼠不作處理，正常飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。模型對照組：大鼠不作處理，正常飼養(yǎng)至再灌注24 h后。眼針組：①干預(yù)時(shí)間：再灌注完成后即刻及再灌注8、16、24 h共計(jì)進(jìn)行4次干預(yù)。②干預(yù)材料：0.18×13毫針。③干預(yù)方法：選取眼針針刺穴區(qū)中的肝膽區(qū)、腎膀胱區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)進(jìn)行干預(yù)。采用自制的大鼠眼針定位器進(jìn)行眼周穴區(qū)定位，確定大鼠眼眶后，在眶內(nèi)0.2 cm進(jìn)行針刺。抑制劑組：大鼠一次性經(jīng)腹腔注射格列本脲，500 mg/kg。

1.2.5樣本采集 末次針刺后，大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置1 h后，離心保留血清。大鼠取血后采用過量麻醉法處死，各組大鼠中隨機(jī)抽取6例全腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，5例取電鏡組織浸泡于固定液中，剩余各組大鼠，冰面上分離海馬及缺血區(qū)周邊半暗帶腦組織，凍存于-80℃冰箱中以便后期使用免疫組織化學(xué)法、Western blot法檢測腦組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá)水平；ELISA法檢測腦缺血半暗帶組織中IL-1β、IL-18的含量；同時(shí)檢測腦組織中IL-1β、IL-18含量。

1.2.6指標(biāo)檢測

1.2.6.1ELISA法檢測腦缺血半暗帶組織中IL-1β、IL-18的含量 ELISA法檢測各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-18表達(dá)：將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品和各組收集到的組織所提取出的蛋白依次加入96孔板中(每孔100 μl)，在空白孔加入100 μl PBS。參照IL-1β、IL-18試劑盒說明書操作，于450 nm波長測定各孔的吸光光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IL-1β、IL-18的濃度。

1.2.6.2電鏡檢測焦亡小體 將固定4 h后的組織從緩沖液拿出后,經(jīng)乙醇、丙酮脫水,采用常規(guī)電鏡包埋技術(shù),再將包埋后的組織切成60 nm厚的超薄切片。用檸檬酸鉛及醋酸鈾將切片充分染色后,在透射電鏡下，每組選取5個(gè)隨機(jī)視野，觀察焦亡小體的形態(tài)并拍攝記錄。

1.2.6.3免疫組織化學(xué)法檢測腦組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法檢測腦組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá)位置及相對水平。將多聚甲醛中固定的腦組織取出，充分沖洗組織表面殘余的多聚甲醛溶液，制備常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水后采用抗原熱力修復(fù)法使抗原間閉合的醛基打開，去除內(nèi)源性過氧化物酶后用5% BSA封閉。加入一抗(1∶400) 4℃孵育過夜，從冰箱拿出后復(fù)溫 1 h 后加入二抗(1∶2 000)室溫?fù)u床孵育2 h，洗片后滴加DAB顯色液，適度時(shí)間終止顯色，滴加蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，隨后1%鹽酸酒精分化，封片。數(shù)碼顯微鏡下觀察染色情況，測定5個(gè)隨機(jī)視野中的平均光密度值，以5個(gè)隨機(jī)視野所測得的平均值作為該例樣本中目的蛋白的相對表達(dá)水平，隨后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6.4Western blot法檢測海馬組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá) 采用Western blot法檢測海馬組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá)水平的表達(dá)水平。將-80℃冷凍的海馬組織取出，加入WB及IP細(xì)胞裂解液(組織：細(xì)胞裂解液=100 mg：1 ml)，使用電動(dòng)勻漿機(jī)對腦組織進(jìn)行勻漿后提取總蛋白。采用BCA法測定總蛋白濃度，加入上樣緩沖液(×5)沸水浴5 min使蛋白變性。以每孔50 μg的上樣量進(jìn)行上樣，電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)5% BSA封閉后，加入一抗(濃度1∶500)于冰箱(4℃)孵育過夜，二抗(1∶2 000)室溫?fù)u床孵育2 h，洗膜后，將PVDF膜放入凝膠成像分析系統(tǒng)中，并滴加ECL工作液，曝光后采集圖像，使用灰度值分析軟件測定目的蛋白及內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該樣本中目的蛋白相對表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制統(tǒng)計(jì)圖表,計(jì)量資料服從正態(tài)分布時(shí),采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1模型評價(jià)

2.1.1行為體征評分 模型復(fù)制后，由于手術(shù)過程中發(fā)生意外，死亡3只，3只大鼠行為體征評分為零，予以剔除；因此造模結(jié)束后假手術(shù)組共計(jì)16只，造模組共計(jì)63只。與假手術(shù)組比較，造模組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著增高，且P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2.1.2TTC染色結(jié)果 造模結(jié)束后，從假手術(shù)組和造模組中隨機(jī)抽取1例進(jìn)行TTC染色，染色結(jié)果如圖2所示：假手術(shù)組腦組織未見異常；造模組右側(cè)腦組織局部出現(xiàn)白色區(qū)(白色區(qū)即為缺血缺氧區(qū))。

2.2各組大鼠一般狀態(tài)

2.2.1基本情況 造模成功后將TTC染色后剩余62只大鼠，按照隨機(jī)數(shù)表法分成眼針組21只，抑制劑組20只，模型對照組21只。假手術(shù)組15只大鼠，飲食運(yùn)動(dòng)如常，傷口愈合良好，毛色光亮，精神佳。模型對照組大鼠，精神萎靡，姿態(tài)呈蜷縮睡眠狀，輕拍籠底有緩慢移動(dòng)，抑制劑組、眼針組大鼠，飲食尚可，運(yùn)動(dòng)欠靈活，精神欠佳，但精神狀態(tài)與活動(dòng)度已明顯優(yōu)于模型對照組大鼠。

2.2.2行為體征評分 治療結(jié)束后，由于治療過程中發(fā)生意外及大鼠自身抵抗力等不可控力，模型對照組大鼠死亡6只、眼針組大鼠死亡4只、抑制劑組大鼠死亡4只，予以剔除；因此治療結(jié)束后，假手術(shù)組共計(jì)15只，模型對照組共計(jì)15只，眼針組共計(jì)17只，抑制劑組共計(jì)16只。與假手術(shù)組比較，模型對照組、眼針組、抑制劑組大鼠行為體征評分明顯升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型對照組比較，眼針組、抑制劑組大鼠行為體征評分明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與眼針組比較，抑制劑組大鼠行為體征評分明顯改變(P>0.05),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.3ELISA法檢測腦組織及腦缺血半暗帶組織中IL-1β、IL-18的含量 各組大鼠ELISA法檢測顯示：與假手術(shù)組比較，模型對照組、眼針組、抑制劑組大鼠IL-1β、IL-18的表達(dá)含量明顯升高(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與模型對照組比較，眼針組、抑制劑組大鼠IL-1β、IL-18的表達(dá)含量明顯降低(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與眼針組比較，抑制劑組大鼠IL-1β、IL-18的表達(dá)含量無明顯變化(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

圖1 造模后各組間行為體征評分差異Fig.1 Differences in behavioral sign scores between groupsafter modelingNote:*.P<0.05.

圖2 TTC染色結(jié)果Fig.2 TTC staining results

2.4電鏡觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞中細(xì)胞焦亡的發(fā)生 假手術(shù)組：細(xì)胞膜完整，通透性未見異常； 細(xì)胞器，細(xì)胞核等未見異常；模型對照組：細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，失去完整性，可見細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞器破壞，內(nèi)容物釋放 ；眼針組、抑制劑組：細(xì)胞膜通透性稍有增高，內(nèi)容物完整,偶見細(xì)胞器損壞，見圖5。

圖3 治療后各組大鼠行為體征評分差異柱狀圖Fig.3 Differences in behavioral signs scores between groups after treatmentNote:Compared with the Sham-operated group,**.P<0.01;compared with the model group，##.P<0.01.

圖4 各組大鼠腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)(ELISA)Fig.4 Expression of related proteins in brain tissue of rats in each group(ELISA)Note:Compared with the Sham-operated group,**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01.

圖5 透射電鏡掃描結(jié)果(×7 000)Fig.5 TEM scan results(×7 000)

2.5免疫組織化學(xué)法檢測腦組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá) 各組大鼠免疫組織化學(xué)檢測顯示：與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠腦組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較，眼針組P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；抑制劑組大鼠腦組織中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與眼針組比較，抑制劑組大鼠腦組織中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),P2X7R表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖6。

圖6 各組大鼠腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)(IHC)Fig.6 Expression of related proteins in brain tissue of rats in each group(IHC)Note:Compared with the Sham-operated group,**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01；compared with the eye-acupuncture group,△△.P<0.01.

圖7 各組大鼠腦組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.7 Expression of related proteins in brain tissue of rats in each group(Western blot)Note:Compared with the Sham-operated group，**.P<0.01;compared with the model group,##.P<0.01；compared with the eye-acupuncture group,△△.P<0.01.

2.6Western blot法檢測海馬組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá) 各組大鼠Western blot結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠腦組織中P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組比較，眼針組P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；抑制劑組大鼠腦組織中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，P2X7R表達(dá)含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與眼針組比較，抑制劑組大鼠腦組織中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),P2X7R表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖7。

3 討論

中風(fēng)為全球第二大死因及高負(fù)擔(dān)疾病，僅2013年，全世界就有640萬人死于中風(fēng)。而在中國，中風(fēng)為首要致死疾病。根據(jù)2017NESS-China的一項(xiàng)研究顯示，中國人口腦卒中的患病率約為1 114.8/10萬人[10]。中風(fēng)按照國際疾病分類原則(ICD)分為3大類，即缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)、出血性腦卒中(Hemorrhagic stroke，HS)和病理類型未明確型腦卒中(Stroke of undetermined pathological type，UND)，而缺血性腦卒中占中風(fēng)患者的69.6%～70.8%[11]，因此，缺血性腦卒中是一項(xiàng)亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。

關(guān)于中風(fēng)疾病的防治手段，西醫(yī)往往采用溶栓療治，中醫(yī)通常運(yùn)用平肝熄風(fēng)醒腦開竅之法。眼針療法是由彭靜山教授根據(jù)《證治準(zhǔn)繩》《審視瑤函》首創(chuàng)的一種針刺針法[12]，目前該療法已被廣泛應(yīng)用于臨床三百多種疾病的治療，以療效顯著，患者痛苦輕，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)小的優(yōu)勢吸引著來自于世界各地的患者。研究結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠基本狀態(tài)欠佳，行為功能評分增高，這也與臨床腦卒中患者的一般狀態(tài)一致，因此我們的研究結(jié)果也將對臨床有重要的指導(dǎo)意義。

前期，我們通過973課題，國家自然基金和多項(xiàng)省市級課題研究發(fā)現(xiàn)，眼針具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[13-16]，而炎癥反應(yīng)作為腦卒中疾病發(fā)生的關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，在腦缺血機(jī)制研究中有著十分重要的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠IL-1β、IL-18表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，眼針組與抑制劑組大鼠IL-1β、IL-18表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與眼針組比較，抑制劑組大鼠IL-1β、IL-18表達(dá)無明顯改變(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，在腦卒中發(fā)生的過程中，存在炎癥反應(yīng)表達(dá)增強(qiáng)，雖然眼針與抑制劑組的IL-1β、IL-18表達(dá)無明顯差異，但是兩者趨勢一致，因此眼針和抑制劑都能有效抑制炎癥的發(fā)生，從而減輕炎癥帶來的腦部損傷。

細(xì)胞焦亡是兼具凋亡和壞死的一種細(xì)胞死亡過程，其特點(diǎn)是細(xì)胞的裂解-包括細(xì)胞膜孔隙的形成，細(xì)胞腫脹壞死，大量細(xì)胞內(nèi)容物的釋放等[17]。焦亡的發(fā)生是以炎癥小體形成為主要基礎(chǔ)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[18]。P2X7受體(purinergic 2X7 receptor)是一種ATP門控的跨膜離子通道受體，是炎癥小體激活的關(guān)鍵因子，研究表明，細(xì)胞外ATP可以通過激活P2X7受體調(diào)控K+外流，誘導(dǎo)NLRP3(NLR family,pyrin domain-containing 3)的活化[19]。NLRP3是炎癥因子的重要組成部分[20-22]，目前研究表明，炎性小體是機(jī)體收到感染或細(xì)胞損傷信號后組裝的蛋白復(fù)合物，是募集和激活pro-caspase-1的平臺。啟動(dòng)蛋白NLRP3可以通過寡聚作用來利用炎性小體適配器分子ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)招募大量的procaspase-1[23]。procaspase-1是caspase-1的前體，活躍的caspase-1負(fù)責(zé)快速裂解細(xì)胞激活并向細(xì)胞外釋放IL-1β及IL-18等，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，這種由炎癥小體參與的細(xì)胞死亡方式稱為焦亡[24,25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CIRI大鼠腦組織中發(fā)生了細(xì)胞焦亡。與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這也與以往的報(bào)道一致。與模型對照組比較，眼針組P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；抑制劑組大鼠腦組織中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，P2X7R表達(dá)含量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明眼針能夠抑制P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減緩患者腦部炎癥小體聚集，降低炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。與眼針組比較，抑制劑組大鼠NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1、無明顯改變(P>0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P2X7R表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，NLRP3的抑制劑可以抑制細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白NLRP3與NLRP3相關(guān)的焦亡下游蛋白，而對P2X7R沒有調(diào)節(jié)作用，而眼針卻對焦亡進(jìn)程中的關(guān)鍵蛋白P2X7R、NLRP3、pro-caspase-1、ASC、caspase-1都有調(diào)控作用。

綜上所述，眼針可以通過抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生，多靶點(diǎn)調(diào)控腦卒中疾病，因此眼針可能將成為腦卒中疾病的新的治療方案。