牛病毒性腹瀉病毒診斷方法與防治措施

帕力達(dá)·阿奴爾別克

（新疆伊犁州尼勒克縣畜牧獸醫(yī)工作站 835700）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，與同屬的豬瘟病毒、羊邊界病毒在血清學(xué)上存在交叉反應(yīng)，BVDV 具有兩種基因型，根據(jù)是否存在細(xì)胞病變可以分為細(xì)胞病變型和非細(xì)胞病變型，細(xì)胞病變型的致病性較強(qiáng)。BVDV 感染會導(dǎo)致母牛繁殖障礙，給胎牛會造成持續(xù)性感染，導(dǎo)致胎牛畸形或死亡，BVDV 除了在臨床感染牛、羊、鹿、駱駝、豬等易感動物外，還可以造成疫苗等生物制品的污染，由于疫苗在生產(chǎn)過程中不可避免的需要使用牛血清等原輔料，如果牛血清等原輔料中存在BVDV，將造成生物安全的隱患，故加強(qiáng)BVDV 診斷與防治研究意義非常重大。為了準(zhǔn)確診斷BVDV，除了根據(jù)臨床發(fā)熱、腹瀉等臨床癥狀進(jìn)行臨床診斷外，主要以實(shí)驗(yàn)室診斷為主，現(xiàn)將BVDV 的主要實(shí)驗(yàn)室診斷方法和防治措施介紹如下。

1 RT-PCR 檢測方法

RT-PCR 檢測方法是當(dāng)前動物疫病診斷最常用的分子生物學(xué)檢測方法，由于可以檢測到不同致病源的特異性基因片段，故根據(jù)BVDV 的保守序列設(shè)計(jì)通用檢測引物以及根據(jù)不同基因型的差異序列設(shè)計(jì)分型檢測引物，即可實(shí)現(xiàn)BVDV 的鑒定和分型研究。李新培等[1]根據(jù)GenBank 中公布的BVDV 高度保守的5′UTR 序列分別設(shè)計(jì)鑒定引物及分型引物，建立了BVDV 的鑒定RT-PCR 檢測方法及分型RT-PCR 檢測方法，鑒定引物對BVDV-1 型和BVDV-2 型均可以擴(kuò)增出大小為288bp 的特異性片段，分型引物對BVDV-1 型和BVDV-2 型可以分別擴(kuò)增出大小為316bp 和110bp 的特異性片段，該檢測方法可以用于BVDV 的流行病學(xué)調(diào)查和臨床病料檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。

2 熒光定量PCR 檢測方法

熒光定量PCR 檢測方法是在常規(guī)PCR 方法中融匯光譜技術(shù)發(fā)展起來的一種敏感性更高的核酸定量檢測技術(shù)，劉存等[2]建立了BVDVSYBR Green 熒光定量PCR 檢測方法，該方法有很好的敏感性和特異性，敏感性達(dá)到10 拷貝的最低檢測下限，與牛副流感病毒3 型、牛傳染性鼻氣管炎病毒不存在交叉反應(yīng)，唯一不足的是不能實(shí)現(xiàn)與豬瘟病毒的鑒別診斷。王艷杰等[3]建立了BVDV-1 和BVDV-2 雙重TaqMan 熒光定量PCR鑒別檢測方法，該方法是根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒5′UTR 區(qū)設(shè)計(jì)鑒別檢測引物和探針，與豬瘟病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒等沒有交叉反應(yīng)，該方法對BVDV-1 的最低檢測下限為10 拷貝/μL，對BVDV-2 的最低檢測下限為100 拷貝/μL，可以用于BVDV 的臨床診斷及分型鑒別檢測。

3 LAMP 檢測方法

LAMP 檢測方法為一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡單和現(xiàn)場應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以用于疾病的快速臨床診斷。李家偉等[4]針對BVDV 5′UTR基因序列設(shè)計(jì)4 條特異性LAMP 檢測引物，通過優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度，建立了BVDV RT-LAMP 快速檢測方法，該方法在63℃等溫條件下50min 即可完成反應(yīng)，最低可檢測到10-6倍稀釋的BVDV 病毒液，比常規(guī)RT-PCR 檢測方法的靈敏度至少高100 倍，與其他病毒沒有交叉反應(yīng)，具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，可以用于BVDV 的現(xiàn)場診斷和監(jiān)測。

4 ELISA 檢測方法

ELISA 方法因具有操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量、易于大規(guī)模檢測等優(yōu)點(diǎn)，在動物疫病臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查中得到了廣泛應(yīng)用。胡俊英等[5]利用制備的BVDV 單克隆抗體與多克隆抗體建立了BVDV 抗原的雙抗體夾心ELISA 方法，該方法具有較高的特異性和敏感性，該方法可檢測到160倍稀釋的BVDV 陽性糞便樣品，與牛腸道病毒、口蹄疫病毒、牛細(xì)小病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，該方法與常規(guī)RT-PCR 方法的符合率達(dá)到100%，雙抗體夾心ELISA 方法非常適合于大規(guī)模樣品中BVDV 感染的流行病學(xué)調(diào)查，為BVDV 感染的診斷、檢疫、凈化及防治提供了有效的技術(shù)手段。

5 防控措施

BVDV 沒有特效治療藥物，預(yù)防本病最有效的方法是疫苗免疫接種，對6～10 月齡的犢牛接種滅活疫苗，牛場要堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，不從疫區(qū)引進(jìn)犢牛，新引進(jìn)的犢?？梢酝ㄟ^采血監(jiān)測血清中和抗體，BVDV 抗體陰性方可以混合飼養(yǎng)[6]。由于公牛的精液也可以傳播BVDV，所以注意在配種時(shí)也要加強(qiáng)公牛的病毒檢測，確保配種所用的種公牛沒有感染病史，排除帶有牛病毒性腹瀉病毒及隱性感染的牛，減少安全隱患?？傊珺VDV 對養(yǎng)牛業(yè)危害巨大，是牛群高度易感的重要病毒性傳染病，養(yǎng)殖場要加強(qiáng)疫苗免疫接種和生物安全防控，發(fā)現(xiàn)帶毒?；疾∨Ｒ皶r(shí)隔離治療或淘汰，加強(qiáng)飼養(yǎng)場的環(huán)境消毒，保證飼料和飲水清潔，定期清理糞便，加強(qiáng)牛舍通風(fēng)換氣，做好防寒和保暖措施，引種時(shí)嚴(yán)格隔離檢疫，只有做到BVDV 的積極防控才能降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。

6 結(jié)語

BVDV 是一種接觸傳染性疾病，呈全世界分布，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展，加強(qiáng)BVDV 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)和防控措施對BVDV 的有效控制與凈化至關(guān)重要。當(dāng)前，在BVDV 諸多實(shí)驗(yàn)室診斷方法中，RT-PCR 方法操作簡單、檢測快速、只需要簡單的儀器設(shè)備，但其檢測靈敏度較熒光定量PCR 方法低。熒光定量PCR 方法的敏感性比常規(guī)RT-PCR 方法高，但該方法對試驗(yàn)人員技術(shù)水平、儀器設(shè)備要求均較高。LAMP 檢測方法無需儀器設(shè)備，操作簡單，該方法對引物設(shè)計(jì)的要求較高。ELISA方法高通量、操作簡單、適合大批量樣品的流行病學(xué)調(diào)查。在BVDV 的防控中，應(yīng)采取以預(yù)防為主的綜合防控措施，即加強(qiáng)疫苗免疫接種與生物安全、加強(qiáng)日常的飼養(yǎng)管理措施，盡量避免BVDV 的感染，對于已經(jīng)感染BVDV 的牛群應(yīng)逐步淘汰、凈化。