富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白基因敲除動物模型在腰椎間盤退變所致下腰痛研究中的應(yīng)用*

馬云龍 宋春雨 綜述 劉曉光 祝 斌 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院疼痛科，北京 100191)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是一種由遺傳因素、機(jī)械因素及環(huán)境因素等共同導(dǎo)致椎間盤(intervertebral disc，IVD)細(xì)胞衰老及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與分解代謝失衡的過程，常與下腰痛(low back pain，LBP)及其伴隨出現(xiàn)的精神睡眠障礙密切相關(guān)[1,2]。動物模型的建立為深入理解IVDD的發(fā)生與進(jìn)展，探索延緩IVDD及其相關(guān)的機(jī)體功能障礙等研究提供了可能。雖然已有多種動物模型用于IVDD和LBP的實驗研究，但多數(shù)為侵襲性建模方法，可能對實驗動物產(chǎn)生較大創(chuàng)傷并干擾實驗結(jié)果的評價與解釋，有關(guān)IVDD所致LBP的功能學(xué)研究報道也較少[3，4]。此外，這些模型均無法良好地模擬人類IVD自發(fā)性退變并產(chǎn)生LBP的漸進(jìn)性特征。富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)基因敲除的小鼠(SPARC-null)可緩慢地發(fā)生IVDD和LBP，產(chǎn)生類似于人類IVDD所致LBP的自發(fā)性與漸進(jìn)性過程[5，6]，而且建模過程并不會對實驗動物產(chǎn)生過多傷害，可能是研究IVDD與LBP相互關(guān)系的一種理想動物模型。本文對SPARC基因敲除的小鼠模型在IVDD所致LBP研究中的應(yīng)用進(jìn)行文獻(xiàn)總結(jié)。

1 SPARC在IVDD和LBP中的潛在作用

SPARC又被稱為骨連接蛋白或基底膜蛋白40，主要表達(dá)于骨、腸黏膜、愈合傷口等組織中。人類SPARC由一個坐落于5q31～q33染色體的25.6kb長單基因編碼，包含10個外顯子和9個內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)包括四部分：氨基末端包含大容量低親和的鈣結(jié)合域，一個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，一個親水結(jié)構(gòu)域和羧基末端包含與膠原結(jié)合的細(xì)胞外鈣離子域[7]。SPARC的表達(dá)與基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白)關(guān)系密切，后者是ECM的主要結(jié)構(gòu)成分并參與維持ECM的機(jī)械穩(wěn)定性。SPARC通過分子結(jié)構(gòu)中氨基和羧基末端結(jié)構(gòu)域直接與結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白結(jié)合來影響前膠原加工及膠原纖維的形成、沉積和重塑過程[8～10]，還可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[11，12]，從而干擾 ECM內(nèi)環(huán)境中的合成與分解代謝平衡，最終影響細(xì)胞與ECM的相互作用和ECM的重塑。鑒于此，已有大量研究報道SPARC在調(diào)節(jié)骨礦物組織與軟骨組織代謝、線粒體功能變化、皮膚彈性改變、眼壓調(diào)節(jié)及細(xì)胞黏附與遷移等多種病生理過程中的重要作用[13～17]。此外，SPARC在多種惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病、早期白內(nèi)障形成、青光眼、糖尿病相關(guān)病變、成骨不全癥、心肌與骨骼肌疾病及傷口愈合不良等多種疾病的發(fā)生發(fā)展和治療方面也扮演著重要角色[8,12,14,15,18～21]。

IVD由纖維環(huán)(annulus fibrosus，AF)、髓核(nucleus pulposus，NP)和軟骨終板3部分組成，作為脊柱的重要組成結(jié)構(gòu)參與脊柱縱向屈伸、側(cè)向彎曲和旋轉(zhuǎn)等活動；組織學(xué)上，IVD由間盤固有細(xì)胞、膠原蛋白(Ⅰ～Ⅴ和Ⅹ～Ⅻ型膠原)及蛋白多糖等基質(zhì)蛋白為主的ECM組成[22]。IVDD是椎間盤突出癥、椎管狹窄癥、脊柱不穩(wěn)定等脊柱相關(guān)疾病的重要病理基礎(chǔ)，其病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為活躍細(xì)胞數(shù)量減少、參與ECM合成與組裝的基質(zhì)蛋白含量減少和分布變化、參與ECM降解的多種基質(zhì)蛋白酶表達(dá)增高、細(xì)胞表型改變以及炎癥反應(yīng)等[23]。目前，腰椎IVDD被認(rèn)為是慢性軸性和(或)根性LBP的主要影響因素[1，24]。IVDD引起LBP可能機(jī)制包括脊柱不穩(wěn)對椎小關(guān)節(jié)、椎旁肌肉和韌帶的刺激，IVD細(xì)胞分泌促炎因子增加及免疫細(xì)胞局部浸潤和激活所致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的放大，傷害刺激誘導(dǎo)IVD內(nèi)新生血管及神經(jīng)纖維支配的增加，以及持續(xù)傷害刺激對脊髓或髓上結(jié)構(gòu)和功能的敏化等[25,26]。

Gruber等[27]2004年首次報道SPARC在人類IVD組織中表達(dá)的證據(jù)，他們選取各年齡層(新生兒至老年人群)接受手術(shù)患者的IVD組織進(jìn)行免疫組學(xué)研究，結(jié)果顯示新生兒至0.19歲齡的IVD中，SPARC在所有AF外環(huán)細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，在NP和AF內(nèi)環(huán)細(xì)胞中陽性表達(dá)率較低，分別為76.0%和76.4%；與此相比，4.7～76歲齡的AF細(xì)胞中，SPARC的總體陽性表達(dá)率為66.7%(P=0.04)。隨后，該團(tuán)隊進(jìn)一步研究顯示靶向敲除SPARC基因的小鼠在14、19和20個月時表現(xiàn)出間盤退化表型，組織學(xué)觀察顯示，正常對照小鼠的AF組織中膠原纖維直徑均勻、纖維邊緣規(guī)則，SPARC基因敲除小鼠AF組織中膠原纖維的大小和直徑范圍廣泛、邊緣不規(guī)則[5]。此外，Tajerian等[28]研究顯示，IVD所致LBP表型的小鼠和人類均存在SPARC啟動子甲基化增加的情況，為直接確定SPARC啟動子區(qū)甲基化對基因啟動子活性的影響，將啟動子區(qū)域亞克隆至熒光素酶報告質(zhì)粒中，比較甲基化或模擬甲基化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚腎HEK293細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性變化，結(jié)果顯示甲基化或模擬甲基化處理的細(xì)胞內(nèi)熒光素酶相對活性較未處理組顯著降低(P<0.01)，提示SPARC啟動子區(qū)甲基化可沉默基因啟動子活性，這些結(jié)果表明SPARC啟動子甲基化所致SPARC蛋白失活在人類和動物IVDD和LBP中具有潛在作用。

2 SPARC-null小鼠模型建模方法及表征特點

20世紀(jì)80年代，Norose等[20]率先確立SPARC-null小鼠模型的傳統(tǒng)建模方法。通過分離129SV小鼠的SPARC基因中含外顯子2～5的BamHI片段構(gòu)建靶向載體，于外顯子4起始端插入2個新霉素耐藥基因表達(dá)盒，將pMC1單純皰疹病毒胸苷激酶構(gòu)建體克隆至基因組片段的3’端生成構(gòu)建體，并轉(zhuǎn)染至CCE胚胎干細(xì)胞；在條件培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)在G418耐藥STO胚胎成纖維細(xì)胞上，篩選耐藥菌落并分離DNA，并應(yīng)用Southernblot鑒定靶基因敲除的細(xì)胞；應(yīng)用Nsil消化基因組DNA產(chǎn)生野生型和突變型等位基因，將攜帶SPARC基因敲除的胚胎干細(xì)胞注射至C57BL/6J小鼠的胚泡期胚胎以產(chǎn)生嵌合體；將含嵌合體的雄性小鼠與雌性C57BL/6J小鼠回交產(chǎn)生第1代(F1)雜合子小鼠(SPARC+/-)，再將F1小鼠(SPARC +/-)繼續(xù)回交以產(chǎn)生第2代(F2)純合子基因突變型(SPARC-/-)和野生型(SPARC +/+)小鼠；連續(xù)回交10代以上獲得基因高度同源的純合突變型小鼠，該小鼠既不產(chǎn)生SPARC的mRNA，也不產(chǎn)生相應(yīng)蛋白[20]。

靶向敲除SPARC基因能夠加速年齡依賴性IVDD的發(fā)生，同時伴隨出現(xiàn)年齡依賴性的慢性LBP行為特征，主要表現(xiàn)為軸性腰痛、放射性下肢痛和運(yùn)動障礙[5,6,29]。針對SPARC-null小鼠對疼痛刺激的反應(yīng)特點進(jìn)行分類評估，該模型小鼠表現(xiàn)出對冷刺激和脊柱軸向拉伸引起的疼痛高度敏感，而對機(jī)械性或熱刺激不敏感[28]。該模型對刺激的敏感性存在位點特異性，小鼠的后爪和背部對冷刺激敏感性顯著高于尾部[6,30]。Millecamps等[30]進(jìn)行的一項橫斷面、多隊列、行為學(xué)和組織學(xué)研究探討LBP與腰椎IVD退變程度之間的關(guān)系，研究選取6～78周齡SPARC-null和野生型對照小鼠，評估IVD退變程度、軸性疼痛及放射疼痛等行為體征。SPARC-null小鼠在18、24、36周相比于同周齡對照小鼠，對軸向拉伸刺激以及后爪對冷刺激耐受性均呈顯著降低趨勢(軸向拉伸耐受性對比：3個周齡組P均<0.001；后爪對冷刺激耐受性對比：3個周齡組P均<0.01)；雖然對照組和SPARC-null組小鼠間盤退變評分隨年齡增長均逐漸增高，但直到78周齡，SPARC-null組間盤退變評分顯著高于對照組(P<0.001)，提示SPARC-null組小鼠間盤退變程度更加嚴(yán)重。這些結(jié)果表明，SPARC-null小鼠IVD退變程度呈現(xiàn)年齡依賴性增加。與此同時，2組小鼠對軸向拉伸的耐受性與IVD退變程度相關(guān)，但后爪對冷刺激的耐受性與IVD退變程度并不相關(guān)。36周齡以內(nèi)的SPARC-null小鼠相比年齡匹配的對照組小鼠，對軸向拉伸的耐受性較差，但54周齡2組小鼠對軸向拉伸的敏感性無明顯差別(P>0.05)；后爪對冷刺激敏感性在18周齡的SPARC-null小鼠中出現(xiàn)顯著升高(P<0.01)，而且隨年齡的增長而持續(xù)增加。Miyagi等[31]選取不同年齡層小鼠研究慢性IVD所致LBP的潛在分子機(jī)制；通過檢測后爪皮膚對冷、熱和機(jī)械刺激的敏感性以評價放射性疼痛；應(yīng)用握力實驗和懸尾實驗以評估軸向LBP；免疫組化檢測神經(jīng)纖維標(biāo)記物PGP 9.5和感覺神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)以識別IVD神經(jīng)支配；定量分析背根神經(jīng)節(jié)中CGRP和神經(jīng)肽Y的免疫反應(yīng)活性以及脊髓背角神經(jīng)元中的CGRP和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物離子鈣接頭蛋白-1的免疫反應(yīng)活性，以評估感覺神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性。結(jié)果顯示SPARC-null小鼠表現(xiàn)出對冷刺激敏感、軸向疼痛不適、IVD內(nèi)和IVD周圍感覺神經(jīng)支配的年齡依賴性增加、背根神經(jīng)節(jié)中CGRP和神經(jīng)肽Y的年齡依賴性上調(diào)、脊髓背角神經(jīng)元中降鈣素基因相關(guān)肽、GFAP和離子鈣接頭蛋白-1的年齡依賴性增加。這些結(jié)果表明，退化IVD中感覺神經(jīng)纖維支配增加、背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角神經(jīng)元的神經(jīng)可塑性可能是慢性椎間盤源性LBP的病理生物學(xué)基礎(chǔ)。

3 SPARC-null小鼠模型在IVDD與LBP行為學(xué)評價中的應(yīng)用

IVDD和慢性LBP常引起多裂肌內(nèi)的炎癥反應(yīng)和(或)結(jié)構(gòu)重塑過程，近期學(xué)者應(yīng)用SPARC-null模型探討IVDD和慢性LBP與腰椎多裂肌內(nèi)炎癥信號和結(jié)構(gòu)蛋白變化的相互作用關(guān)系。James等[32]的一項縱向病例對照研究探討自發(fā)性IVDD對多裂肌內(nèi)炎癥信號活性的影響及后者與IVDD進(jìn)展和嚴(yán)重程度的相關(guān)性，同時評估運(yùn)動或鍛煉在此發(fā)揮的預(yù)防作用。研究選取SPARC-null小鼠和對照小鼠并分為靜止組和運(yùn)動組，在小鼠9個月大時對2組進(jìn)行核磁掃描以確定IVDD，并從L2～6節(jié)段獲取多裂肌肌肉片段并檢測炎癥相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，SPARC-null小鼠與野生型對照組小鼠相比，多裂肌內(nèi)促炎因子IL-1β(P<0.0001)、IL-6(P=0.012)、TGF-β1(P=0.009)和脂聯(lián)素(P<0.0001)表達(dá)顯著增高，其中IL-1β的表達(dá)水平與IVDD嚴(yán)重程度顯著相關(guān)(P<0.0001)，運(yùn)動后能夠下調(diào)多個促炎因子的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明IVDD能夠增強(qiáng)多裂肌內(nèi)炎癥反應(yīng)，與IVDD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)；運(yùn)動本身能夠通過降低多裂肌內(nèi)的炎癥因子并延緩IVDD進(jìn)展。該團(tuán)隊后續(xù)進(jìn)一步研究顯示，SPARC-null小鼠的L1～2和L3～4節(jié)段分別呈現(xiàn)重度和輕度IVDD，對這兩節(jié)段多裂肌樣本進(jìn)行檢測顯示，重度IVDD節(jié)段的多裂肌內(nèi)結(jié)締組織厚度增加，膠原蛋白Ⅲ(P=0.02)、纖維連接蛋白(P=0.03)、結(jié)締組織生長因子(P<0.0001)、P物質(zhì)(P<0.05)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(P=0.02)和金屬蛋白酶組織抑制劑-2(P=0.03)表達(dá)水平顯著增高；然而，運(yùn)動組小鼠結(jié)締組織厚度呈現(xiàn)縮小趨勢，且前述參與形成多裂肌纖維網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)蛋白表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)。這些結(jié)果表明，慢性IVDD能夠促進(jìn)多裂肌內(nèi)部纖維化結(jié)構(gòu)改變，運(yùn)動同樣可以改善這些結(jié)構(gòu)重塑過程，改善IVDD的進(jìn)展及與其相關(guān)的LBP[33]。

此外，多項研究也在SPARC-null動物模型上評價部分鎮(zhèn)痛藥物對IVDD所致軸性疼痛和放射性疼痛的改善作用。Millecamps等[29]對6月齡SPARC-null小鼠和野生型小鼠(對照組)經(jīng)腹腔注射阿片類藥物嗎啡(6mg/kg)，藥物作用至90min時SPARC-null小鼠后爪皮膚對冷刺激的敏感性較對照組顯著降低(P<0.05)。同樣，Tajerian等[34]在此模型上評價嗎啡和α2腎上腺素能受體激動劑可樂定聯(lián)合應(yīng)用對軸性疼痛和放射性疼痛的影響，結(jié)果顯示嗎啡∶可樂定(100∶1)聯(lián)合應(yīng)用不僅在改善軸性疼痛方面表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，還可改善放射性疼痛的治療窗。Krock等[35]應(yīng)用此模型研究抑制Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)對延緩IVDD及改善LBP行為學(xué)特征的影響，研究選取7～9月齡雄性SPARC-null和野生型對照小鼠，應(yīng)用TLR4抑制劑TAK242連續(xù)治療8周，每周分別應(yīng)用握力試驗和丙酮試驗評估軸向疼痛和放射性疼痛，治療結(jié)束后檢測脊髓內(nèi)和腰椎IVD的組織細(xì)胞學(xué)改變以及相關(guān)蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與野生型對照小鼠相比，SPARC-null小鼠的軸性疼痛(P<0.01)和放射性疼痛(P<0.01)閾值基態(tài)水平較低，；慢性抑制TLR4能夠降低SPARC-null的上述疼痛表征。分子水平分析顯示，SPARC-null小鼠與對照組相比脊髓背角神經(jīng)元中CGRP和GFAP表達(dá)明顯增加(P<0.05)，但TLR4抑制劑處理SPARC-null組小鼠后兩者均出現(xiàn)顯著減少(藥物處理組與藥物未處理組對比：CGRP水平P<0.05；GFAP水平P<0.01)；SPARC-null小鼠IVD組織較對照組小鼠分泌較高水平促炎因子(SPARC-null組與對照組小鼠對比：IL-1α水平P<0.01；IL-1β水平P<0.05)，模型小鼠中的這些因子經(jīng)TLR4抑制劑處理后較藥物未處理組均顯著降低(藥物處理組與藥物未處理組對比：IL-1α水平P<0.01；IL-1β水平P<0.05)。這些結(jié)果表明，慢性抑制TLR4可降低SPARC-null小鼠LBP、疼痛相關(guān)神經(jīng)可塑性和IVD的炎癥反應(yīng)。

4 SPARC-null小鼠模型的其他表型

雖然SPARC-null小鼠在IVDD和LBP的研究應(yīng)用具有一定優(yōu)勢，但由于SPARC也參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種病生理過程的調(diào)節(jié)，因此，存在其他表型特征。1月齡SPARC-null小鼠表現(xiàn)出皮膚膠原纖維直徑減少、皮膚抗拉強(qiáng)度降低，這可能影響皮膚對疼痛刺激的敏感性，從而干擾疼痛行為學(xué)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]。SPARC-null小鼠可能還有成骨不全表現(xiàn)，SPARC基因單核苷酸多態(tài)性所致SPARC表達(dá)缺失，可能致使小鼠骨礦化基質(zhì)減少，隨年齡的增長骨小梁體積減少、總骨形成率降低從而出現(xiàn)成骨不全[36]，而且SPARC的誤義突變也可導(dǎo)致隱性成骨不全[19]。此外，SPARC缺乏可致B型淋巴細(xì)胞增殖受損，從而影響機(jī)體正常骨髓基質(zhì)功能[37]。

5 小結(jié)

不可否認(rèn)，既往動物模型在研究IVDD或LBP單一方面有良好的應(yīng)用價值，但大多數(shù)需對間盤和(或)神經(jīng)進(jìn)行物理性或化學(xué)性損傷，無法良好模擬IVD的自然退變與LBP功能障礙之間的相互作用與內(nèi)在聯(lián)系。SPARC-null小鼠模型基于SPARC基因敲除所致貫穿動物整個生命周期的一個緩慢性、年齡依賴性及自發(fā)性IVDD和LBP所建立，其相比以往模型能更準(zhǔn)確地模擬與評估人類中IVDD退變與功能障礙的動態(tài)演變過程，已逐步應(yīng)用于IVDD所致LBP的解剖學(xué)和疼痛行為學(xué)等相關(guān)研究。國內(nèi)學(xué)者應(yīng)用該模型的研究報告尚缺乏，可能與該動物模型建模時間和經(jīng)濟(jì)成本高(回交代數(shù)多、時間至少2年)有關(guān)，導(dǎo)致模型的獲取有一定難度。合理選擇優(yōu)化的基因編輯技術(shù)對該模型進(jìn)行改良可能一定程度上降低建模的時間和經(jīng)濟(jì)成本，便于國內(nèi)外學(xué)者的廣泛應(yīng)用和研究。此外，因SPARC基因的多重功能，對其進(jìn)行靶向敲除產(chǎn)生的其他表型可能干擾研究結(jié)果的判讀，需要對相關(guān)實驗結(jié)果進(jìn)行合理的分析與解釋。