慢性難愈合創(chuàng)面治療進展

趙斌 褚慶玉 李筱 熊白龍 陳安家

皮膚損傷是再生醫(yī)學中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。皮膚創(chuàng)面是由燒傷、割傷、壓迫或創(chuàng)傷引起的身體外表面或內(nèi)表面的損傷。傷口愈合需經(jīng)過止血期、炎癥期、肉芽組織形成期、組織重塑期4個過程[1]；而創(chuàng)面愈合的4個時期是連續(xù)進行；創(chuàng)面愈合經(jīng)過去除傷口處的死細胞和壞死組織，促進傷口床的血管生成，以及誘導再上皮化或完全替代修復表皮的過程。因此，根據(jù)傷口愈合的不同階段，提供不同的治療策略。隨著研究的深入，促進傷口愈合開發(fā)一些治療方法，如生長因子(GF)、干細胞(SC)、高分子支架，組織工程等。準確了解創(chuàng)面的病理學才能解決創(chuàng)面愈合不良的潛在因素，為難愈合傷口的有效治療提供解決方案。

1 傷口愈合的階段

1.1 止血期 創(chuàng)傷時，傷口血管收縮使出血減少，血小板與膠原蛋白發(fā)生一系列生化反應，血小板釋放凝血因子，最后，通過纖維蛋白堵住傷口止血。隨著研究深入，水凝膠的問世，被認為是良好的組織工程支架。支架分為可注射支架和不可注射支架?？勺⑸渲Ъ?，如原位形成水凝膠和膠水，被用于組織工程。多孔支架、網(wǎng)狀物等不可注射支架通常適用于骨、軟骨等硬組織的工程化。有學者用水凝膠黏附主動脈進行破裂壓力試驗，復合水凝膠的破裂壓力可達160 mm Hg，明顯高于動脈血壓(120 mm Hg)[2]。此外，復合水凝膠的黏附強度高于殼聚糖/四臂聚乙二醇苯甲酸凝膠，混合水凝膠不但具有較強的黏附力，而且是修復血管的理想材料[2]。同時，水凝膠具有仿生細胞外基質(zhì)、維持創(chuàng)面濕性環(huán)境、促進細胞增殖遷移、降低創(chuàng)面表面溫度、促進營養(yǎng)物質(zhì)擴散和滲透等諸多獨特優(yōu)越的性質(zhì)，在組織再生、藥物控釋、創(chuàng)面修復、干細胞移植等生命科學領(lǐng)域展現(xiàn)潛能[3]。

1.2 炎癥期 炎癥階段是傷口修復的重要階段之一，炎性反應不僅是預防傷口部位感染的重要因素[4]，而且是清除凋亡細胞和壞死細胞必要條件[5]。該階段受細胞和分子信號通路的調(diào)節(jié)，參與炎癥期的細胞中，血小板、巨噬細胞、免疫細胞(如嗜中性粒細胞，淋巴細胞和單核細胞)是最突出的細胞，其中，巨噬細胞是維持宿主穩(wěn)定的主要細胞，通過增強免疫應答對感染做出反應[6]。巨噬細胞有2種不同表型的炎性細胞：在炎癥早期，巨噬細胞激活為促炎型(M1， 又稱經(jīng)典活化的巨噬細胞)；而Th2細胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13)則使巨噬細胞極化為抗炎型(M2，又稱選擇性活化的巨噬細胞)[7]。促炎巨噬細胞因子[如白介素-1(IL-1)，IL-6，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，干擾素-γ]被激活，產(chǎn)生大量促炎介質(zhì)和細胞因子(IL-1、IL-12和TNF-α)，此外，抗炎介質(zhì)(IL-1受體拮抗劑和IL-10)促進了抗炎性巨噬細胞的活化以及一些GF的表達，包括TGF-β-1，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胰島素樣GF-1。M1型與早期炎癥有關(guān)，能快速殺滅入侵的細菌、維持組織局部低氧環(huán)境，而M2型參與創(chuàng)傷后期組織的修復和重建[8]。

炎性反應在增殖階段修復中起到重要的作用，但過度和延遲的炎癥會導致慢性傷口的形成。因此，炎癥調(diào)節(jié)劑或抗炎策略的應用被提出，以加快創(chuàng)面無瘢痕愈合，局部應用不飽和脂肪酸、纖維支架、含抗炎藥(如布洛芬和雙氯芬酸)的傷口敷料[9]，以及在傷口部位使用巨噬細胞/單核細胞活化劑葡聚糖[10]。事實上，活化巨噬細胞可以促進纖維化的形成。有學者報道了不同生物材料在輸送各種抗炎劑中的應用，各種炎性介質(zhì)和細胞因子、高分子支架、生物材料作為抗炎藥的傳遞系統(tǒng)已經(jīng)被再生醫(yī)學的許多其他研究者報道[11]。高分子支架是可降解生物材料的三維結(jié)構(gòu)，在傷口處釋放不同的藥物促進創(chuàng)面愈合[12]。

1.3 增殖期 增殖期是傷口愈合過程中另一個重要階段，皮膚細胞在傷口部位的增殖能力增加，提高創(chuàng)面愈合的效率。在皮膚細胞中，角質(zhì)細胞的增殖在傷口再生中尤為重要。角質(zhì)細胞細胞的增殖和終末成熟保持平衡對于傷口愈合至關(guān)重要[13]。因此，一種促進傷口愈合策略是促進和維持角質(zhì)形成細胞的增殖能力[14]與抑制角質(zhì)形成祖細胞的終末分化[15]被提出。

科學家研究上皮細胞增殖和終末分化調(diào)控的一些信號通路，如RHO、ROCK信號通路[16]，信號通路的阻斷促進角質(zhì)形成細胞的增殖。Tiger-17是一種小合成肽以濃度依賴的方式促進角質(zhì)形成細胞系和人皮膚成纖維細胞的遷移和增殖，成為皮膚創(chuàng)傷的有效治療。有數(shù)據(jù)表明，在小鼠全厚創(chuàng)面模型中局部應用Tiger-17可使創(chuàng)面面積由傷后第2天的67.3%減少到第9天的5.9%，因此，促進皮膚細胞增殖或抑制分化為靶點的藥物可作為促進創(chuàng)面愈合的一種策略[17]。然而，這些方法的應用，觸發(fā)了增殖期，應進行機械檢查，以確保細胞不癌變。

2 治療方法

2.1 血管生成的誘導 增生階段是膠原沉積、組織肉芽生成、血管再生、上皮形成的復雜過程。為加速傷口愈合，通過誘導血管生成促進創(chuàng)面愈合是另一種策略。

血管生成或新血管形成是指從血管網(wǎng)絡形成新血管的過程[18]。這種復雜的過程可能是由于傷口部位的低氧狀態(tài)所致，這對于向人體暴露氧氣和營養(yǎng)至關(guān)重要。然而，幾乎所有慢性傷口都報告了異常的血管生成[19]。促進血管生成已經(jīng)開發(fā)出了不同的方法。研究表明，源自植物和動物的天然成分可用于提高新生血管的形成，以促進慢性傷口的血管生成和創(chuàng)面愈合。例如，胡黃連和蘆薈已被證明具有促血管生成特性。這些天然化合物主要通過VEGF、TGF-β-1和bFGF等GF的過度表達來促進傷口愈合[20，21]。此外，動物衍生的成分(例如絲光綠蠅幼蟲)已用于傷口閉合[22]，蛆釋放一些具有促血管生成特性并能愈合傷口的因子通過上調(diào)VEGF表達來促進血管生成[23]。

2.2 促進再上皮化 再上皮化是傷口愈合中的關(guān)鍵，多種細胞共同參與，以實現(xiàn)傷口閉合。該過程中，角質(zhì)形成細胞在受傷24 h后連續(xù)從傷口邊緣遷移到傷口床，直到上皮細胞完整覆蓋傷口表面。此外，一些GFs如表皮生長因子(EGFs)，角質(zhì)形成細胞生長因子，趨化因子，細胞因子，角蛋白和細胞外基質(zhì)化合物在傷口愈合過程中影響角質(zhì)形成細胞的遷移和增殖[24]。 研究表明，促進上皮再形成可以使急性和慢性傷口創(chuàng)面愈合更快[25]。

Liu等[26]研究了使用毛囊單位促進慢性傷口的上皮再形成，對14例慢性傷口患者取全層頭皮真皮移植片；從移植物中分離出毛囊單位，并以4 U/cm2的密度移植到傷口床上。 組織學分析結(jié)果以及對臨床結(jié)果的評估表明，毛囊單位可促進慢性傷口的再上皮化。 最近有學者以山羊毛囊干細胞和真皮細胞為種子細胞，成功構(gòu)建了具有毛囊器官的組織工程皮膚[27]。為慢性創(chuàng)面治療提供一種新的治療方案。

2.3 組織工程 在組織工程中，細胞再生是受損組織修復的重要因素。 在創(chuàng)面修復過程中，角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞是皮膚的主要細胞[28]。角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞是傷口細胞治療方法中最常見的治療方法[29]。

皮膚移植為皮膚損傷的治療提供有活力的皮膚細胞。不同的皮膚移植方法(自體移植和異體移植，特別是自體移植)已經(jīng)成功地應用于臨床。雖然植皮方法具有優(yōu)越的臨床應用價值，卻面臨著一些困難，如排斥反應、疤痕、感染等問題。因此，皮膚替代品的應用被認為是臨床上最有前途的替代和模擬皮膚功能來促進傷口愈合的細胞。皮膚替代物在臨床應用中的開發(fā)一直是皮膚再生醫(yī)學和組織工程領(lǐng)域的研究熱點[30]。理想的皮膚替代物應具備：抗感染、預防失水、易貯存和長保質(zhì)期、無排斥反應。

成纖維細胞負責肉芽組織和膠原蛋白的合成，以及傷口愈合過程中蛋白酶和炎性介質(zhì)的釋放。成纖維細胞是適合開發(fā)的細胞治療方法的潛在來源。R&G在1970年代發(fā)現(xiàn)了一種將人類角質(zhì)形成細胞與放射3T3小鼠成纖維細胞培養(yǎng)的方法， 以促進角質(zhì)形成細胞的生長。結(jié)果，產(chǎn)生了角質(zhì)形成細胞不是很好的自體移植來源，因此被美國食品藥品監(jiān)督管理局視為異種移植物[31]。因此，許多研究已被用于進一步開發(fā)R&G的方法以開發(fā)不同的培養(yǎng)方法更適合臨床使用。有研究使用3種培養(yǎng)基，在分離過程中，與較長的培養(yǎng)時間相比，在高強度胰蛋白酶中的短培養(yǎng)時間導致釋放的角質(zhì)形成細胞干細胞數(shù)量增加。

在另一項研究中，Chowdhury等[33]報道了真皮成纖維細胞條件培養(yǎng)基(dermal fibroblasts conditioned medium，DFCM)在人類角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)中的應用。結(jié)果表明，DFCM的補充能顯著增加角質(zhì)形成細胞的黏附，添加角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)基(defined keratinocytes serum free medium，DFCM-DKSFM)培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞附著效率明顯高于成纖維細胞特異性無血清培養(yǎng)基(fibroblast-specific serum free medium ，DFCM-FD)和DKSFM培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞附著效率。此外，添加DFCM-DKSFM和DFCM-FD培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的膨脹指數(shù)分別是對照組的3.7和2.2倍。

盡管開發(fā)了不同類型的皮膚替代品的臨床應用，但皮膚替代物的應用仍面臨著成本高、效率低、無法完全重建皮膚附件等局限。用于治療皮膚疾病的培養(yǎng)上皮自體移植片(cultured epithelial autograft，CEA)片還有一些固有的局限性，除培養(yǎng)和制造的程序以外，還面臨易碎CEA的儲存和處理。此外，在CEA片的臨床應用的情況下，一個嚴重的局限性是要花費較長的時間才能達到適合移植的多層完整的CEA片。作為分化細胞如角質(zhì)形成細胞的替代方法，間充質(zhì)SC的應用是一種有前途的細胞學治療策略[34]。其中間充質(zhì)干細胞、表皮干細胞、毛囊干細胞、內(nèi)皮祖細胞是慢性創(chuàng)面治療最常見的方法。由于SC治療面臨免疫排斥、誘發(fā)癌變等缺點[35]。所以，臨床中特別關(guān)注無細胞治療戰(zhàn)略[36]。SC培養(yǎng)中含有多種活性成分，如干細胞生長因子(SCF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、角化細胞生長因子(KGF)、胰島素生長因子(IGF)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能夠影響細胞的存活、增殖、遷移和基因表達，促進組織再生[37]。

然而，SC移植可能與旁分泌調(diào)節(jié)作用有關(guān)，而不是損傷部位受影響細胞的替換。旁分泌是由GF、細胞因子、趨化因子組成，參與信號轉(zhuǎn)導、細胞生長、血管生成和凋亡。旁分泌介導的修復是再生醫(yī)學的一種新方法，分離和應用特定的SC來源的旁分泌因子可能是一種非常有前途的策略，將旁分泌療法作為一種新的可行的臨床應用[38]。

2.4 GF 在過去的幾十年中，GF作為細胞生長、增殖、遷移和其他細胞過程中的關(guān)鍵信號調(diào)節(jié)因子得到了發(fā)展。目前臨床上常用的GF包括：表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子、血管內(nèi)皮生長因子[39]。事實上，這些GF在傷口愈合中起著至關(guān)重要的作用，包括促進角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞等促進傷口愈合的最重要細胞類型的增殖和遷移；誘導血管生成；抑制炎性反應；刺激肉芽組織形成[40]。盡管GF在創(chuàng)面修復中發(fā)揮著重要作用，但其半衰期短、易破裂、價格昂貴等缺點限制在臨床的應用。因此，藥物傳遞系統(tǒng)的應用已經(jīng)被開發(fā)用于控制和持續(xù)釋放GF在皮膚潰瘍治療、燒傷和慢性傷口中的應用[41]。

2.5 高分子支架 許多研究人員已經(jīng)開發(fā)出使用各種支架的方法，這是組織工程的另一個方面，由天然合成或組合生物材料制成的，支架是一種有前途的三維結(jié)構(gòu)，通過模擬細胞周圍的微環(huán)境提高組織工程方法的效率。這些生物材料系統(tǒng)用于細胞遞送、基因遞送以及生物活性藥物遞送已經(jīng)被開發(fā)來恢復或再生有缺陷的組織。此外，許多研究人員已經(jīng)提出單獨將支架皮膚，或支架與GF二者結(jié)合用于傷口治療。目前，臨床上依據(jù)支架的材料分為：天然支架，合成支架和復合支架。而根據(jù)支架使用方法分為可注射支架和不可注射支架，可注射支架如原位形成的水凝膠被用于組織工程。不可注射如多孔支架，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通常適用于硬組織(例如骨骼和軟骨組織)的工程設(shè)計。隨著研究的深入，理想的支架(合適的機械性能，足夠的孔隙率，易加工性，高生物相容性和合適的生物降解率)的問世，將進一步提高再生慢性傷口的能力。

2.6 3D生物打印技術(shù) 近年來，3D生物打印技術(shù)可以解決供體皮膚受限，為創(chuàng)面修復注入新的動力，成為創(chuàng)傷修復領(lǐng)域新的話題。皮膚的主要細胞是角質(zhì)細胞、成纖維細胞、細胞外基質(zhì)(Ⅰ型和Ⅲ型膠原)。有學者將角質(zhì)細胞、成纖維細胞、膠原做原料材料，用3D生物打印技術(shù)制作出模擬天然成分的皮膚，將打印皮膚暴露在氣液平面，角質(zhì)細胞從底層吸收營養(yǎng)成分，不斷向表層分化推進形成角質(zhì)層并不斷促進表皮成熟[42]。3D打印技術(shù)分為噴光細胞打印和激光細胞打印，而激光細胞打印可以噴出多細胞團，成活率>98%。隨著3D生物高精度打印技術(shù)的成熟，利用3D 支架將干細胞輸送到創(chuàng)面是最有前途的治療方法。隨著干細胞生物學、生物支架制造技術(shù)的進步，組織工程技術(shù)將成為創(chuàng)面修復再生的治療措施[43]。

2.7 替代方法(如化學品、植物提取物、負壓傷口治療)

2.7.1 表皮干細胞(keratinocyte stem cells，KSCS):KSCS是促進表皮再生的最重要的表皮細胞[44]。在正常條件下，KSCS一般是靜止的細胞群，分裂傾向低，但在損傷時表現(xiàn)出很強的自我更新能力。損傷后，皮膚再生是通過激活傷口處的KSCS來實現(xiàn)的。用一些化學物質(zhì)或植物提取物預處理KSCS可以加速傷口愈合。有研究從豨薟草植物提取物ent-16β，17-二羥基貝殼杉烷-19-羧酸(ent-16β，17-dihydroxy-19-kauranoic acid，DHK)通過上皮生長因子受體磷酸化刺激KSCS增殖，促進創(chuàng)面愈合[45]。

2.7.2 冷氣壓等離子體 冷等離子體治療是治療傷口的理想方法，因為它具有誘導角質(zhì)形成細胞增殖，減少細菌種群和刺激皮膚細胞的能力。Hasse等[46]報道使用冷氣壓等離子體治愈慢性傷口，對慢性創(chuàng)面愈合有積極影響。結(jié)果顯示在治療3、5 min 后凋亡細胞增加。值得注意的是，冷血漿暴露1、3 min后，檢測到基底角朊細胞的增殖。這些細胞是表皮的再生細胞，這確實有利于傷口愈合，通過檢測生長和凋亡分子來研究冷血漿對人皮膚的影響，發(fā)現(xiàn)這兩個過程都依賴于治療時間[46]。因此，該方法為冷血漿在慢性創(chuàng)面治療應用提供了有希望的結(jié)果。 此外，冷血漿已成為促進傷口愈合和治療皮膚病的一種有吸引力的工具，冷大氣壓等離子體射流(atmospheric-pressure plasma jets，APPJs)在傷口愈合中亦可應用[46]。結(jié)果顯示，與對照組相比，APPJ治療10、20、30、40 s后的傷口每日改善顯著增強，分別在第12、10、7、13 d幾乎完全愈合。第7天觀察表皮細胞再生、肉芽組織增生和膠原沉積在組織學方面的最佳結(jié)果。治療50 s的傷口在第14天的愈合不如對照組。適當劑量的冷血漿可使創(chuàng)面周圍細菌失活，促進成纖維細胞增殖，加速創(chuàng)面愈合。然而，過量的血漿抑制了由于細胞凋亡或壞死而導致的傷口愈合。正、負效應可能與APPJ中活性氧和氮物種(ROS和RNS)的存在有關(guān)[47]。

2.7.3 負壓創(chuàng)面治療(negative pressure wound therapy，NPWT) 是20世紀90年代末出現(xiàn)的一種治療慢性創(chuàng)面的方法。廣泛應用急性創(chuàng)傷、糖尿病足、傷口感染、難愈合性創(chuàng)面，取得了良好的臨床效果。NPWT誘導的細胞形變有利于血管的生成和有絲分裂，此外，NPWT具有清除多余液體和細菌負荷、促進局部灌注的能力，有助于加速傷口邊緣組織的再生修復。NPWT不但能有效的防治傷口感染、促進傷口愈合，還能促進慢性難治傷口的愈合、減少住院費用、節(jié)約醫(yī)療資源[48]，智能負壓的出現(xiàn)，給NPWT的治療提供廣泛的空間，為臨床各類創(chuàng)面的治療提供技術(shù)保障。

2.7.4 中醫(yī)中藥 傳統(tǒng)中醫(yī)藥學對慢性難愈合性創(chuàng)面的治療由來已久，且治療效果療良好，積累許多的方法及經(jīng)驗，如煨膿生肌、祛腐長肉、活血化瘀等。濕潤暴露療法和美寶濕潤燒傷膏是一種中醫(yī)藥外用治療方法，經(jīng)過近三十年的實驗研究及臨床應用，廣泛運用于臨床體表慢性難治性傷口的治療[49]。有學者研究指出，艾灸聯(lián)合濕性愈合療法，縮短難愈合性傷口的愈合時間，減少換藥次數(shù)，減輕患者的痛苦，加速患者的整體康復水平[50]。

隨著各種治療方法的發(fā)展，治療難愈合性創(chuàng)面取得一定的成就，但慢性難愈合性創(chuàng)面的治療仍然是具有挑戰(zhàn)性的問題。隨著再生醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，具有抗炎、抗凋亡和血管生成作用的支架和(或)GF聯(lián)合應用，促進角質(zhì)細胞的增殖，加速上皮細胞遷移，縮短創(chuàng)面愈合時間，降低住院費用。