人參總皂苷對D-半乳糖致PC12細胞衰老的改善作用及其機制研究

喬巨慧 趙大慶 劉美辰 睢博文 劉穎 邢欣

摘 要 目的：研究人參總皂苷對D-半乳糖致PC12細胞衰老的改善作用及其機制。方法：將大鼠嗜鉻細胞瘤（PC12）細胞用D-半乳糖處理以建立細胞衰老模型。采用CCK-8法篩選D-半乳糖的建模濃度和人參總皂苷的給藥濃度。試驗設正常對照組、模型組和人參總皂苷低、高濃度組，檢測各組細胞衰老情況、細胞凋亡率、細胞周期和細胞中線粒體膜電位（MMP）、三磷酸腺苷（ATP）、活性氧（ROS）水平以及凋亡相關蛋白[B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）及其相關蛋X蛋白（Bax）、細胞色素C（Cyt-C）]和氧化損傷相關蛋白[核因子2相關因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶1（HO-1）]表達水平，另設陽性藥物組[5 mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）]和陽性對照組[D-半乳糖+5 mmol/L NAC]比較氧化損傷相關蛋白水平。結果：D-半乳糖能顯著抑制PC12細胞的存活率，臨界濃度為20 mg/mL;人參總皂苷可顯著增加D-半乳糖誘導衰老細胞的存活率，半數效應濃度為65 μg/mL，故將后續(xù)試驗人參總皂苷的低、高濃度設置為55、65 μg/mL。與正常對照組比較，模型組衰老細胞數明顯增加，細胞凋亡率和G1期細胞比例均顯著增加，S期細胞比例、細胞中MMP、ATP含量和Bcl-2蛋白以及線粒體中Cyt-C蛋白表達水平均顯著降低，ROS含量和Bax、Nrf2蛋白及胞漿內Cyt-C蛋白表達均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組衰老細胞數明顯減少，細胞凋亡率和G1期細胞比例均顯著降低，S期細胞比例、細胞中MMP、ATP（除低濃度組外）含量和Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白以及線粒體中Cyt-C蛋白表達水平均顯著升高，ROS（除低濃度組外）含量和Bax蛋白及胞漿內Cyt-C蛋白表達水平均顯著降低;陽性對照組細胞內Nrf2、HO-1蛋白表達水平亦顯著升高（P<0.05或P<0.01），但均低于人參總皂苷組。結論：人參總皂苷可改善D-半乳糖誘導的P12細胞衰老，其機制可能與激活Nrf2抗氧化信號途徑拮抗D-半乳糖誘導的氧化應激、緩解其所致的線粒體功能障礙有關。

關鍵詞 人參總皂苷;D-半乳糖;PC12細胞;衰老;線粒體;凋亡相關蛋白;氧化損傷相關蛋白

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the improvement effects of total ginsenosides on the senescence of PC12 cells induced by D-galactose and its mechanism. METHODS： Rat pheochromocytoma （PC12） cells were treated with D-galactose to establish cell senescence model. CCK-8 method was used to screen the D-galactose modeling concentration and total ginsenosides concentration. Normal control group， model group， total ginsenosides low and high concentration groups were set up. Cell senescence， cell apoptosis rate， apoptotic cycle and mitochondrial membrane potential （MMP）， cell adenosine triphosphate （ATP） and reactive oxygen species （ROS） levels in each group were detected. The expression of apoptosis related proteins [B lymphoma 2 （Bcl-2） and its related egg X protein （Bax）， cytochrome C （Cyt-C）] and oxidative damage related proteins [nuclear factor 2 related factor 2 （Nrf2），heme oxygenase 1 （HO-1）] were detected. In addition， positive drug group [5 mmol/L N-acetyl-L-cysteine （NAC）] and positive control group [D-galactose+5 mmol/L NAC] were set up to compare the levels of oxidative damage related proteins. RESULTS： D-galactose could significantly inhibit the survival rate of PC12 cells， with a critical concentration of 20 mg/mL. The total ginsenosides could significantly increase the survival rate of D-galactose induced senescent cells with a median effective concentration （EC50） of 65 μg/mL，and then the low and high concentrations of total ginsenosides were set at 55 and 65 μg/mL. Compared with normal control group， the number of aging cells increased， the apoptotic rate and percentage of G1 phase were significantly increased in model group. the percentage of S phase， MMP and ATP contents， the protein expression of Bcl-2 and Cyt-C in mitochondria were decreased significantly， while ROS content， the protein expression of Bax， Nrf2 and Cyt-C protein in endochylema were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the number of aging cells reduced， the apoptosis rates and percentage of G1 phase were significantly decreased in total ginsenosides low and high concentration groups， the percentage of S phase， the contents of MMP and ATP （except for low concentration group）， protein expression of Bcl-2， Nrf2 and HO-1 as well as protein expression of Cyt-C in mitochondria were increased significantly; ROS level （except for low concentration group） and Bax protein as well as protein expression of Cyt-C were decreased significantly. The protein expression of Nrf2 and HO-1 were increased significantly in positive control group （P<0.05 or P<0.01）， but it was lower than that of total ginsenosides groups. CONCLUSIONS： Total ginsenosides can improve D-galactose induced senescence of P12 cells，the mechanism of which may be related to activating Nrf2 antioxidant signal pathway to antagonize D-galactose induced oxidative stress and alleviating mitochondrial dysfunction.

KEYWORDS ? Total ginsenosides; D-galactose; PC12 cells; Senescence; Mitochondria; Apoptosis related protein; Oxidative damage related protein

衰老是神經退行性疾病發(fā)生的主要誘因，包括阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森?。≒D）在內的多種神經退行性疾病均表現出了典型的年齡依賴性[1]。這提示加速衰老的因子可能參與了神經退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，而延緩衰老可能會減少該類疾病的發(fā)生。衰老機制復雜，涉及基因組穩(wěn)定性下降、表觀遺傳改變、營養(yǎng)失調、蛋白水解異常、端?？s小、干細胞耗竭、線粒體功能障礙等多種因素[2-3]。其中，鑒于神經元代謝過程的高需氧量，線粒體功能紊亂可能是神經元衰老的核心因素[4]，同時也是引發(fā)神經退行性疾病的關鍵因素[5]。因此，尋找能夠有效維系線粒體功能進而延緩衰老的藥物，對于防治神經退行性疾病和衰老均具有十分重要的意義。

人參是被學者普遍認可的可以延年益壽的傳統中藥材之一，其具有大補元氣、生津止渴、安神益智、補脾益肺的功效[6-8]?！渡褶r本草經》提到，人參可以“補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，久服輕身延年”[9]?，F代藥理學研究表明，人參中的皂苷類成分可通過抑制氧化應激而延緩衰老，并對AD、PD等多種神經退行性疾病具有治療作用[10-12]，但其作用機制尚不明確。PC12細胞是常用的神經細胞株，是來源于成年大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的細胞系。本研究利用D-半乳糖誘導PC12細胞損傷模擬衰老模型，擬探索人參總皂苷對該細胞衰老的改善作用及其可能機制，旨在為深入研究人參總皂苷防治神經退行性疾病和衰老提供參考。

1 材料

1.1 儀器

iBright FL 1000型智能凝膠成像系統、FormaTM 3型CO2細胞培養(yǎng)箱、EVOS FL Auto型全自動細胞成像系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Infinite? 200 Pro型全自動酶標儀（上海帝肯貿易有限公司）;Flow Sight型多維全景流式細胞儀（德國Merck Millipore公司）;Mini Protean型蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）;Seahorse XFp型能量代謝分析儀（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

人參總皂苷[上海源葉生物科技有限公司，批號：S25997，純度：≥80%（以人參皂苷Re計）];D-半乳糖（大連美侖生物科技有限公司，批號：MB1853-1，純度：≥97%）;N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，美國Med Chem Express公司，批號：HY-B0215，純度：≥97%）;滅活胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）;胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素雙抗（美國Molecular Research Center公司）;細胞周期檢測試劑盒、RIPA裂解液、線粒體細胞分離試劑盒、2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針溶液、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、三磷酸腺苷（ATP）檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、羅丹明123染色工作液、細胞核蛋白抽提試劑盒、特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為C1052、P0013K、C3601、S0033-1、C0602、S0026、P0012S、C2007、P0027、P0018AS、S0033S）;異硫氰酸熒光素（FITC）-膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡檢測細胞試劑盒（美國BD Pharmingen公司，批號：556547）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配置液（北京索萊寶科技有限公司）;CCK-8試劑盒（美國Boster Biological Technology公司，批號：AR1199）;兔源B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）及其相關X蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（北京艾斯廷科技有限公司，批號分別為ab196495、ab53154、ab245357）;兔源細胞色素C（Cyt-C）、細胞色素C氧化酶Ⅳ（Cox Ⅳ）多克隆抗體（上海愛必信生物科技有限公司，批號分別為abs130083、abs131570）;兔源核因子2相關因子2（Nrf2）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：12721S）;鼠源血紅素氧合酶1（HO-1）、核纖層蛋白B（Lamin B）單克隆抗體（美國Proteintech公司，批號分別為66743-1-Ig、66095-1-Ig）;堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG二抗（美國Sigma公司，批號：A3687）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

大鼠PC12細胞株購自中國科學院（上海）細胞庫，由長春中醫(yī)藥大學人參科學研究院實驗室留種保存。

2 方法與結果

2.1 細胞培養(yǎng)

PC12細胞用含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合至80%～90%且生長狀態(tài)良好時，用胰蛋白酶消化，傳代，自第4代起用。

2.2 D-半乳糖對PC12細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測。取對數生長期的PC12細胞按1.6×108個/L、200 μL/孔接種于96孔板中。試驗設空白組、正常對照組和模型組，每組設6個復孔?？瞻捉M不含細胞和藥物;正常對照組細胞用完全培養(yǎng)液（RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素雙抗）培養(yǎng);模型組細胞用D-半乳糖終質量濃度分別為5、10、20、30、40 mg/mL的完全培養(yǎng)液分別在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8工作液20 μL，振蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（試驗組A值-空白組A值）/（正常對照組A值-空白組A值）×100%。試驗重復3次。采用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析;數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析;P<0.05表示差異有統計學意義（統計方法下同）。結果，當D-半乳糖質量濃度為20 mg/mL及以上時，細胞存活率顯著低于正常對照組（P<0.01），詳見表1。因此，選取對P12細胞起毒性作用的臨界濃度20 mg/mL作為后續(xù)試驗中D-半乳糖的干預濃度。

2.3 人參總皂苷對PC12衰老細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測。取對數生長期的PC12細胞按1.6×108個/L、200 μL/孔接種于96孔板中。試驗設空白組、正常對照組、模型組和藥物組，每組設6個復孔?？瞻捉M和正常對照組均按“2.2”項下方法處理培養(yǎng);模型組和藥物組細胞用含20 mg/mL D-半乳糖的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，藥物組細胞再加入人參總皂苷終質量濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 μg/mL（給藥濃度按預試驗設置）的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后按“2.2”項下“每孔加入CCK-8工作液20 μL”起進行操作，同法檢測各孔的A值并計算細胞存活率和半數效應濃度（EC50）。試驗重復3次。結果，與正常對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，人參總皂苷能提高PC12衰老細胞的存活率，并隨著給藥濃度的增加，細胞存活率也有增加趨勢，其中當質量濃度為8 μg/mL及以上時，組間比較差異均有統計學意義（P<0.01），詳見表2。人參總皂苷對PC12衰老細胞的EC50為65 μg/mL，為便于試驗延續(xù)，選擇55、65 μg/mL作為后續(xù)試驗中人參總皂苷的給藥濃度。

2.4 人參總皂苷對PC12衰老細胞數的影響

采用β-半乳糖苷酶染色檢測。取對數生長期的PC12細胞按4×108個/L、2 mL/孔接種于6孔板中。試驗設正常對照組、模型組和藥物組，除藥物組中人參總皂苷終質量濃度分別為55、65 μg/mL（分別記為人參總皂苷低、高濃度組，下同）外，其余處理、培養(yǎng)條件均與“2.3”項相同。培養(yǎng)24 h后，按照細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行染色，在倒置顯微鏡下觀察并對藍色衰老陽性細胞進行計數。結果，與正常對照組比較，D-半乳糖處理過的P12細胞中衰老細胞數明顯增加;經人參總皂苷處理后，各藥物組的衰老細胞數均較模型組明顯減少，詳見圖1。

2.5 人參總皂苷對PC12衰老細胞凋亡率的影響

采用流式細胞術檢測。取對數生長期的PC12細胞按4×108個/L、2 mL/孔接種于6孔板中。按“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，加入胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，再用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）漂洗2次，再按照FITC-Annexin Ⅴ凋亡檢測細胞試劑盒說明書進行操作，使用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測細胞凋亡情況并計算凋亡率：凋亡率=早期細胞凋亡率+晚期細胞凋亡率。結果，正常對照組、模型組和人參總皂苷低、高濃度組細胞的凋亡率分別為（15.85±1.54）%、（21.33±1.06）%、（12.76±1.89）%、（11.15±2.48）%（n=3）。與正常對照組比較，模型組細胞的凋亡率顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組細胞凋亡率均顯著降低（P<0.01），詳見圖2（圖中，R2是正常細胞，R3是晚期凋亡細胞，R4是壞死細胞，R5是早期凋亡細胞）。

2.6 人參總皂苷對PC12衰老細胞周期的影響

采用流式細胞術檢測。按“2.5”項下方法分組、培養(yǎng)、處理至“PBS漂洗2次”，隨后加入4 ℃ 75%乙醇固定過夜，再用4 ℃PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，根據細胞周期試劑盒說明書方法配制碘化丙啶（PI）染色試劑，在37 ℃避光溫浴30 min后，用流式細胞儀分析細胞周期。試驗重復3次。結果，與正常對照組比較，模型組G1細胞比例顯著升高，S期細胞比例顯著降低（P<0.01），而G2期細胞比例組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組G1期細胞比例顯著降低（P<0.01），人參總皂苷高濃度組S期細胞比例顯著升高（P<0.05），詳見表3。

2.7 線粒體膜電位（MMP）檢測

采用流式細胞術檢測。按“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，細胞用胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用PBS輕輕洗滌2次，在避光條件下，每孔加入羅丹明123染色工作液500 μL，使其終濃度為1～2 μmol/L，輕輕混勻，于37 ℃孵育30 min，棄去上清液，用PBS輕輕洗滌2次，用流式細胞儀檢測細胞MMP，結果以各組與正常對照組的比值表示。試驗重復3次。結果，與正常對照組比較，模型組細胞MMP顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組細胞MMP均顯著升高（P<0.01），詳見圖3。

2.8 細胞內ATP含量檢測

按“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入RIPA裂解液200 μL，4 ℃下1 000 r/min離心5 min，取上清液用于后續(xù)的檢測。根據ATP檢測試劑盒說明書步驟進行操作，使用酶標儀檢測ATP含量，結果以各組與正常對照組的比值表示。結果，與正常對照組比較，模型組細胞內ATP含量顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，人參總皂苷高濃度組細胞內ATP含量顯著升高（P<0.01），詳見圖4。

2.9 細胞中ROS含量檢測

采用DCFH-DA熒光探針法檢測。按“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS漂洗2次，加入預先用PBS稀釋的DCFH-DA熒光探針溶液100 μL，在37 ℃避光條件下孵育30 min，期間每5 min混勻1次，使探針和細胞充分接觸;再以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細胞用PBS漂洗3次，以充分除去未進入細胞的DCFH-DA，免除干擾;最后用PBS 200 μL重懸細胞，使用流式細胞儀在488 nm波長下檢測細胞中ROS的含量，結果以各組與正常對照組的檢驗結果比值表示。試驗重復3次。結果，與正常對照組比較，模型組細胞中ROS含量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，人參總皂苷高濃度組細胞中ROS含量顯著降低（P<0.01），詳見圖5。

2.10 細胞凋亡相關蛋白表達檢測

采用Western blotting法檢測。按“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，在冰浴條件下，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。按線粒體細胞分離試劑盒操作說明書提取線粒體蛋白和胞漿蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，于沸水中加熱8 min變性。取適量變性蛋白進行SDS-PAGE，轉膜0.5 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，在4 ℃條件下加入Bcl-2、Bax、Cyt-C、Cox Ⅳ、GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用PBST溶液洗滌3次（每次5 min），再加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h，用PBST溶液洗滌3次（每次5 min）。加入特超敏ECL化學發(fā)光試劑顯色，于凝膠成像系統上成像，采用J 1.52a Image軟件分析，分別以Bcl-2、Bax與內參GAPDH的灰度值比值表示細胞內Bcl-2、Bax蛋白的表達水平，以Cyt-C與GAPDH的灰度值比值表示胞漿內Cyt-C蛋白的表達水平，以Cyt-C與Cox Ⅳ的灰度值比值表示線粒體內Cyt-C蛋白的表達水平。試驗重復3次。結果，與正常對照組比較，模型組細胞內Bcl-2和線粒體內Cyt-C蛋白的表達水平均顯著降低，細胞內Bax和胞漿內Cyt-C蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，人參總皂苷低、高濃度組細胞內Bcl-2和線粒體內Cyt-C蛋白的表達水平均顯著升高，細胞內Bax和胞漿內Cyt-C蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖6、表4。

2.11 細胞氧化損傷相關蛋白表達檢測

采用Western blotting法檢測。按“2.4”項下方法分組、培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，按“2.10”項下方法提取細胞總蛋白。采用細胞核蛋白抽提試劑盒按說明書提取核蛋白，檢測氧化損傷相關蛋白Nrf2、HO-1表達，一抗稀釋比例為1 ∶ 1 000，二抗稀釋比例為1 ∶ 10 000，另設陽性藥物組和陽性對照組進行比較。陽性藥物組細胞用含5 mmol/L NAC的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，陽性對照組細胞先用含5 mmol/L NAC的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，再用含20 mg/mL D-半乳糖的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。以Nrf2與Lamin B的灰度值比值表示細胞核內Nrf2蛋白的表達水平，以HO-1與GAPDH的灰度值比值表示細胞內HO-1蛋白的表達水平。試驗重復3次。結果，與正常對照組比較，模型組細胞核內Nrf2蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，陽性對照組和人參總皂苷低、高濃度組細胞核內Nrf2與細胞內HO-1蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且人參總皂苷低、高濃度組Nrf2蛋白的表達水平略高于陽性對照組（P>0.05），HO-1蛋白的表達水平顯著高于陽性對照組（P<0.01），推測人參總皂苷激活Nrf2信號通路可能是由ROS介導的，詳見圖7、表5。

3 討論

長期以來，線粒體與細胞衰老調控的關系都是學者研究的熱點之一，線粒體數量、結構及其功能的變化都能影響細胞衰老的過程與進程，已研究發(fā)現，可靶向作用于線粒體的天然產物活性分子或天然產物提取物在衰老調控及衰老相關疾病的預防和治療領域具有廣闊前景[13]。

D-半乳糖在正常情況下可經肝臟代謝成葡萄糖，但當其濃度較高時，D-半乳糖的積累不僅會導致細胞滲透壓變化、細胞腫脹、膜脂損傷、腦神經退化，還可觸發(fā)ROS的生成，ROS自由基再與氨基酸和蛋白質反應形成高級糖基化終產物，而這一產物在許多年齡相關的退行性疾病中很常見[14-16]。筆者采用D-半乳糖處理PC12細胞，證實了D-半乳糖確實可以促進ROS生成，加速衰老進程，主要表現在細胞存活率降低、衰老細胞數增加，并且將細胞阻滯在G1期。

本研究主要以人參總皂苷的抗氧化以及線粒體功能維系作用為基礎，探索其對抗D-半乳糖誘導的神經損傷的改善作用及機制。作為衰老的特征之一，線粒體功能障礙在當前研究中已被證實與衰老進程存在復雜關聯，如線粒體能量（MMP和ATP）供應不足可使機體代謝能力下降，進而發(fā)生一系列衰老變化，其中MMP的降低是誘導細胞凋亡的早期步驟[17-18]。本研究結果顯示，D-半乳糖處理可導致細胞MMP和ATP含量顯著降低;而人參總皂苷處理可阻止D-半乳糖導致的MMP降低，與此同時，人參總皂苷處理還可在一定程度上抑制D-半乳糖導致的細胞內ATP含量降低。此外，本研究還采用DCFH-DA熒光探針法檢測了D-半乳糖處理后細胞內ROS含量。結果顯示，D-半乳糖處理可顯著升高細胞內ROS含量，但人參總皂苷處理可顯著降低細胞內ROS含量。以上結果共同證明了人參總皂苷對D-半乳糖誘導PC12細胞線粒體功能紊亂具有改善作用。

細胞凋亡是由多種因子或蛋白參與的復雜的病理生理過程，其中抗凋亡蛋白（Bcl-2等）與促凋亡蛋白（如Bax、Cyt-C等）相互作用失衡尤為重要[19]。細胞凋亡的內部途徑是以線粒體為核心因子去激活細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，在線粒體介導的細胞凋亡途徑中，會伴隨著定位于線粒體外膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著下調、促凋亡蛋白Bax表達水平顯著上調，進而誘導Cyt-C從線粒體向胞漿的大量釋放，誘發(fā)細胞凋亡;然而，人參總皂苷可有效抑制這些蛋白的異常表達，從而降低細胞凋亡率。

Nrf2是細胞發(fā)生氧化應激反應的關鍵指標，也是氧化還原反應的敏感轉錄因子，更是抗氧化防御系統中的重要調節(jié)劑，其可調節(jié)下游抗氧化蛋白抗氧化酶HO-1、超氧化物歧化酶（SOD）、醌氧化還原酶1（NQO-1）和谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）的表達而發(fā)揮抗氧化作用[21]。ROS在體內動態(tài)平衡和細胞信號轉導中扮演著重要的角色，ROS的過量產生會導致線粒體功能和結構發(fā)生異常及線粒體呼吸鏈復合物活性降低，進而導致線粒體功能障礙，最終導致線粒體凋亡的發(fā)生[22-23]。Nrf2信號通路作為機體調節(jié)氧化應激反應的重要通路，主要通過調節(jié)抗氧化、抗炎及激活解毒蛋白的表達而發(fā)揮作用[24-25]。基于此，本文從Nrf2信號通路著手，擬通過上調機體抗氧化水平來對抗ROS損傷，從而保護神經系統。NAC是一種含巰基的抗氧化劑，具有基于巰基功能的抗氧化特性，能保護機體免受氧化應激損傷，亦可抑制神經細胞凋亡[26]。本研究結果顯示，人參總皂苷可通過促進Nrf2蛋白發(fā)生核轉移，提高其下游抗氧化蛋白HO-1的表達水平來抵抗氧化應激的發(fā)生;同時可通過調控細胞內Bcl-2和Bax表達水平抑制線粒體內Cyt-C向胞漿釋放，從而減緩細胞凋亡。

綜上所述，本研究初步驗證了人參總皂苷能夠通過激活Nrf2抗氧化信號途徑拮抗D-半乳糖誘導的氧化應激、緩解D-半乳糖誘導的細胞線粒體功能障礙，從而抑制線粒體介導的細胞凋亡途徑來發(fā)揮神經保護作用，提示人參總皂苷在神經退行性疾病的預防和治療中存在潛在的應用價值。本文不足之處：人參總皂苷給藥濃度選擇時，考慮到試驗周期長，藥物濃度會有浮動，所以設置了兩個接近的濃度，在后期研究中將予以完善。

參考文獻

[ 1 ] 馮巖，孫劍.靶向腦衰老膠質細胞的運動防治PD研究進展[J].生理科學進展，2020，51（4）：316-321.

[ 2 ] MILANOVIC M，FAN DNY，BELENKI D，et al. Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness[J]. Nature，2018. DOI：10.1038/nature25167.

[ 3 ] MANZELLA N，SANTIN Y，MAGGIORANI D，et al.Monoamine oxidase-A is a novel driver of stress-induced premature senescence through inhibition of parkin-mediated mitophagy[J]. Aging Cell，2018，17（5）：1-14.

[ 4 ] 羅麗，秦正紅.線粒體質量控制與神經元衰老及運動的干預作用[J].老年醫(yī)學與保健，2017，23（6）：451-454.

[ 5 ] 羅雅琪.姜黃素類化合物改善D-gal聯合三氯化鋁所致小鼠大腦β淀粉樣蛋白沉積的機理研究[D].瀘州：西南醫(yī)科大學，2018.

[ 6 ] 鄭敏，將裕蕓，周暢，等.人參皂苷對衰老大鼠學習記憶和腦單胺類神經遞質的影響[J].宜春學院學報，2013，35（6）：68-71.

[ 7 ] FAN YL，XIA JY，JIA DY，et al. Mechanism of ginsenoside Rg1 renal protection in a mouse model of D-galactose induced subacute damage[J]. Pharm Biol，2016，54（9）：1815-1821.

[ 8 ] 楊方園.人參二醇組皂苷對LPS導致的小鼠心肌損傷的保護作用[D].長春：吉林大學，2017.

[ 9 ] 吳普述.神農本草經[M].南寧：廣西科學技術出版社，2016：31.

[10] 沈亮，徐江，陳士林，等.人參栽培種植體系及研究策略[J].中國中藥雜志，2015，40（17）：3367-3373.

[11] 王瑞，董林林，徐江，等.農田栽參模式中人參根腐病原菌鑒定與防治[J].中國中藥雜志，2016，41（10）：1787-1791.

[12] 陳俞宇，隋華，張莉，等.服用人參導致“上火”的研究綜述[J].世界科學技術：中醫(yī)藥現代化，2018，20（4）：597- 602.

[13] 王維.益氣活血法在肺纖維化疾病中的應用及中藥實驗研究[D].濟南：山東中醫(yī)藥大學，2018.

[14] WU DM，LU J，ZHENG YL，et al. Purple sweet potato color repairs D-galactose-induced spatial learning and memory impairment by regulating the expression of synaptic proteins[J]. Neurobiol Learn Mem，2008，90（1）：19-27.

[15] LEI M，HUA XD，XIAO M，et al. Impairments of astrocytes are involved in the D-galactose-induced brain aging[J]. Biochem Biophs Res Commun，2008，369（4）：1082-1087.

[16] 周意，欒潔，蔣靜嫻，等.瑪咖多糖對D-半乳糖衰老模型小鼠免疫器官的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（19）：121-125.

[17] 王雪，修成奎，楊靜，等.人參-三七-川芎提取物對高糖高脂誘導血管內皮細胞衰老的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（1）：124-129.

[18] 王強，修成奎，雷燕，等.白藜蘆醇延緩心肌微血管內皮細胞衰老的作用機制[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（19）：145-152.

[19] 李攀登，王永紅，肖蕓，等.氫醌對人白血病細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表達的影響[J].現代預防醫(yī)學，2018，45（5）：878-882.

[20] 梁凱，曹秉振.線粒體調控的細胞凋亡研究進展[J].生物醫(yī)學工程與臨床，2014，18（5）：501-505.

[21] 湯井源，蔣旭平，秦志強，等.小鼠鄰苯二甲酸二丁酯染毒模型建立及萊菔硫烷保護作用的探索[J].南京醫(yī)科大學學報（自然科學版），2018，38（5）：595-599.

[22] 齊獻忠，邢英瀛，秦慧兵.過表達SHC3激活AKT/Nrf2/GSH 通路保護帕金森病氧化應激損傷[J].中國老年學雜志，2019，39（17）：4333-4337.

[23] 朱羽婷，朱向陽，周永，等.氧化應激與帕金森病[J].中國實用神經疾病雜志，2019，22（11）：1271-1276.

[24] 葉任之，張鈴，蔡巧燕，等.基于p38 MAPK/Nrf2/HO-1通路探討清達顆粒對脂多糖誘導活化的小膠質細胞抗氧化作用研究[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2020，18（11）：1700-1706.

[25] 曹玲娟，龔慧，顏苗，等. Nrf2-ARE信號通路參與肝臟疾病病理機制研究進展[J].中國藥理學通報，2015，31（8）：1057-1061.

[26] 蔡靚. 3，4-二羥基苯甲酸甲酯抗SH-SY5Y細胞氧化損傷作用作及機制[D].廣州：暨南大學，2015.

（收稿日期：2020-09-10 修回日期：2020-11-09）

（編輯：鄒麗娟）