GO抗菌復(fù)合材料的抗菌機(jī)制與生物安全性研究進(jìn)展

楊宇君，馬榕陽(yáng)，潘小曼，鄭宇杉，趙舒欣，陳靜曉，林于晴，邵龍泉，胡 琛

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515； 2. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510515)

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是一種由碳原子組成的具有單層結(jié)構(gòu)的納米材料，含有大量的氧鍵，包括碳原子六方網(wǎng)絡(luò)上的羥基、環(huán)氧官能團(tuán)，以及邊緣的羧基。作為一種石墨烯的衍生材料，GO不僅表現(xiàn)出與石墨烯材料類似的優(yōu)良理化、電學(xué)、光學(xué)、熱學(xué)及機(jī)械性能，還因具有較高的比表面積和豐富的表面官能團(tuán)而表現(xiàn)出較好的生物學(xué)性能。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，GO便成為生物醫(yī)學(xué)諸多領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，如抗菌材料、靶向治療、藥物傳送、定位示蹤等，但對(duì)GO自身抗菌性能的評(píng)價(jià)尚存在爭(zhēng)議。部分學(xué)者提出，GO自身即具備良好的抗菌性能，并指出其抗菌機(jī)制可能與物理?yè)p傷(如機(jī)械切割、靜電吸附作用)[1-2]或化學(xué)損傷(如氧化應(yīng)激、脂質(zhì)分解)[3-4]有關(guān)。而部分學(xué)者則對(duì)此持懷疑態(tài)度，認(rèn)為GO自身抗菌性能較弱，且抗菌性能的發(fā)揮極易受環(huán)境的影響，如蛋白質(zhì)環(huán)境會(huì)抑制其抗菌性[5]。

基于此，為進(jìn)一步優(yōu)化其抗菌性能，越來(lái)越多的學(xué)者嘗試采用金屬、金屬氧化物和聚合物等對(duì)GO進(jìn)行復(fù)合或改性，以獲得抗菌性能更為穩(wěn)定、優(yōu)異的GO復(fù)合材料。研究[1，6-7]發(fā)現(xiàn)，相比于GO單相材料，GO復(fù)合材料不僅表現(xiàn)出更為穩(wěn)定的抗菌性能，還可同時(shí)優(yōu)化諸多相關(guān)性能，如電化學(xué)、力學(xué)、磁吸附和生物安全性能等。

GO復(fù)合材料特性優(yōu)良，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的任何一種新型抗菌材料，良好的生物安全性能是保證其安全應(yīng)用的首要前提。因此，隨著對(duì)GO復(fù)合材料抗菌性能研究的逐步深入，學(xué)者們對(duì)其生物安全性的關(guān)注度也日益提升。如何在保留GO原有優(yōu)異理化性能的同時(shí)，獲得兼?zhèn)淞己每咕阅芗吧锇踩缘膹?fù)合材料，成為此領(lǐng)域現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。本文將從抗菌機(jī)制及生物安全性兩方面對(duì)GO抗菌復(fù)合材料的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為GO在抗菌領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 GO復(fù)合材料在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用

1.1 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 近年來(lái)，GO復(fù)合材料被廣泛用于骨組織工程材料、傷口敷料以及消毒滅菌劑等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力[8-11]。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，GO復(fù)合材料在具備抗菌性能的同時(shí)，還表現(xiàn)出優(yōu)良的機(jī)械、屏障性能，以及滲透性和生物降解性。

骨移植術(shù)后相關(guān)細(xì)菌感染是骨科較為嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥之一。為降低移植術(shù)后感染率，設(shè)計(jì)具有良好抗菌性能和成骨活性的骨移植材料對(duì)骨組織工程具有重要意義[11-12]。有學(xué)者[12]指出，仿生磷酸鈣礦化-GO/殼聚糖(OCP-GO/CS)支架有望成為骨組織工程的理想材料，該支架不僅可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)骨組織再生，還可有效抑制大腸埃希菌和表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)，且生物相容性良好。ZnO/GO-COOH復(fù)合材料也被證實(shí)對(duì)變形鏈球菌具有抗菌作用，具有顯著的成骨作用[13]。

某些GO復(fù)合材料如GO修飾電紡明膠納米纖維[14]，可在持續(xù)發(fā)揮抗菌作用的同時(shí)，促進(jìn)正常細(xì)胞(如L-929細(xì)胞)黏附生長(zhǎng)及傷口愈合。GO復(fù)合材料被應(yīng)用于傷口治療過(guò)程中，并被認(rèn)為是傷口敷料的理想材料之一[10]。GO的摻入可以明顯提高傳統(tǒng)敷料中纖維材料的抗菌性能和生物相容性[15]，且部分應(yīng)用于傷口敷料的GO復(fù)合材料力學(xué)性能也得到了提升[14-15]。

GO復(fù)合材料，因其具多機(jī)制協(xié)同長(zhǎng)效持續(xù)抗菌性能，也可作為醫(yī)療器械表面抗菌涂層材料。保持醫(yī)療器械的潔凈在醫(yī)療過(guò)程中具有重要意義[16]，使用GO/Ag/膠原涂層[17]可在一定程度上抑制醫(yī)院感染常見(jiàn)菌(如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌)的生長(zhǎng)繁殖和存活。此外，聚多巴胺/Ag3PO4/GO涂層也可被用于鈦基金屬移植材料的表面抑菌涂層，具有快速殺菌和持續(xù)抑菌的特點(diǎn)[6]。不同于一般抗菌劑，GO復(fù)合材料在控制耐藥菌感染方面亦具有一定的潛力。有學(xué)者[18]通過(guò)對(duì)GO/酞菁化合物復(fù)合材料進(jìn)行抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合材料對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌具有抑制作用，有望成為新型抗多重耐藥菌的制劑。

1.2 其他領(lǐng)域 除了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具抗菌性能的GO復(fù)合材料也可被用于食品包裝領(lǐng)域和水處理等工業(yè)領(lǐng)域。

在食品包裝領(lǐng)域，選擇具抗菌性能的材料具有重要意義。GO-TiO2-殼聚糖復(fù)合材料被用作食品包裝材料時(shí)，不僅能有效抑制黑曲霉和枯草芽孢桿菌，還表現(xiàn)出良好的生物安全性[19]。同時(shí)，作為一種極具潛力的食品包裝材料，具抗菌性能的GO復(fù)合材料還表現(xiàn)出良好的阻隔能力和力學(xué)性能[7, 20-21]。

在水凈化領(lǐng)域，在較低pH值條件下，GO-Ag復(fù)合材料在水溶液中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，且沒(méi)有毒副產(chǎn)物的生成[22]；部分GO復(fù)合材料還具有光催化性，可進(jìn)一步增強(qiáng)其水處理過(guò)程的殺菌效果[23]；GO復(fù)合材料還具耐腐蝕的性能，上述特點(diǎn)使GO復(fù)合材料具有應(yīng)用于海洋工業(yè)領(lǐng)域的潛能[24]。

綜上所述，GO自身是否具有穩(wěn)定的、持續(xù)的抗菌性能尚存在爭(zhēng)議，但GO復(fù)合材料的抗菌性能已被公認(rèn)，且具有較強(qiáng)的可設(shè)計(jì)性和優(yōu)良的復(fù)合性能，在諸多領(lǐng)域的應(yīng)用均具有較大潛能。

2 GO復(fù)合材料的抗菌機(jī)制

將GO與其他組分進(jìn)行復(fù)合，獲得的GO復(fù)合材料往往可以表現(xiàn)出比單純GO更為明顯且穩(wěn)定的抗菌性能[6]。目前，常用于GO復(fù)合改性的材料包括金屬[3]和聚合物[25-26]等。不同于單相材料，復(fù)合材料的抗菌機(jī)制往往更為復(fù)雜：既要考慮各組分材料的單一抗菌機(jī)制，也要兼顧不同材料之間的協(xié)同機(jī)制。不同類別的GO復(fù)合材料的具體抗菌機(jī)制如下。

2.1 GO-金屬或金屬氧化物復(fù)合材料 目前，大部分關(guān)于GO-金屬或GO-金屬氧化物復(fù)合材料的抗菌研究均是通過(guò)引入自身抗菌性能較好的金屬或金屬氧化物成分與GO進(jìn)行復(fù)合，協(xié)同增強(qiáng)復(fù)合材料的抗菌性能，其中以金屬銀與GO進(jìn)行的復(fù)合改性最為常見(jiàn)。對(duì)GO-納米銀(AgNPs)復(fù)合材料抗菌機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，GO可以克服AgNPs易團(tuán)聚的缺點(diǎn)，從而提高AgNPs的抗菌性能[3, 22]。上述復(fù)合材料中發(fā)揮主要抗菌作用的AgNPs成分，可通過(guò)以下多種機(jī)制[3, 11, 22, 27]引起細(xì)菌死亡：(1)釋放Ag+誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起細(xì)菌損傷；(2)AgNPs直接與蛋白質(zhì)、脂類、酶、DNA結(jié)合；(3)AgNPs中斷細(xì)菌呼吸功能。

在其他GO-金屬氧化物復(fù)合材料的研究中也發(fā)現(xiàn)與上述相似的抗菌機(jī)制。以GO-氧化鋅(ZnO)復(fù)合材料為例，一方面，復(fù)合材料中的GO可以防止ZnO團(tuán)聚，使ZnO均勻分散在表面，從而增加ZnO與細(xì)菌之間的接觸面積[6]；另一方面，復(fù)合材料中的Zn2+通過(guò)吸附于GO表面，可通過(guò)緩釋實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效抗菌[6, 28]。復(fù)合材料中的Zn2+主要通過(guò)與細(xì)胞表面含硫醇基(SH)的蛋白質(zhì)和酶結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂[29]。上述復(fù)合材料中GO對(duì)金屬組分抗菌性能的強(qiáng)化作用，主要體現(xiàn)在GO對(duì)金屬的穩(wěn)定作用和實(shí)現(xiàn)金屬離子的緩釋[30]。GO和金屬/金屬氧化物成分復(fù)合后，可進(jìn)一步誘導(dǎo)活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，氧化應(yīng)激作用明顯增強(qiáng)[31]。

2.2 GO-聚合物復(fù)合材料 與GO-金屬或GO-金屬氧化物復(fù)合材料的抗菌機(jī)制不同，GO-聚合物復(fù)合材料的抗菌機(jī)制主要可分為以下兩種情況：較為多見(jiàn)的一種是聚合物自身不具有抗菌性，而GO是發(fā)揮抗菌作用的主體成分，引入的聚合物可以增強(qiáng)或協(xié)助GO自身抗菌性能的發(fā)揮。部分帶正電荷的聚合物，如聚乙烯亞胺、聚六亞甲基鹽酸胍(PHGC)等與GO復(fù)合后[26，32]，可使GO復(fù)合材料表面攜帶陽(yáng)離子基團(tuán)，增強(qiáng)復(fù)合材料對(duì)細(xì)菌的靜電吸附作用。在殼聚糖(CS)、瓊脂等其他聚合物與GO復(fù)合的研究[32-33]中，發(fā)現(xiàn)上述聚合物的存在能有效避免復(fù)合材料中GO的收縮與團(tuán)聚，從而提高GO復(fù)合材料的抗菌性能。通過(guò)與GO成分復(fù)合，還可將部分聚合物在抗菌方面的劣勢(shì)轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢(shì)，兩者協(xié)同發(fā)揮抗菌作用。如聚醚(PLU)是一種增強(qiáng)碳納米材料生物相容性的表面活性劑，其單獨(dú)使用時(shí)，易包裹細(xì)菌膜形成高滲透壓，對(duì)外界水沖擊形成的低滲透壓作用具有一定的抵抗性。引入GO成分復(fù)合形成納米組裝體后，PLU具有的強(qiáng)包覆能力反而有助于GO更好地在細(xì)菌膜周圍定位，增強(qiáng)其抗菌作用[34]。另一種情況是將自身具有抗菌性能的聚合物(如季胺類聚合物)與GO復(fù)合，利用協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮更為優(yōu)良的抗菌性能，此種情況與GO-金屬或GO-金屬氧化物復(fù)合材料的抗菌機(jī)制類似。對(duì)于季胺類聚合物-GO復(fù)合材料，一方面，季胺類聚合物可以防止GO聚合；另一方面，GO的引入使季銨類聚合物與細(xì)菌接觸面積增大，有利于季銨類聚合物發(fā)揮更大的抗菌性，即改變細(xì)胞膜滲透性，導(dǎo)致細(xì)菌損傷；此外，季胺類聚合物-GO復(fù)合物還可通過(guò)產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[35- 36]。

3 具抗菌性能GO復(fù)合材料的生物安全性研究

學(xué)者們通過(guò)制備GO復(fù)合材料獲得抗菌性能的同時(shí)，也往往會(huì)對(duì)抗菌濃度下復(fù)合材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行同期評(píng)價(jià)。其結(jié)果主要分為以下幾種情況：(1)非GO組分自身生物安全性能良好，與GO復(fù)合后，復(fù)合材料的生物安全性進(jìn)一步提高。此類研究多見(jiàn)于組織工程領(lǐng)域，如將GO與磺化聚醚醚酮(SPEEK)復(fù)合成GO-SPEEK，該復(fù)合材料抗菌性及生物相容性均良好，不僅具有促進(jìn)MG-63細(xì)胞黏附和增殖的作用，還可刺激骨礦化。最重要的是，GO-SPEEK與SPEEK、GO對(duì)比，細(xì)胞毒性均明顯下降[37]。組織再生材料領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)，葡聚糖醛交聯(lián)GO-明膠(DA-GO-GEL)納米纖維墊對(duì)L-929成纖維細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性，而且GO的存在并不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生任何毒性反應(yīng)，反而有利于L-929細(xì)胞的黏附和增殖[14]。復(fù)合材料中的GO成分對(duì)細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用，可能是因?yàn)镚O的引入增加了復(fù)合材料中含氧基團(tuán)的數(shù)目，如醛基、羰基和羧基等[10, 38]。以復(fù)合物形式存在時(shí)，GO的毒性也會(huì)下降。在具抗菌性聚乙二醇官能化GO-富馬酸丙烯酸酯復(fù)合材料(PEG-GO-PPF)的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，在高濃度(50 mg/L)時(shí)，GO對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞(NHDF)有明顯的細(xì)胞毒性，而復(fù)合抗菌材料PEG-GO-PPF中GO含量達(dá)3.0%(wt)時(shí)，細(xì)胞活性仍保持在85%以上。此可能與GO分散性的改善及其表面上物理附著的生物聚合物的存在有關(guān)，如PEG可以改變GO的吸收機(jī)制，使其毒性更小。(2)非GO組分自身細(xì)胞毒性較強(qiáng)，與GO成分復(fù)合后，材料相比未復(fù)合前的單組份材料，細(xì)胞毒性明顯下降。此類研究較多集中于GO-金屬或GO-金屬氧化物復(fù)合材料，GO被廣泛應(yīng)用于控制釋放造成細(xì)胞破壞的金屬離子。如金屬銀的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，但其與GO復(fù)合后，細(xì)胞毒性得到有效抑制。Kulshrestha等[4]在成功制備具抗菌性能GO/銀納米復(fù)合材料(GO-Ag)的同時(shí)，采用MTT法測(cè)試其對(duì)Hek-293細(xì)胞株的影響，結(jié)果表明上述材料在抗菌濃度下對(duì)人類正常細(xì)胞系無(wú)毒。Shahmoradi等[15]采用WST試劑盒和L929成纖維細(xì)胞研究電紡聚己內(nèi)酯/GO/銀/精氨酸(PCL-GO-Ag-Arg)納米復(fù)合材料的毒性作用，結(jié)果顯示與PCL-Ag相比，不同濃度的PCL-GO-Ag-Arg均具有更好的生物相容性，且活/死染色試驗(yàn)結(jié)果與WST試驗(yàn)結(jié)果吻合。Wang等[39]研究發(fā)現(xiàn)GO-AgCl-Ag在高濃度下可殺滅金黃色葡萄球菌，進(jìn)一步采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3細(xì)胞)和CCK-8試劑盒對(duì)復(fù)合材料的生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)即使在高濃度下，細(xì)胞存活率仍保持在95%以上，可以安全應(yīng)用于生物領(lǐng)域。GO-Fe3O4-NPVP(N-烷基化聚)-Ag納米復(fù)合材料對(duì)NIH-3T3僅有輕微的細(xì)胞毒性作用，而其對(duì)照組(AgNPs組)的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重受損[1]。對(duì)具抗菌性能的聚多巴胺/Ag3PO4/GO涂層(PDA-Ag3PO4-GO-Ti)復(fù)合材料進(jìn)行的動(dòng)物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)安全性能良好[9]。除了金屬銀，GO與其他金屬如鋅、銅等復(fù)合后也有類似作用[6, 13，40]。

諸如上述有關(guān)GO-金屬或GO-金屬氧化物復(fù)合材料的研究顯示，GO是改良金屬或金屬氧化物類抗菌材料的理想選擇，GO可通過(guò)控制金屬離子的釋放，提高其生物安全性。

4 結(jié)論與展望

GO復(fù)合材料作為一種具抗菌性能的材料，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品包裝及水凈化等領(lǐng)域。通過(guò)合理的設(shè)計(jì)，大部分GO復(fù)合材料可在獲得穩(wěn)定抗菌性能的同時(shí)，亦表現(xiàn)出良好的生物安全性、力學(xué)性能。

盡管GO復(fù)合材料的抗菌性能已獲得認(rèn)可，但對(duì)于其抗菌性能的主要來(lái)源尚存在爭(zhēng)議，且對(duì)GO復(fù)合材料抗菌機(jī)制的現(xiàn)有研究大部分集中于細(xì)胞層面，而對(duì)分子層面的機(jī)制多停留于推測(cè)，尚有待進(jìn)一步深入研究。另外，雖有學(xué)者[4]指出，GO復(fù)合材料具有抗耐藥菌及抗生物膜作用，但相關(guān)研究仍不夠深入。

值得注意的是，雖然大部分研究指出，GO復(fù)合材料生物安全性較復(fù)合前的GO單相材料得到一定程度的改良[5, 34]，但亦有部分研究對(duì)其生物安全性持保留意見(jiàn)[41-42]。同時(shí)，現(xiàn)有對(duì)具抗菌性能GO復(fù)合材料的生物安全性研究多停留于體外試驗(yàn)階段，少數(shù)涉及體內(nèi)試驗(yàn)的文獻(xiàn)亦存在動(dòng)物模型單一，觀察內(nèi)容局限的問(wèn)題。評(píng)價(jià)GO復(fù)合材料生物安全性能的影響因素較復(fù)雜，如復(fù)合材料濃度比，細(xì)胞及動(dòng)物模型的選取[43-45]，給藥作用方式[9]和外界環(huán)境[46]等，研究者應(yīng)根據(jù)研究的具體目的，優(yōu)選最為合適的試驗(yàn)方法。

綜上所述，GO復(fù)合材料是一種極具潛力的新型抗菌材料，其開(kāi)發(fā)及廣泛應(yīng)用有待進(jìn)一步深入研究。