宏基因組學在特應(yīng)性皮炎研究中的應(yīng)用進展

何素玲 田歆 陳麗潔 李俊龍 王建琴 劉玉梅

廣州醫(yī)科大學皮膚病研究所廣州市皮膚病防治所皮膚科510095

通信作者：王建琴，Email：jianqinwang@foxmail.com；劉玉梅，Email：1109180611@qq.com

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是臨床上一種常見的慢性、反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚疾病，以瘙癢和反復(fù)濕疹樣病變?yōu)橹饕攸c。AD 的發(fā)病可能與皮膚微生物群落生態(tài)失衡、表皮屏障破壞、全身免疫反應(yīng)和炎癥等各種病理生理機制有關(guān)［1］。皮膚作為人體與環(huán)境接觸的界面，是一個多種微生物共存的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，而微生物群落與宿主之間的相互作用可以影響個體的健康狀況。近年來研究表明，皮膚微生物群生態(tài)失衡可加重皮膚屏障破壞進而激活皮膚免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致AD的發(fā)病風險顯著提高［2］。本文綜述宏基因組學在AD微生物研究及治療領(lǐng)域中的應(yīng)用進展。

一、宏基因組學

宏基因組學（metagenomic）又稱微生物環(huán)境基因組學（microbial environmental genomics），指直接從天然環(huán)境中提取全部微生物基因的遺傳組成和群落功能，對微生物群體進行系統(tǒng)分析，構(gòu)建宏基因組文庫。1998 年，Handelsman等［3］首次提出“宏基因組”的概念，其定義為環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和，包含了可培養(yǎng)的和尚不可培養(yǎng)的微生物的全部基因。2005 年，Chen 和Pachter［4］將宏基因組學定義為，用現(xiàn)代基因組學技術(shù)直接研究自然環(huán)境中微生物群落，而不需要對某一特定的菌株進行分離和實驗室培養(yǎng)。宏基因組學技術(shù)不依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)，它的出現(xiàn)為研究微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、功能活性及環(huán)境之間的相互協(xié)作關(guān)系等提供了新的方法，對微生物學的發(fā)展有重要的影響。

宏基因組學的發(fā)展與現(xiàn)代測序分析技術(shù)的進步息息相關(guān)。宏基因組學的研究步驟主要包括：盡可能地提取、純化某一特定環(huán)境中所有微生物樣品的基因組DNA；高通量測序分析；通過適宜的克隆載體和宿主構(gòu)建宏基因組文庫；篩選比對文庫，尋找新的生物功能基因及活性物質(zhì)。宏基因組測序技術(shù)的發(fā)展大致可分為3 個階段，第一代測序技術(shù)是Sanger 法，這種測序方法準確率較高，但測序通量較低，較多適用于原核生物的16S rRNA的數(shù)據(jù)分析［5］。第二代測序技術(shù)是高通量測序技術(shù)，是目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。高通量測序技術(shù)可以同時進行大量樣本的測序，一次性產(chǎn)出大規(guī)模測序數(shù)據(jù)，具有快速、高通量及成本低的特點，因此被廣泛應(yīng)用于全基因組測序、宏轉(zhuǎn)錄組分析和基因組結(jié)構(gòu)分析等工程。第三代測序技術(shù)為單分子測序技術(shù)，該技術(shù)通過單分子熒光測序及納米孔測序直接檢測DNA，不再需要經(jīng)過PCR 擴增，減少了DNA 擴增過程中產(chǎn)生的錯誤，提高了測序讀長，是未來測序方式前進的主要方向［6］。測序技術(shù)作為宏基因組學重要的研究手段，為宏基因組學的應(yīng)用及實踐提供了更多的機會。

二、宏基因組學在AD微生物研究中的應(yīng)用

1.人體微生物組計劃：宏基因組研究在人類醫(yī)療診斷、生物技術(shù)、生物能源、環(huán)境修復(fù)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境生態(tài)等各方面取得了豐碩的成果，對于微生物的物種和多樣性組成、生態(tài)功能、進化演替、相互作用等也有新的突破。為了探索微生物群落變化與人類疾病健康之間的關(guān)系，2007 年12 月，美國國立衛(wèi)生研究院正式啟動人體微生物組計劃，采集來自人體5 個不同部位（皮膚、口腔、鼻腔、胃腸道和女性生殖道）的微生物群落進行研究，計劃完成900個人體微生物基因組測序［7］。研究發(fā)現(xiàn)，人體微生物與人體健康息息相關(guān)，如腸道微生物對人體消化吸收、營養(yǎng)代謝、維持腸道功能和免疫系統(tǒng)的發(fā)展具有非常重要的作用［8］。在皮膚疾病方面，微生物失調(diào)可能引起皮膚慢性炎癥性疾病，如AD、銀屑病、酒渣鼻等［9］。

2. 皮膚屏障與AD：不同部位的皮膚表面具有不同的pH、溫度、水分、皮脂含量和局部解剖結(jié)構(gòu)特點，根據(jù)不同的生理特點，可將皮膚部位分為干性、油性和濕性部位。常見的干性部位有手掌、掌前臂和前臂等，油性部位有前額、外耳道和后背部等，濕性部位有鼻孔、腋窩、腘窩和腹股溝等。皮膚屏障在防止過敏原和微生物滲入人體中起著至關(guān)重要的作用［10］。AD 患者的病變和非病變部位皮膚都可觀察到一些表皮屏障的變化，如pH值升高、保濕功能降低、易致敏、對低分子量的物質(zhì)滲透性增加以及對感染的易感性增加［1］。皮膚屏障處于皮膚結(jié)構(gòu)的最外層，由終末分化的角質(zhì)形成細胞組成，其組成成分包括角蛋白、聚絲蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）以及含有脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白和絲氨酸蛋白酶的細胞外基質(zhì)。這些成分的功能失調(diào)會導(dǎo)致皮膚屏障缺陷，目前具有代表性的發(fā)現(xiàn)是，F(xiàn)LG 的丟失可以破壞表皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)，引起相關(guān)的蛋白組學變化，從而導(dǎo)致皮膚屏障和免疫功能障礙［11］。研究發(fā)現(xiàn)，伴有FLG基因突變的AD患者表皮金黃色葡萄球菌定植率增加［12］。皮膚屏障功能可受到微生物定植的調(diào)節(jié)，金黃色葡萄球菌可以激活人組織激肽釋放酶（kallikreins，KLKs），降解橋粒黏蛋白1（Dsg?1）和FLG 蛋白［13］，而皮膚屏障的功能缺陷又有利于金黃色葡萄球菌穿透表皮，進入真皮。細菌通過受損的屏障增加了變應(yīng)原與活化的抗原提呈細胞直接接觸的機會，可能導(dǎo)致固有免疫反應(yīng)增加，T 細胞分化為Th2 細胞以及炎癥細胞因子驅(qū)化，從而進一步破壞皮膚免疫平衡。在有利于Th2分化的免疫環(huán)境下，T細胞及B細胞可以相互作用產(chǎn)生過多的IgE，同時記憶性T 細胞再分配到血液循環(huán)中，通過免疫反應(yīng)不僅可導(dǎo)致AD加重，還可引起系統(tǒng)的過敏反應(yīng)，如食物過敏、哮喘和過敏性鼻炎等［14］。

3.皮膚微生物群與AD：皮膚表面的微生物群落由大量細菌、病毒和真菌組成，它們共同維系著皮膚表面菌群的多樣性。宏基因組學研究［15］發(fā)現(xiàn)，棲息在皮膚表面的細菌群大部分屬于放線菌門、厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，在這些門屬里包含成千上萬種不同的種屬。特異性的生理差異影響常駐菌群，類似的生理環(huán)境有相似的微生物群落分布，如大腸桿菌棲息在干性部位，放線菌門的丙酸桿菌支配著油性部位，而葡萄球菌和棒狀桿菌則控制著濕性區(qū)域。同時，微生物感應(yīng)和信號傳遞機制、代謝途徑及免疫原性特征等可能表現(xiàn)出與宿主維持相互作用的位點特異性［16］。與皮膚微生物在特定位點分布類似，相應(yīng)的皮膚疾病也通常出現(xiàn)在特定的部位，而細菌群落的分布特點又會受到宿主年齡、性別和人種等的影響，如嬰兒期AD 好發(fā)于面部和軀干部位，兒童期及青年期好發(fā)于四肢屈側(cè)，特別是肘窩及腘窩。

正常皮膚微生物的功能之一是抑制金黃色葡萄球菌的生長，表皮葡萄球菌、人鏈球菌通過直接產(chǎn)生或刺激宿主產(chǎn)生抗菌肽，這些抗菌肽可高效、選擇性地殺死金黃色葡萄球菌，保護宿主免受病原體感染［17］。微生物群落特別是金黃色葡萄球菌生態(tài)失衡，在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。金黃色葡萄球菌是一種含有廣泛毒力因子的病原體，包括中性粒細胞殺傷毒素、趨化抑制劑、抗吞噬和抗殺傷表面分子、超抗原和免疫逃逸蛋白等。所有金黃色葡萄球菌株均表達超抗原，超抗原與主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ（MHCⅡ）和T 細胞受體結(jié)合，使細胞不受控制的活化而導(dǎo)致炎癥；同時，δ 毒素、苯酚可溶性調(diào)控蛋白（phenol?soluble modulins，PSMs）可激活人角質(zhì)形成細胞促進炎癥細胞因子的表達；而α 毒素可能在破壞皮膚屏障方面發(fā)揮作用［18］。AD患者皮膚通常能檢測到金黃色葡萄球菌的定植，皮損區(qū)與非皮損區(qū)的感染率有差異［19］。Kong 等［20］采用DNA 測序技術(shù)同時檢測疾病穩(wěn)定期、爆發(fā)期和治療后的皮損區(qū)皮膚細菌群，爆發(fā)期的細菌多樣性低，鏈球菌屬、丙酸桿菌屬和棒狀桿菌屬均不同程度減少，而葡萄球菌屬的相對豐度上升，此外還檢測到低豐度菌屬如羅斯氏菌屬的豐度在3 種疾病狀態(tài)中均有升高。在AD 急性發(fā)作期金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌均明顯增加，提示二者也可能是互利共生的關(guān)系。皮膚菌群相對豐度因AD疾病狀態(tài)的不同而改變，提示了微生物群落與疾病發(fā)生之間復(fù)雜的相互關(guān)系。

4.腸道微生物群與AD：宏基因組研究［21］發(fā)現(xiàn)，AD與腸道和皮膚微生物群失調(diào)有關(guān)，腸道微生物群可能通過免疫、代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌途徑參與AD 的發(fā)展。早期腸道微生物的多樣性降低與過敏性疾病的風險增加有關(guān)［22］，可影響個體對AD發(fā)病的傾向，也可影響宿主的健康和后期的疾病狀態(tài)［23］。一項出生隊列研究［24］表明，攜帶某種超抗原和黏附素基因組合的金黃色葡萄球菌菌株的腸道定植與嬰兒期AD的后期進展呈負相關(guān)，說明該種菌株的腸道定植可能刺激嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)展，減輕AD后續(xù)的嚴重程度。而與健康人相比，AD 患者腸道微生物群中梭狀芽孢桿菌、難辨梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的比例增加，而雙歧桿菌、擬桿菌門和擬桿菌屬的比例降低［25］。這些研究提示，腸道微生物成分的變化可引起個體免疫系統(tǒng)改變，導(dǎo)致AD的發(fā)生與發(fā)展。

三、宏基因組學促進新一代的AD治療

AD 治療的目標是緩解癥狀、減輕瘙癢和改善生活質(zhì)量，通常需要采取多步驟的干預(yù)措施以避免相關(guān)的觸發(fā)因素進而改善皮膚屏障，使皮膚機能失調(diào)恢復(fù)正常及減輕炎癥。宏基因組學的出現(xiàn)推動了AD 的微生態(tài)治療新發(fā)展。目前針對AD微生物群的多種治療干預(yù)措施已經(jīng)出現(xiàn)［25］，包括潤膚劑、局部糖皮質(zhì)激素、漂白劑浴、抗生素、益生菌療法、局部臭氧油、臭氧水療法和UVB等。

測序分析研究［26］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)真皮中的微生物不存在于經(jīng)典的CD11c 吞噬免疫細胞中，金黃色葡萄球菌進入真皮不需要經(jīng)過抗原提呈細胞，提示微生物不是通過感染的途徑進入真皮。皮膚屏障的缺陷可以使微生物的穿透能力增強，雖然微生物不是通過感染的方式直接進入真皮，但是微生物的穿透可以影響細胞因子和抗菌肽（AMPs）的分泌，此炎癥觸發(fā)可能會進一步改變微生物群落，并通過增加皮膚屏障的破壞使疾病持續(xù)存在。值得注意的是，皮膚屏障修復(fù)可減少金黃色葡萄球菌對皮膚的滲透，并使金黃色葡萄球菌滲透引起的免疫異常恢復(fù)正常［27］。

目前，益生菌已被用于治療多種疾病，包括便秘、過敏反應(yīng)、嬰兒期感染、腸易激綜合征以及難辨梭狀芽孢桿菌感染引起的結(jié)腸炎等［28］。AD小鼠模型研究［29］證實，益生菌合劑可通過調(diào)節(jié)樹突細胞，激活Th1 和Treg 細胞反應(yīng)，調(diào)整T 細胞平衡及減輕AD 的癥狀。一些益生菌已在預(yù)防和治療AD方面發(fā)揮重要的作用，Huang等［30］的一項Meta分析顯示，乳酸桿菌、發(fā)酵乳桿菌和益生菌混合物可以降低1 ～18 歲亞洲AD 患兒的SCORAD 評分值，而鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌無此作用。用不同益生菌種類或含有乳酸桿菌的混合物治療AD 比單獨使用雙歧桿菌菌株顯示出更大的益處，然而，益生菌的有效性在1歲以內(nèi)的嬰幼兒中尚未得到證實［31］。也有研究認為，早期的益生菌補充物對AD的防治無明顯療效［32］。益生菌對AD 的作用至今尚沒有統(tǒng)一的結(jié)論，在不同的實驗結(jié)果中存在差異，可能取決于多種因素，如特定的益生菌菌株、給藥方法、起效時間、治療時間、劑量及個性化使用等［33］。在AD的治療中，使用抗生素抑制金黃色葡萄球菌可取得短期的癥狀改善，但可能會引起皮膚共生菌群失調(diào)和增加抗生素耐藥性風險。相對而言，共生微生物群有調(diào)控皮膚表皮分化和發(fā)育基因的作用［34］，且一般不會破壞正常菌群的穩(wěn)態(tài)。所以，AD的微生態(tài)治療顯示出很大的應(yīng)用前景，或許在不久的未來可以在皮膚健康和疾病恢復(fù)方面作出更多的貢獻。

四、小結(jié)

宏基因組測序技術(shù)揭示微生物群落對AD 的發(fā)生及發(fā)展具有重要的影響，可進行多領(lǐng)域分析。微生物之間動態(tài)平衡的改變和多樣性的減少使致病性微生物定植的概率增加，從而導(dǎo)致皮膚屏障受損及AD病情加重。提示能夠通過對局部和系統(tǒng)的微生物群落組成分析可初步診斷、鑒別和推測AD的預(yù)后發(fā)展。然而，AD是一種復(fù)雜的、受多種因素影響的、有明顯異質(zhì)性的疾病，目前尚未明確具體的病因。因此，未來的宏基因組學研究重點在于揭示AD 的發(fā)病機制、致病途徑以及微生物群落與疾病之間的相互關(guān)系，為AD的治療提供新的思路和策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突