外泌體在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中研究進(jìn)展☆

郝文文 侯嵐 何俊瑛 卜暉黃敏 任子英 陳鑫鑫

外泌體（extracellular vesicles，EVs）由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合形成，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑約為50～150 nm[1]。多項(xiàng)研究表明，EVs與腫瘤的轉(zhuǎn)移與發(fā)展密切相關(guān)[2-5]。乳腺癌是影響女性健康最常見(jiàn)的癌癥，死亡率位列世界女性惡性腫瘤死亡率第2位[6]。約有10%～15%乳腺癌患者出現(xiàn)腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移，其發(fā)生率僅次于肺癌[7-8]。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者預(yù)后差，生存期短，診斷腦轉(zhuǎn)移后中位生存期約1～3個(gè)月[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，EVs參與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的全過(guò)程，包括破壞血腦屏障和腦轉(zhuǎn)移微環(huán)境的建立[10]。本文從細(xì)胞和分子水平闡述EVs介導(dǎo)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制和對(duì)診斷、治療的作用。

1 破壞血腦屏障

血腦屏障(blood-brain-barrier,BBB)主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvessel endothelial cells,BMEC）、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成，其中，最重要的結(jié)構(gòu)是微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接[11]。BBB限制代謝產(chǎn)物和有害物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，BBB破壞是乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。研究證明，由轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞特征性表達(dá)和分泌的miR-105通過(guò)降低緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)，破壞內(nèi)皮細(xì)胞之間的連接完整性[12]。LU等[13]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）GS1-600G8.5在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞和EVs中高度表達(dá)。體外建立血腦屏障模型，lncRNA GS1-600G8.5通過(guò)破壞BMEC的緊密連接，增加BBB的通透性。此外，TOMINAGA等[14]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞分泌EVs中miR-181c抑制3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDPK1）的表達(dá)，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，BBB通透性增加，促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。

2 腫瘤微環(huán)境建立

在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移器官中，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移需要對(duì)轉(zhuǎn)移部位的微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)和改變[15]。腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與腫瘤微環(huán)境中非腫瘤細(xì)胞相關(guān)。腫瘤微環(huán)境包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrik,ECM）成分、蛋白酶和細(xì)胞因子等，這些在腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。

轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞突破BBB后，可能會(huì)死亡、進(jìn)入休眠或增殖狀態(tài)。休眠是癌細(xì)胞的一種保護(hù)機(jī)制，源自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的EVs中miR-23b表達(dá)增加，抑制靶基因MARCKS，誘導(dǎo)休眠表型，促進(jìn)轉(zhuǎn)移微環(huán)境中乳腺癌細(xì)胞的休眠[16]。當(dāng)出現(xiàn)適應(yīng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境時(shí)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可通過(guò)EVs將其線粒體DNA轉(zhuǎn)入到乳腺癌細(xì)胞中，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞從休眠中逃脫[17]。部分癌細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移過(guò)程中存活并不斷增殖，從而形成轉(zhuǎn)移灶。在此過(guò)程中，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞與腦實(shí)質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)相互作用，為腫瘤細(xì)胞提供存活和增殖信號(hào)，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境建立。

2.1 調(diào)控腦微環(huán)境中的細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤增殖 由于轉(zhuǎn)移部位的特殊性，因此腦微環(huán)境ECM與原發(fā)腫瘤部位微環(huán)境細(xì)胞不同。原發(fā)性腦腫瘤通常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，在腦轉(zhuǎn)移中，腫瘤細(xì)胞大多沿腦血管生長(zhǎng)，出現(xiàn) “血管共存 （vessel cooption）”現(xiàn)象，并不涉及實(shí)質(zhì)ECM；星形膠質(zhì)細(xì)胞屬于大腦特有細(xì)胞，參與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立[10]。

與原發(fā)腫瘤不同，腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞和ECM相互作用主要發(fā)生在纖維性血管周?chē)鶨CM中，包括纖維蛋白質(zhì)如膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白等[10,18]。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞的EVs含有膜聯(lián)蛋白 AII（Annexin AII），Annexin AII參與纖溶酶的激活，可降解多種ECM成分。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Annexin AII與EVs共培養(yǎng)處理小鼠也導(dǎo)致MMP-9表達(dá)增加，降解和破壞ECM，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[19]。

ZHANG等[20]發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌EVs中miR-19a介導(dǎo)PTEN（腫瘤抑制因子）下調(diào)，失去抑癌作用。進(jìn)一步研究表明，PTEN缺失導(dǎo)致趨化因子配體2（CCL2）的分泌增加，招募腦細(xì)胞來(lái)源的Iba1+髓樣細(xì)胞，增加轉(zhuǎn)移細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的建立。此外，乳腺癌細(xì)胞分泌的EVs也會(huì)影響腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞的代謝狀態(tài)[21]。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來(lái)源EVs將miR-122轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且減少星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)中的葡萄糖供應(yīng)，利于腫瘤細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)增殖[22]。

2.2 誘導(dǎo)血管生成 根據(jù)“種子和土壤”理論，只有能夠適應(yīng)遠(yuǎn)處器官新環(huán)境的細(xì)胞才能生存和繁衍[23]。最近研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)與腦內(nèi)皮細(xì)胞接觸誘導(dǎo)血管生成對(duì)于腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞的早期存活至關(guān)重要[24]。腫瘤來(lái)源的EVs對(duì)血管生成有促進(jìn)作用，利于腫瘤微環(huán)境的產(chǎn)生。JUNG等[25]研究表明，由缺氧腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的EVs中miR-210可通過(guò)下調(diào)血管重塑基因Ephrin-A3和PTP1B，被內(nèi)皮細(xì)胞攝取后，誘導(dǎo)新毛細(xì)血管的形成。最近研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌來(lái)源EVs中Annexin AII通過(guò)激活組織纖溶酶原激活物（t-PA）依賴性纖溶酶，增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的血管生成，有助于腫瘤的進(jìn)一步轉(zhuǎn)移[19]。

2.3 促進(jìn)炎癥、抑制免疫 腫瘤細(xì)胞分泌EVs整合素促進(jìn)腦實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移。乳腺癌細(xì)胞來(lái)源EVs中整合素3（ITGβ3）與CD31陽(yáng)性腦內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，激活Src磷酸化和促炎S100基因表達(dá)，觸發(fā)炎癥反應(yīng)[26]。在腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞也參與炎癥因子釋放。與免疫細(xì)胞分泌的EVs具有抗腫瘤作用相比，源自癌細(xì)胞EVs是最常見(jiàn)的誘導(dǎo)腫瘤前免疫調(diào)節(jié)[15]。在大腦微環(huán)境中，小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的免疫成分[16]。目前有研究證實(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向腫瘤部位募集發(fā)生在腦轉(zhuǎn)移的早期階段[27-28]。XING等[29]實(shí)驗(yàn)表明，在腦轉(zhuǎn)移中l(wèi)ncRNA X-染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（X-inactive-specific transcript,XIST）表達(dá)缺失引起乳腺癌細(xì)胞來(lái)源EVs中miRNA-503分泌增加，介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)化為M2型，增強(qiáng)PD-L1表達(dá)以抑制局部免疫，為癌細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。促炎性細(xì)胞因子釋放是反應(yīng)巨噬細(xì)胞功能的重要指標(biāo)之一[30]。研究表明乳腺癌腦轉(zhuǎn)移分泌的EVs可以通過(guò)Toll樣受體2(TLR2)受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞，驅(qū)動(dòng)免疫反應(yīng)并激活B細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子 (NF-κb)通路，增加促炎細(xì)胞因子白介素和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等釋放[31]。JAISWAL等[30]發(fā)現(xiàn)乳腺癌分泌的細(xì)胞外囊泡也誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子。

以上這些促炎狀態(tài)可能有助于對(duì)腫瘤部位發(fā)出二次免疫細(xì)胞募集的信號(hào)。當(dāng)無(wú)法維持免疫時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)募集先天免疫應(yīng)答的其他細(xì)胞。這些次級(jí)免疫細(xì)胞的聚集，促進(jìn)腫瘤灶在次級(jí)位點(diǎn)的建立[30]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤相關(guān)炎癥的主要參與者，誘導(dǎo)癌細(xì)胞外滲、建立和生長(zhǎng)[32]。此外，TAMs將含有miR-223的EVs運(yùn)送到乳腺癌細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲[31,33]。與此同時(shí)，乳腺癌細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)功能喪失、聚集和脫離等方式吞噬活化的巨噬細(xì)胞，有效逃避免疫監(jiān)測(cè)[30]。

綜上所述，乳腺癌細(xì)胞EVs分泌miRNA和lncRNA破壞BBB，進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)。在腫瘤微環(huán)境中，EVs主要通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成（包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）、血管通透性、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活來(lái)促進(jìn)炎癥和抑制免疫，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。

3 小結(jié)與展望

關(guān)于診斷和治療，EVs在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移方面的研究得到了關(guān)注。外泌體微小RNA(MicroRNA，miRNA)在體液中高度穩(wěn)定且易于檢測(cè)，因此，miRNA可能成為潛在的癌癥生物標(biāo)志物[4]。對(duì)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移外泌體miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移外泌體miR-210上調(diào)，miR-19a和miR-29c均顯著下調(diào)，表明這3種miRNA可能成為腫瘤的生物標(biāo)志物[34]。通過(guò)抑制EVs的釋放或吸收，來(lái)降低EVs的作用，進(jìn)而阻止腫瘤的進(jìn)展。研究表明敲除Rab27a或應(yīng)用GW4869（EVs阻斷劑）處理細(xì)胞，使含有 PD-L1的EVs分泌減少，影響乳腺癌的生長(zhǎng)[5,34]。

對(duì)EVs進(jìn)行適當(dāng)修飾，攜帶治療性RNA到特定受體細(xì)胞的治療方式具有發(fā)展?jié)摿?。LISMAN等[35]將EVs進(jìn)行修飾來(lái)傳遞反義寡核苷酸，作為RNA藥物，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。目前缺乏對(duì)腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞的相關(guān)研究，未來(lái)隨著對(duì)EVs介導(dǎo)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移研究的不斷深入，有望提供個(gè)性化的治療方式。

關(guān)于EVs在腦轉(zhuǎn)移中的相關(guān)研究有限，主要集中于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[15]。因此，需要建立其他實(shí)質(zhì)腫瘤腦轉(zhuǎn)移模型（如肺癌和黑素瘤等），進(jìn)一步研究EVs在轉(zhuǎn)移性腦腫瘤中的作用。盡管目前乳腺癌腦轉(zhuǎn)移診斷治療方面研究較少，但EVs在其他腫瘤診斷治療已顯示出較大的發(fā)展?jié)摿15]。需進(jìn)一步研究EVs介導(dǎo)乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移更精確的診斷和治療找到新方法。