肝癌免疫微環(huán)境與免疫治療：研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢

鄒添添，覃偉，朱迎，李天恩，欽倫秀，董瓊珠

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 普通外科，上海 200040；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032；3.復(fù)旦大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移研究所，上海 200040）

眾所周知，腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展所處的內(nèi)外環(huán)境，在腫瘤進(jìn)程、免疫逃逸和治療抵抗中發(fā)揮重要作用[1]。腫瘤微環(huán)境主要由腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞、髓系來源細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞組分，以及分泌的炎癥因子和趨化因子等非細(xì)胞成分組成[2]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是典型的炎性相關(guān)性惡性腫瘤，其微環(huán)境中包含大量的巨噬細(xì)胞及一系列固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，形成復(fù)雜的免疫耐受微環(huán)境[1,3]。免疫治療可通過增強機體免疫反應(yīng)，激發(fā)腫瘤特異性免疫，打破免疫耐受，重新激活免疫細(xì)胞等途徑使其識別并殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到延緩腫瘤進(jìn)展的目的。目前已有多種免疫療法應(yīng)用于晚期肝癌治療[4]。本文重點總結(jié)肝癌微環(huán)境的主要組分及其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用、以及相關(guān)免疫治療的最新進(jìn)展。

1 肝癌的微環(huán)境

肝臟具有一定的特殊性，由于其經(jīng)常暴露于腸源性抗原進(jìn)而形成了免疫耐受的微環(huán)境，故被稱為免疫特赦器官[5]。在我國，肝癌多發(fā)生在慢性乙型肝炎（以下簡稱“乙肝”）等基礎(chǔ)上，在患者數(shù)十年的肝炎病程中，各種炎性細(xì)胞相互作用，形成了更為復(fù)雜的微環(huán)境，導(dǎo)致肝癌微環(huán)境常伴隨慢性炎癥[6]。肝癌的微環(huán)境主要由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（tumor-associated neutrophils，TAN）、骨髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）等細(xì)胞組分，以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）、細(xì)胞因子等非細(xì)胞組分組成。與其他腫瘤相比，肝癌免疫微環(huán)境表現(xiàn)為更強的免疫抑制作用，幾乎所有細(xì)胞亞群和眾多調(diào)控機制都有助于肝癌的進(jìn)展。例如庫普夫細(xì)胞是肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞，其通過產(chǎn)生抗炎分子轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、IL-10和前列腺素E2（PGE2），在抑制性微環(huán)境的形成的過程中發(fā)揮重要作用[7]。在病毒性肝炎介導(dǎo)肝癌的發(fā)生過程中，病毒感染可以通過驅(qū)動肝臟慢性炎癥、分泌多種抑制性性因子促進(jìn)肝癌發(fā)展和免疫逃逸[8]。此外，乙肝患者肝內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的浸潤頻率與病毒載量相關(guān)，表明慢性病毒性肝炎感染肝臟中Treg的積累可能會阻止CD8+T細(xì)胞對病毒清除[9]。肝癌顯著的免疫抑制微環(huán)境對有效的肝癌免疫治療將是一個巨大的挑戰(zhàn)。

1.1 TAM

TAM是肝癌微環(huán)境的重要組成部分，根據(jù)其功能特點，可分為兩種類型：經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（classically activated macrophage，M1）和替代活化型巨噬細(xì)胞（alternatively activated macrophage，M2）[10]。既往認(rèn)為巨噬細(xì)胞可以直接殺傷腫瘤、或者遞呈抗原給T細(xì)胞，具有消滅腫瘤的能力，但越來越多的證據(jù)表明，TAM促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[11]。近期，研究者們通過單細(xì)胞測序技術(shù)揭示肝癌免疫微環(huán)境的動態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)肝癌腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)：TAM-like和MDSC-like狀態(tài)[12]。一般認(rèn)為，TAM來源于外周血單核細(xì)胞，可被腫瘤微環(huán)境分泌的細(xì)胞因子如CCL2、CSF1等招募至腫瘤周圍，腫瘤微環(huán)境將單核細(xì)胞“馴化”為M2型巨噬細(xì)胞，分泌抑炎性細(xì)胞因子如IL-8、IL-10、TGF-β等，促進(jìn)血管生成、抗炎及基質(zhì)重塑，誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡，抑制Th1型免疫反應(yīng)，重塑微環(huán)境，影響免疫穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[13-15]。目前，越來越多的研究[13,16-18]證實，TAM影響包括肝癌在內(nèi)多種腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后。我們課題組發(fā)現(xiàn)TAM與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控基因骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)密切相關(guān)，聯(lián)合OPN及TAM可以預(yù)測肝癌患者預(yù)后，即使在甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）陰性的肝癌患者中，兩者聯(lián)合也具有很好的預(yù)測效能[15]。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OPN可通過PI3K-Akt-p65通路刺激巨噬細(xì)胞分泌CSF1，激活CSF1/CSF1R通路，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，上調(diào)肝癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，營造抑制性免疫微環(huán)境并誘導(dǎo)肝癌的免疫逃逸[19]。因此，針對TAM設(shè)計抗腫瘤藥物已成為腫瘤治療的研究熱點[20-22]。

1.2 TAN

TAN作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤進(jìn)展與轉(zhuǎn)移中扮演著多重角色。早在2009年，F(xiàn)ridlender等[23]將TAN劃分為抑制腫瘤的N1和促腫瘤的N2亞型。N1表型具有細(xì)胞毒性和促炎活性，而N2表型具有較強的免疫抑制能力[24]。大量研究發(fā)現(xiàn)TAN能夠分泌細(xì)胞因子、基質(zhì)蛋白酶等促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；另一方面，中性粒細(xì)胞自身的細(xì)胞毒性對腫瘤也具有一定殺傷作用[25]。隨著研究的深入，TAN在塑造轉(zhuǎn)移前龕、捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTC）及免疫抑制方面的獨特作用越來越受到關(guān)注，其在肝癌的進(jìn)程中也發(fā)揮著重要作用。既往研究[26-27]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞-淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）可反映肝癌轉(zhuǎn)移等進(jìn)程。TAN通過招募TAM和Treg，促進(jìn)肝癌的生長和血管形成[28]。此外，TAN可通過激活miR-301b-3p/LSAMP/CYLD通路，增強肝癌細(xì)胞的“干性”；同時，這些干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞分泌趨化因子CXCL5，招募TAN瘤內(nèi)浸潤，從而構(gòu)成TAN-干細(xì)胞樣肝癌細(xì)胞環(huán)路，促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移[29]。近年研究[30-31]證實TAN通過向胞外釋放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)形成胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NET），通過炎癥與免疫調(diào)控影響腫瘤進(jìn)展。我們課題組發(fā)現(xiàn)肝癌患者中NET形成能力顯著增強，并與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NET通過捕獲CTC、并增加其遷移能力及血管新生最終促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[32]。

1.3 MDSC

MDSC是具有顯著異質(zhì)性的抑制性免疫細(xì)胞，分布于骨髓、脾臟、外周血和腫瘤組織中，可分為單核MDSC（M-MDSC）和粒細(xì)胞或多形核MDSC（PMN-MDSC）兩種類型[33]。近年來MDSC被認(rèn)為是免疫抑制細(xì)胞的核心，具有多種促腫瘤作用。其可通過血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)腫瘤血管生成，同時破壞先天性和獲得性抗腫瘤免疫[34]。另外，有大量文獻(xiàn)報道MDSC可通過誘導(dǎo)Treg分化增殖、抑制DC、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞極化狀態(tài)和巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等途徑發(fā)揮免疫抑制作用[35-37]。在肝癌中，已發(fā)現(xiàn)肝癌患者外周血MDSC可以預(yù)測患者預(yù)后。與肝炎或肝硬化患者及健康對照組相比，肝癌患者外周血MDSC的數(shù)量顯著增加，而且外周血高密度的MDSC與腫瘤轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)[38-40]。肝癌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如G-CSF、GM-CSF、VEGF、CCRK、IL-1β等可誘導(dǎo)MDSC浸潤，靶向MDSC能增強索拉非尼或免疫檢查點抑制劑的抗腫瘤作用[41-42]。

1.4 CAF

CAF是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，幾乎存在于所有實體瘤中。肝癌組織中CAF特定的分子標(biāo)志物如成纖維細(xì)胞激活蛋白（fibroblast activating protein，F(xiàn)AP）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等高表達(dá)的患者，往往預(yù)后較差，易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[43]。越來越多的研究[44-45]證實CAF可通過分泌多種生長因子和細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)，CAF通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞叉頭框蛋白Q1（FOXQ1）的表達(dá)并激活調(diào)節(jié)基因1（NDRG1）促進(jìn)肝癌干性特征。激活的肝癌細(xì)胞分泌C-C基趨化因子配體26（chemokine ligand 26，CCL26）從而招募更多的CAF促進(jìn)肝癌進(jìn)程[46]。在血管生成中，CAF通過CXCL12招募內(nèi)皮祖細(xì)胞，并通過產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶參與組織重塑，促進(jìn)血管形成。而且，CAF可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），增強其侵襲轉(zhuǎn)移的能力[47]。近年來發(fā)現(xiàn)，CAF可通過分泌趨化因子等調(diào)節(jié)周圍免疫細(xì)胞，在腫瘤免疫調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。CAF可誘導(dǎo)TAN等髓系來源的免疫抑制性細(xì)胞介導(dǎo)免疫抑制的發(fā)生，參與肝癌免疫逃逸[48-50]。因此，靶向CAF的特異性分子標(biāo)志物如FAP及靶向CAF特異基因抑制劑的治療方案可能會成為一種有效的肝癌輔助治療。

1.5 TIL

TIL是肝癌微環(huán)境的重要組成部分。早期臨床數(shù)據(jù)表明，肝癌術(shù)后高水平淋巴細(xì)胞浸潤，尤其是T細(xì)胞，可以減少復(fù)發(fā)，提高生存率[51]。TIL主要包括Treg、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和B 細(xì)胞等。Treg 是一種CD4+T 細(xì)胞的亞群，可通過多種方式抑制腫瘤免疫[52]。已發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Treg細(xì)胞大量增加，且與門靜脈癌栓形成、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)[53]。Treg-細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）比值（Treg/CTL）反應(yīng)肝癌局部免疫平衡狀態(tài)，當(dāng)CTL增多時，可以有效地對抗Treg對患者免疫系統(tǒng)的抑制作用，增強機體的免疫力，有利于殺傷腫瘤細(xì)胞[54]。研究[53]發(fā)現(xiàn)肝癌中高密度的腫瘤浸潤性CD4+CD25+Foxp3+Treg，預(yù)示不良預(yù)后。Lee 等[55]發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+Treg的增加與腫瘤大小相關(guān)，且這些CD4+CD25+Treg抑制肝癌中DC的免疫應(yīng)答。這些證據(jù)表明，抑制Treg可能是誘導(dǎo)肝癌免疫應(yīng)答的重要途徑。NK細(xì)胞和CTL是在腫瘤免疫監(jiān)視和腫瘤細(xì)胞根除中起著不可或缺的作用的抗腫瘤免疫細(xì)胞。NK細(xì)胞介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)且能在不需要在致敏的情況下直接介導(dǎo)細(xì)胞毒副作用[56]。但在腫瘤內(nèi)部NK細(xì)胞功能通常受到抑制。近期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌高表達(dá)的miR-561-5p直接靶向降低CX3CL1的表達(dá)，減少微環(huán)境中CX3CR1+NK細(xì)胞亞型的浸潤，促進(jìn)癌細(xì)胞的存活并促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移[57]。肝癌細(xì)胞外泌體來源的circUHRF可通過miR-449c-5p/TIM-3途徑抑制NK細(xì)胞功能、促進(jìn)肝癌的免疫逃逸和抗PD-1免疫療法的耐藥性[58]。CD8+T淋巴細(xì)胞是肝癌的主要CTL，研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞Fas/Fas L 的表達(dá)與肝癌抗腫瘤免疫呈正相關(guān)[59]。然而，CTL介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的有效性受到多種機制的限制，例如T細(xì)胞或肝癌細(xì)胞中大量免疫調(diào)節(jié)分子的高表達(dá)（如IL-10、Fas/FasL、CXCL17、VEGF、吲哚胺-2,3二氧合酶等），微環(huán)境改變（如乳酸過載、低p H、缺氧），與腫瘤細(xì)胞的“代謝競爭”以及缺乏CD4+T細(xì)胞的輔助等都可能是CTL功能受限的原因[59-61]。B細(xì)胞也是人體腫瘤組織中的一個重要免疫成分。目前，越來越多的證據(jù)表明B細(xì)胞浸潤與腫瘤預(yù)后和免疫治療療效密切相關(guān)[62-63]。在晚期肝癌組織中，PD-1高表達(dá)的B細(xì)胞浸潤水平與肝癌患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)呈顯著正相關(guān)，模式識別受體TLR4引起的Bcl-6上調(diào)是肝癌組織微環(huán)境引起PD-1高表達(dá)B細(xì)胞產(chǎn)生的重要機制且激活PD-1信號通路能夠刺激該群細(xì)胞分泌IL-10從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)肝癌生長[64]。此外，肝癌中B細(xì)胞的成熟及抗體分泌可顯著影響甚至逆轉(zhuǎn)表觀遺傳治療的療效，并提出基于體液免疫阻斷以及表觀遺傳治療的聯(lián)合治療方案為新型腫瘤免疫治療策略提供理論依據(jù)[65]。2017年研究人員首次在單細(xì)胞水平上對肝癌微環(huán)境中T細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)肝癌內(nèi)存在大量腫瘤組織特異的克隆增生的耗竭性T細(xì)胞，而且在耗竭性CD8+T細(xì)胞亞群中發(fā)現(xiàn)了一類FOXP3+抑制性T細(xì)胞的存在，揭示了肝癌中T細(xì)胞的亞群分類、發(fā)展軌跡和分布[66]。

1.6 DC

DC 是人體最重要的抗原呈遞細(xì)胞，通過向淋巴組織中沒有接觸過抗原的T細(xì)胞以抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）復(fù)合體的形式呈遞捕獲的抗原并激發(fā)免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)MHC Ⅱ和共刺激因子CD80/86的表達(dá)，遷移到區(qū)域淋巴結(jié)，并與T細(xì)胞相互作用并激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[67]。研究[68]發(fā)現(xiàn)肝癌組織內(nèi)漿細(xì)胞樣DC是原發(fā)性肝癌切除術(shù)后的不良預(yù)后因素，瘤內(nèi)浸潤的DC可能通過誘導(dǎo)由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-17產(chǎn)生免疫致炎性腫瘤微環(huán)境，與肝癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)在肝癌中富集cDC1、cDC2和LAMP3+DC 3個DC亞群，LAMP3+DC是從腫瘤遷移到淋巴結(jié)的更成熟的DC形式，可通過CCL19-CCR7、CCL22-CCR4和CD86-CD28等多條信號途徑發(fā)揮作用，提示LAMP3+DC與T細(xì)胞功能障礙有關(guān)[12]。此外，有研究[69]提示CD14+DC表達(dá)高水平的CTLA-4，并通過誘導(dǎo)IL-10和吲哚胺-2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）表達(dá)抑制T細(xì)胞效應(yīng)。當(dāng)前以DC 為基礎(chǔ)的免疫治療是腫瘤生物免疫治療中最有前景和最有價值的治療方法之一，因此，如何調(diào)控DC的免疫功能使其發(fā)揮抗腫瘤作用將是未來研究的方向。

1.7 肝癌微環(huán)境的非細(xì)胞組分

肝癌微環(huán)境中各種細(xì)胞分泌的炎性因子、趨化因子以及ECM等非細(xì)胞組分均參與肝癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等不同過程[70-71]。我們與美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）合作，通過分析伴有與不伴轉(zhuǎn)移肝癌的癌周肝組織基因表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)其中最重要的是細(xì)胞免疫、炎癥應(yīng)答相關(guān)基因，而且伴轉(zhuǎn)移的癌周肝組織存在明顯細(xì)胞因子應(yīng)答和炎癥反應(yīng)失衡（Th1/Th2 shift）。利用17個癌周肝組織炎癥免疫因子的轉(zhuǎn)移及免疫分子預(yù)測標(biāo)簽可以很好的預(yù)測肝癌患者的生存和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[72]。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步經(jīng)過臨床大樣本驗證，證實癌旁肝組織中IL-2和IL-15、M-CSF表達(dá)與肝癌進(jìn)展、復(fù)發(fā)相關(guān)，其表達(dá)水平可預(yù)測早期肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和生存[73-74]。此外發(fā)現(xiàn)，炎癥因子IL-6可通過OPN調(diào)控肝癌干性、促進(jìn)轉(zhuǎn)移[75]。近年來研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12及其受體CXCR7、CXCR4可促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與肝癌進(jìn)程、新生血管形成、EMT及不良預(yù)后等密切相關(guān)[76-77]，CCL2在肝癌患者中表達(dá)水平可作為肝癌患者預(yù)后預(yù)測因子[77]。而且趨化因子也可通過招募免疫細(xì)胞影響免疫應(yīng)答，如CCR4可招募中性粒細(xì)胞參與轉(zhuǎn)移前龕的形成、進(jìn)而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[78]；CCR6-CCL20可通過招募Treg促進(jìn)肝癌進(jìn)展和不良預(yù)后[79]。另外，ECM在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞表達(dá)多種ECM蛋白成分使得腫瘤組織結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)程[80]。利用瞬時彈性成像技術(shù)檢測肝組織硬度，發(fā)現(xiàn)肝癌患者中肝組織硬度明顯增加，而且肝組織硬度與肝癌進(jìn)展相關(guān)[81]。同時基質(zhì)支撐可為腫瘤起始細(xì)胞提供有利壁龕，促進(jìn)肝癌增殖、化療抗性和去分化[82]。而且在肝癌轉(zhuǎn)移前壁龕的形成過程中，ECM還可為免疫抑制細(xì)胞浸潤提供機械支撐[83]。因此阻斷肝癌細(xì)胞炎癥因子、趨化因子相關(guān)的信號通路，可有效抑制肝癌進(jìn)程。

2 肝癌免疫治療策略

近年，以免疫檢查點抑制劑為代表的腫瘤免疫治療取得突破性進(jìn)展[84]，為腫瘤的治療帶來了新的曙光。免疫療法的出現(xiàn)為肝癌治療提供了新的選擇，包括免疫檢查點抑制劑、過繼細(xì)胞療法（adoptive cell transfer，ACT）、腫瘤疫苗以及細(xì)胞因子治療等。

2.1 免疫檢查點抑制劑

免疫檢查點抑制劑通過逆轉(zhuǎn)T 細(xì)胞功能的耗竭，恢復(fù)免疫識別和免疫攻擊，從而增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。目前，免疫檢查點抑制劑靶點主要包括程序性細(xì)胞死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）及其受體PD-1（programmed cell death protein 1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）[85]。PD-1 是CD28 家族的一員，表達(dá)于大多免疫細(xì)胞表面，主要在CD8+T 細(xì)胞上表達(dá)。其可與配體PD-L1和PD-L2結(jié)合導(dǎo)致抑制性信號傳遞到T細(xì)胞并誘導(dǎo)耐受[86]。PD-L1在多種腫瘤包括肝癌中異常表達(dá)，腫瘤細(xì)胞可通過異常表達(dá)PD-L1或PD-L2獲得免疫逃逸[87]。2017年9月23日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了納武單抗（nivolumab，PD-1單抗）在晚期肝癌中的二線治療[88]。截止目前，免疫檢查點抑制劑已經(jīng)在肝癌領(lǐng)域進(jìn)行了多項探索性研究。隨著CheckMate 040、KEYNOTE-240、KEYNOTE-224和SHR-1210 等研究結(jié)果陸續(xù)發(fā)布，派姆單抗（pembrolizumab，PD-1單抗）、阿特利珠單抗（atezolizumab，PD-L1單抗）已相繼被國內(nèi)外多個指南納入并推薦作為肝癌的臨床治療選擇。作為我國自主研發(fā)的PD-1抑制劑——卡瑞利珠單抗（艾瑞卡?）是我國首個獲批肝癌適應(yīng)證的PD-1抑制劑。今年中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）指南的二線治療更是將nivolumab、pembrolizumab、卡瑞利珠單抗3 種PD-1抑制劑，共同提升到了 I級推薦（2A級證據(jù)）。CTLA-4是CD28家族的另一個成員，主要在活化的T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上表達(dá)，與B7分子結(jié)合后參與免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)[64]。伊匹單抗（ipilimumab）和替西木單抗（tremelimumab）均為CTLA-4抑制劑，其中ipilimumab是首個獲FDA批準(zhǔn)，最早應(yīng)用于臨床的免疫檢查點抑制劑。2013年臨床試驗表明tremelimumab可以有效發(fā)揮抗肝癌作用[89]。隨著對CTLA-4抗體藥物的作用機制的深入研究，有學(xué)者認(rèn)為CTLA-4抗體藥物的作用機理并不是免疫檢查點假說，而是通過靶向清除腫瘤內(nèi)Treg發(fā)揮治療效果[90-91]。目前臨床試驗結(jié)果顯示單用免疫檢查點抑制劑的患者應(yīng)答率較低，因此免疫檢查點抑制劑與其他治療方式的聯(lián)合應(yīng)用將是未來方向。

2.2 過繼細(xì)胞療法（ACT）

ACT是一種以利用腫瘤患者自身免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療。分離腫瘤患者體內(nèi)免疫活性細(xì)胞，通過細(xì)胞因子刺激、體外培養(yǎng)或腫瘤抗原負(fù)載，在體外進(jìn)行大量擴增和功能鑒定，再回輸至患者體內(nèi)，增強免疫功能，達(dá)到殺傷腫瘤的目的。與抗體或其他靶向藥物相比，ACT可以在體內(nèi)激活和增殖，具有持久抗腫瘤作用，因此ACT又被稱為是一種“活”的治療方法[92]。對于肝癌來說，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokines induced killer cells，CIKs）和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）是主要的治療策略。CIKs是人的外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在IL-2、IFN-γ和抗CD3單抗存在條件下體外擴增產(chǎn)生的異質(zhì)性免疫細(xì)胞群[93]，由自然殺傷T（natural killer T，NKT）細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL組成，對腫瘤細(xì)胞具有較強的細(xì)胞溶解活性，與MHC限制性無關(guān)。CIKs可清除殘余癌細(xì)胞，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，用于放化療無效的患者。肝癌的多項臨床試驗表明，CIKs治療可提高患者的總生存率（overall survival，OS）和無瘤生存率（disease free survival，DFS），具有相當(dāng)?shù)寞熜94-96]。但由于CIKs細(xì)胞因子相關(guān)的不良反應(yīng)以及存在免疫逃逸機制和缺乏特定腫瘤抗原，該療法仍未廣泛應(yīng)用于臨床[97]。CAR-T免疫療法是一種利用基因工程技術(shù)修飾患者T細(xì)胞使其能夠表達(dá)嵌合抗原受體CAR以特異性識別并殺死癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，是目前ACT治療的研究熱點。CAR-T細(xì)胞療法已在血液系統(tǒng)腫瘤中獲得成功，靶向CD19的CAR-T細(xì)胞已獲FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于急性B淋巴細(xì)胞白血病及某些B細(xì)胞淋巴瘤的治療[98]。但由于實體瘤缺乏特異性靶點且易受腫瘤微環(huán)境的影響，關(guān)于肝癌的CAR-T療法仍處于研究階段[99]。目前，主要以磷脂酰肌醇聚糖（glypican-3，GPC3）為靶點的CAR-T細(xì)胞已證實能清除GPC3高表達(dá)的肝癌[100]。近日，全球首個靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞治療晚期肝癌的I期臨床研究結(jié)果公布，治療的安全性和有效性均獲得了令人期待的結(jié)果。接受該治療后患者耐受性良好、安全基本可控，罕見嚴(yán)重毒副反應(yīng)，并初步顯示出較好的臨床獲益[101]。

2.3 治療性腫瘤疫苗

腫瘤疫苗是將腫瘤抗原以多種形式導(dǎo)入患者體內(nèi)，克服免疫抑制狀態(tài)，增強免疫原性，進(jìn)而激活患者自身免疫系統(tǒng)來治療腫瘤的免疫療法。2010年，provenge（普列威）成為首款被FDA批準(zhǔn)上市的前列腺癌抗腫瘤疫苗。目前，用于肝癌的腫瘤疫苗主要包括多肽疫苗、DC疫苗和溶瘤病毒疫苗。目前多肽疫苗報道較多的是AFP多肽疫苗和GPC3多肽疫苗。AFP是一種被廣泛用作肝癌患者的血清標(biāo)志物[102],因在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)使其成為基于疫苗治療的一個有前途的靶點[103]。早期用肝癌-AFP多肽疫苗進(jìn)行的臨床研究體現(xiàn)較好的抗腫瘤活性[103-105]。一項肝癌的I期臨床試驗發(fā)現(xiàn)GPC3肽疫苗具有良好的耐受性，可檢測到顯著的免疫應(yīng)答和抗腫瘤作用，并延長患者總體生存時間[106]。目前在肝癌中發(fā)現(xiàn)了大量的腫瘤抗原，但僅針對AFP、GPC-3和MRP3的疫苗表現(xiàn)出良好的耐受性和安全性，這些疫苗的特異性T細(xì)胞應(yīng)答率超過70%。相比之下，針對NY ESO-1、SSX-2、MAGE-A和TERT肽疫苗的T細(xì)胞應(yīng)答率低于40%[107]。在一些回顧性研究以及I、II期臨床研究中，DC疫苗被應(yīng)用于晚期肝癌患者并在部分患者中體現(xiàn)出對于腫瘤的免疫應(yīng)答[108-109]。JX-594是目前臨床試驗中與肝癌相關(guān)的主要溶瘤病毒，來源于痘苗病毒疫苗株，在癌細(xì)胞中優(yōu)先復(fù)制并裂解，臨床試驗結(jié)果顯示它是安全的[110]。目前，有兩項與JX-594相關(guān)的晚期肝癌的III期臨床實驗正在進(jìn)行中（NCT02562755，NCT03071094）。盡管肝癌治療性腫瘤疫苗顯示良好的臨床應(yīng)用前景，但其臨床應(yīng)用仍需更多的臨床實驗進(jìn)一步驗證其療效及安全性。

2.4 干擾素和其他細(xì)胞因子治療

目前，一些具有免疫細(xì)胞激活功能的細(xì)胞因子在腫瘤中被廣泛研究，以發(fā)展?jié)撛诘拿庖呒せ顒┖涂鼓[瘤藥物。干擾素α（IFN-α）是FDA批準(zhǔn)第一個應(yīng)用于腫瘤免疫治療的藥物[111]，能抑制病毒誘導(dǎo)的腫瘤生長，具有抗增殖、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的特性[112]。近年不少研究發(fā)現(xiàn)IFNs有預(yù)防病毒性肝炎相關(guān)肝癌發(fā)生及肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的作用。本課題組通過對照研究發(fā)現(xiàn)，根治性切除的肝癌患者術(shù)后長期使用長效干擾素能夠有效延長患者生存，推遲復(fù)發(fā)[113]。一項Meta分析顯示，干擾素輔助治療可提高肝癌患者治療性腫瘤疫苗術(shù)后總生存率，同時可降低部分治療患者術(shù)后復(fù)發(fā)率[114]。目前研究及報道較多的是干擾素聯(lián)合化療栓塞治療預(yù)防肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者術(shù)后給予干擾素聯(lián)合化療栓塞較單純化療栓塞組術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯降低。盡管干擾素作為抗腫瘤藥物的一線地位逐漸被取代，但在肝癌領(lǐng)域，IFN-α的新型制劑長效聚乙二醇化IFN-α（PEG-IFN-α）則繼續(xù)扮演著重要的輔助用藥角色。臨床前研究發(fā)現(xiàn)干擾素β（IFN-β）除了抗病毒作用外，也可通過JAK-STAT信號途徑和p53蛋白兩條途徑發(fā)揮抗腫瘤活性[115]。此外，IL-2對免疫系統(tǒng)也具有多效性作用，可以增強T細(xì)胞的增殖并激活其抗腫瘤作用。對于無法手術(shù)的肝癌患者，經(jīng)IL-2治療后，患者的生存率有所提高[116]。這些結(jié)果提示肝癌中干擾素和其他細(xì)胞因子治療具有良好的免疫治療應(yīng)用前景。

3 肝癌免疫治療面臨的挑戰(zhàn)與展望

近年來免疫治療在腫瘤治療領(lǐng)域取得重大突破，其在肝癌中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注，但目前仍面臨著療效不確定性、客觀緩解率低、不良反應(yīng)多、甚至患者獲益之后仍可出現(xiàn)耐藥抵抗等問題。因此，如何改善腫瘤免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，基于分子分型指導(dǎo)肝癌免疫治療方案的選擇及聯(lián)合治療等有效提高免疫治療療效，讓更多的肝癌患者從中獲益，是肝癌精準(zhǔn)治療亟待解決的問題和未來發(fā)展方向。

3.1 肝癌免疫治療面臨的挑戰(zhàn)

盡管免疫療法經(jīng)取得令人欣喜的成果且已批準(zhǔn)用于肝癌的治療選擇。然而，單用PD-1/PD-L1抗體的客觀反應(yīng)率很少超過40%，而且nivolumab與pembrolizumab在肝癌中的客觀反應(yīng)率也未超過20%[117]。目前認(rèn)為免疫治療客觀緩解率低的主要原因在于耐藥的產(chǎn)生[118]。免疫治療的耐藥是一個復(fù)雜、多機制相互依賴的動態(tài)過程，包括腫瘤內(nèi)免疫浸潤受損、T細(xì)胞耗竭、免疫抑制細(xì)胞（Treg、MDSC）募集、表觀遺傳改變等原因。此外，免疫相關(guān)不良反應(yīng)也是影響免疫治療廣泛應(yīng)用的重要原因[119]。如免疫檢查點抑制劑可引起炎癥性不良反應(yīng)，包括垂體炎、甲狀腺功能障礙和糖尿病。靶向CTLA4免疫治療的患者對垂體炎的易感性增加，而靶向PD1與原發(fā)性甲狀腺功能不全有關(guān)，少數(shù)病例表現(xiàn)為I型糖尿病[120]。而CAR-T治療的重大缺陷是副作用，如細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)毒性等，而且有7%～9%的患者由于CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)失敗而不能接受CAR-T治療。另外，免疫治療特異性靶點的選擇、如何保證ACT細(xì)胞更有效的到達(dá)腫瘤部位以及如何抵抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制等也是肝癌等實體瘤的免疫治療過程中面臨的挑戰(zhàn)[4]。因此，免疫治療的安全性、療效及選擇合適的靶抗原是肝癌免疫治療成功的關(guān)鍵，也是肝癌免疫治療應(yīng)用于臨床之前必須解決的問題。

3.2 以肝癌免疫治療為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療

肝癌處于復(fù)雜的免疫微環(huán)境中，目前單一免疫療法具有較低的緩解率和生存率，特別是Checkmate-459 III期臨床試驗結(jié)果表明nivolumb對不可切除肝癌的治療效果并未優(yōu)于索拉非尼，免疫治療沖擊肝癌一線治療藥物的首次嘗試宣告失敗（NCT02576509）[121]。因此，針對肝癌免疫治療研究的重點也逐漸轉(zhuǎn)向多靶點聯(lián)合治療。近期，臨床III期試驗IMbrave150相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明atezolizumab聯(lián)合抗血管生成藥貝伐珠單抗（bevacizumab）顯著降低晚期不可手術(shù)切除的肝癌患者的死亡風(fēng)險，且明顯改善患者生存質(zhì)量，成為首個不可切除的晚期肝癌的一線聯(lián)合治療方案[122]。該“T+A”免疫聯(lián)合療法是目前全球公認(rèn)的一線治療方案，也是CSCO 指南推薦的唯一一個一線首選（Ⅰ級專家推薦）免疫治療方案。另一項臨床試驗KEYNOTE-524旨在評價肝癌靶向治療一線藥物侖伐替尼（lenvatinib）聯(lián)合帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療不可切除的肝癌，今年ASCO最新數(shù)據(jù)顯示，該聯(lián)合方案對肝癌的客觀緩解率高達(dá)46%，但其臨床應(yīng)用還有待于III期臨床實驗數(shù)據(jù)的進(jìn)一步證實。此外，肝癌靶向治療藥物卡博替尼聯(lián)合Atezolizumab的COSMIC-312III期臨床研究也在進(jìn)行中。目前，雙腫瘤免疫療法相關(guān)的臨床研究也在不斷開展，Check Mate 040是評估nivolumab聯(lián)合ipilimumab的治療效果，提示針對不同靶點的免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合使用可能會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)（NCT01658878），目前該雙免疫療法已正式獲FDA批準(zhǔn)用于既往接受過索拉非尼治療的肝癌的患者。PD-L1單抗德瓦魯單抗（durvaluamb）聯(lián)合tremelimumab一線治療晚期肝癌的臨床研究也正在進(jìn)行中（NCT03298451）。同樣，免疫治療與局部治療如消融、放療、栓塞、化療栓塞或放射性栓塞的聯(lián)合應(yīng)用也可促進(jìn)抗腫瘤免疫治療療效。研究[123]發(fā)現(xiàn)，接受射頻消融治療的晚期肝癌患者使用tremelimumab治療后腫瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的積聚增加且中位生存期提高至13個月。射頻消融術(shù)聯(lián)合序貫細(xì)胞免疫治療可提高肝癌患者無進(jìn)展生存期[124]。另外，卡瑞利珠單抗聯(lián)合化療方案FOLFOX4的III期臨床試驗正在進(jìn)行中。目前，多項免疫治療與局部治療聯(lián)合的臨床實驗也已啟動以評估其安全性、耐受性和療效（NCT03143270、NCT02837029、NCT02821754、NCT01853618），有待進(jìn)一步研究結(jié)果。因此，針對免疫治療開展的聯(lián)合干預(yù)有助于探索新型的有效治療策略，給肝癌患者帶來更加持久的生存獲益，可能成為未來腫瘤治療的發(fā)展方向。

3.3 肝癌分子分型與免疫治療

異質(zhì)性是影響實體腫瘤療效的根本原因[125]，肝癌被認(rèn)為是異質(zhì)性最強的實體瘤之一[126]，因此，不同的肝癌人群對免疫治療療效存在顯著差異。大量研究[127-128]提示PD-L1表達(dá)水平、TIL豐度、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）等可以預(yù)測免疫檢查點抑制劑療效。另外，有研究[129]發(fā)現(xiàn)基于腫瘤中心和邊緣T細(xì)胞浸潤頻率和分布模式以及相關(guān)免疫基因的表達(dá)水平可建立肝癌微環(huán)境評分系統(tǒng)，對免疫治療具有一定的指導(dǎo)意義。例如基于腫瘤微環(huán)境評分可將肝癌分為免疫激活型、免疫耗竭型和免疫豁免型。對于免疫激活型，因腫瘤中心部位有一定量的特異性T細(xì)胞，利用免疫檢查點抑制劑可有效恢復(fù)T細(xì)胞的殺傷活性并取得顯著的抗腫瘤療效；免疫豁免型因缺乏特異性T細(xì)胞，需要通過放療、ACT、溶瘤病毒等方法促進(jìn)T細(xì)胞浸潤；免疫耗竭型則主要通過誘導(dǎo)T細(xì)胞歸巢、打破T細(xì)胞浸潤屏障的治療策略提升抗腫瘤免疫反應(yīng)[130]。近期基于中國人群中肝癌的蛋白組學(xué)的分析結(jié)果顯示，肝癌患者中常攜帶的馬兜鈴酸的突變“指紋”與TMB、腫瘤新抗原、微環(huán)境免疫耐受（如CD8+T細(xì)胞浸潤、PD-L1等免疫檢查點豐度）顯著相關(guān)，提示該類患者可能從免疫治療中獲益[131]。因此切實有效的肝癌分子分型是指導(dǎo)精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)。

3.4 肝癌“免疫正常化”療法

一直以來，癌癥免疫治療的基本策略是利用抗腫瘤免疫反應(yīng)，人們主要致力于激活和增強免疫反應(yīng)以消除腫瘤，包括癌癥疫苗、細(xì)胞因子、CAR-T等治療方法。但這種“免疫增強”的治療策略常常導(dǎo)致一系列副作用——免疫相關(guān)不良事件（immune-related adverse events，irAEs）。目前針對PD-1/PD-L1途徑的癌癥免疫療法取得了較高的客觀療效且irAEs較少見，這種方法基于免疫逃逸的機制，使得抗腫瘤免疫反應(yīng)失而復(fù)得，故稱之為“免疫正?；悲煼╗132]。該治療手段強調(diào)了在腫瘤進(jìn)展過程中識別免疫反應(yīng)的特定缺陷或功能障礙并據(jù)此糾正這些缺陷且恢復(fù)天然的抗腫瘤免疫能力的重要性。由于肝癌是高度免疫抑制性腫瘤，故“免疫正常化”療法在肝癌治療中前景廣闊。目前除靶向PD-1/PD-L1外，靶向微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞相關(guān)的通路或靶點如：CSF1/CSF1R、IDO、T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3 （T lymphocyte immunoglobulin mucin 3，TIM-3）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene 3，LAG-3）等途徑也可糾正肝癌誘導(dǎo)的免疫缺陷，促使免疫正?；痆19,133-134]。但目前上述相關(guān)靶點仍處于相應(yīng)的臨床前研究階段。

4 結(jié) 語

盡管目前針對肝癌的免疫治療已取得一定成果，但仍面臨著客觀緩解率低和治療不良反應(yīng)等挑戰(zhàn)。因此，從基因突變、基因表達(dá)、細(xì)胞因子/趨化因子和腫瘤浸潤細(xì)胞等方面進(jìn)行綜合分析，為肝癌患者制定個性化的精準(zhǔn)免疫治療方案，有效評估和預(yù)測免疫治療的療效及采取聯(lián)合治療策略等，是在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代背景下亟需回答的問題，也是肝癌免疫治療研究的未來趨勢。