循環(huán)腫瘤細胞的檢測及其在結(jié)直腸癌中的研究進展

申璐先，解廣東，榮寶海，王 猛，陳希琦，周永坤

統(tǒng)計研究顯示，2018年全球新發(fā)癌癥1810萬例，其中結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）180.1萬例，位于第3位，占所有腫瘤發(fā)病人數(shù)的10.2%[1]。結(jié)直腸癌是美國第三大常見癌癥，也是導致癌癥死亡的第二大原因[2]。近年來，我國CRC發(fā)病率逐年上升，2015年CRC的發(fā)病率和死亡率均位于所有惡性腫瘤的第5位[3]。目前，腸鏡檢查、癌胚抗原檢查、影像學檢查及組織病理學檢查的分期評估是制定治療方案的重要依據(jù)[4]。遠處器官轉(zhuǎn)移是影響CRC預后的獨立危險因素，也是患者死亡的主要原因，盡管進行了根治性手術(shù)和輔助治療，II～III期CRC患者仍約有25%～50%的復發(fā)率[5]。

因此，臨床上需要一個具有前瞻性的生物標志物，以便于更好地對CRC進行早期診斷，監(jiān)測復發(fā)轉(zhuǎn)移、評估治療效果、預測長期預后。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTCs）是目前廣泛研究的生物標志物。CTCs檢測被稱為“液體活檢”，與組織病理學檢查相比，液體活檢的侵入性更小，其基本檢測方法是在容易獲得的體液樣本中檢測特定的生物標志物[6]，外周血是最常見的樣本，而尿液、唾液、胸腔積液和腹水等也可用于檢測。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、取材方便、易于重復等優(yōu)點[7]。本文總結(jié)近年來CTCs的檢測技術(shù)，并探討其在CRC診治中的應(yīng)用價值。

1 CTCs概述

CTCs是在實體腫瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)的一種罕見細胞亞群，它們穿過血管壁后進入血液，腫瘤細胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶，形成遠處器官的繼發(fā)性腫瘤，這個假說是由澳大利亞學者Ashwonh在1869年首次提出來[8]。CTCs僅存在于腫瘤患者體內(nèi)，其逃逸機制可能是通過上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機制逃避免疫系統(tǒng)，在外周循環(huán)系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)的幫助下進入血管中[9]。CTCs在腫瘤特異性抗原和基因?qū)W特征方面與原發(fā)腫瘤病灶高度相同，都具有極高的腫瘤特異性，可用于惡性腫瘤的體外“液體活檢”[10]。相對于傳統(tǒng)的影像學和腫瘤標志物的檢查，檢測外周血中的CTCs具有靈活、快捷、無創(chuàng)等特點，對于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、動態(tài)監(jiān)測療效和評估預后等都具有極高的臨床應(yīng)用價值。CTCs被美國FDA認定為癌癥發(fā)展和監(jiān)測的新的生物標志物[11]。

2 CTCs檢測

在過去幾十年中，研究人員致力于CTCs分析，CTCs的高敏感性和特異性的分離和表征在技術(shù)上已有明顯的突破[12]。但是對于如何定義CTCs所需的和充分的最低標準沒有共識；研究者們也不經(jīng)常把兩項研究的數(shù)據(jù)進行比較[13]。CTCs的生物和物理特性已被國際公認明顯不同于血液中的其他細胞[14]，這些細胞在血流中表現(xiàn)出極端的表型異質(zhì)性和罕見性。如CTCs在外周血的濃度極低，僅為幾百萬分之一[15]，CTCs在血液中半衰期約為1～2.4 h[16]，在循環(huán)系統(tǒng)中只有極少數(shù)高活性、高轉(zhuǎn)移性的單個獨立存在腫瘤細胞才能存活下來[17]。CTCs的鑒定仍具有極高技術(shù)挑戰(zhàn)性。迄今為止，CTCs分離富集技術(shù)大致分為兩類，一是利用CTCs的物理特性；二是利用CTCs表面標記的免疫分選方法。

2.1 CellSearch系統(tǒng) CellSearch系統(tǒng)已被美國食品和藥物管理局(FDA)批準用于監(jiān)測乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌治療的反應(yīng)[18]。該系統(tǒng)是將磁性細胞分選技術(shù)、熒光抗體染色和半自動熒光顯微鏡分析技術(shù)相結(jié)合，具有敏感度高、結(jié)果穩(wěn)定、檢測過程統(tǒng)一等特點。Cohen等[19]利用該系統(tǒng)檢測430例轉(zhuǎn)移性CRC患者外周血中CTCs數(shù)量，得出CTCs的數(shù)量是影響轉(zhuǎn)移性CRC患者無進展生存期和總生存期的獨立因素。

2.2 微流控設(shè)備檢測 微流控設(shè)備檢測是一種基于微流體收縮和電流傳感系統(tǒng)的機械低通濾波技術(shù)，其利用CTCs和血細胞的最佳收縮寬度不同，通過調(diào)整收縮寬度、信號強度和停留時間，從而切斷血液細胞的信號，增強CTCs收縮通道。該設(shè)備相對于傳統(tǒng)的抗體檢測可避免存在假陰性，在細胞不經(jīng)任何表面的生化修飾的情況下從全血中直接檢測CTCs。Suzuki等[20]證實在沒有預處理或稀釋的全血中，設(shè)定6 μm寬收縮通道檢測CTCs，其在幾十毫秒的精度大于95%。

2.3 納米結(jié)構(gòu)界面 近年來隨著納米科技的進步，在眾多CTCs檢測策略中，納米結(jié)構(gòu)界面已被廣泛應(yīng)用。納米粒子具有體積小、易與不同配體修飾、表面體積比高等優(yōu)點，同時核酸適配體具有親和性好、成本低、易修飾、穩(wěn)定性好、免疫原性低等優(yōu)點，這二者都促進了納米結(jié)構(gòu)界面在檢測CTCs中的應(yīng)用[21]。Wang等[22]利用滾環(huán)擴增產(chǎn)生的具有章魚臂形態(tài)的磁性DNA納米爪來捕獲癌細胞，因該爪結(jié)構(gòu)具有較好的剛性和柔韌性，且可攜帶多種抗體，故捕獲率高達95%，純度約達85%。

2.4 微流控芯片 微流控芯片技術(shù)成本低、通量高、樣品需求量小，可達到特異、靈敏、高捕獲率的效果，該技術(shù)是基于CTCs的生物學性質(zhì)差異和物理性質(zhì)差異來進行腫瘤細胞的分選富集[23]。Toner實驗室設(shè)計了“CTCs-iChip”芯片，該芯片可依賴或不依賴腫瘤表面特異性表達在全血中快速的篩選CTCs，因而適用于所有癌癥[24]。Yang等[25]設(shè)計的“CTCs-△Chip”楔形芯片實現(xiàn)腫瘤細胞與常規(guī)血細胞大小差異及三色免疫細胞化學方法(CK+/CD45-/Nucleus+)鑒定標記CTCs，并證實該系統(tǒng)在不同類型的固體腫瘤2 ml外周血中，可檢測出2～15個CTCs，檢測靈敏度高，檢出率為75%。

3 CTCs在CRC的臨床價值

傳統(tǒng)上，需要通過組織活檢來確定腫瘤的組織學性質(zhì)及其遺傳概況，但因腫瘤的異質(zhì)性，組織活檢常常存在假陰性、創(chuàng)傷大、成本高等缺點[26]。相對于傳統(tǒng)的檢測方式，CTCs易于從外周血中獲得，可在沒有入侵的情況下對腫瘤進行生物學監(jiān)測，也可對腫瘤的進展進行重復評估。研究表明，CTCs在評估非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性CRC的預后方面具有很高價值[27]。

3.1 CTCs對于早期CRC的診斷價值 在臨床中，結(jié)直腸早期癥狀是隱匿的，無明顯特異性。因此，大多數(shù)CRC發(fā)現(xiàn)時已為中晚期，其治療效果及預后較差，故為了提高CRC患者5年生存率，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要。曹霞等[28]通過富集-免疫熒光原位雜交（SE-iFISH）技術(shù)檢測67例早中期CRC患者及同期20例健康志愿者外周血中CTCs，得出早中期CRC患者CTCs陽性率為91.0%，明顯高于健康人的5.0%。郭華等[29]應(yīng)用CyttelTM-CTCs平臺檢測57例CRC患者及29例良性病變和健康受試者外周血標本，結(jié)果顯示57例CRC患者中CTCs陽性45例，而良性病變和健康受試者僅2例，前者比后者檢出率高(78.9% vs 6.9%)。Wen-Sy等[30]通過腸鏡檢查從620例CRC患者中篩選出438例診斷為腺瘤性息肉或早期至晚期CRC患者，然后進一步進行CTCs檢測，發(fā)現(xiàn)其中111例(25%）為癌前病變，327例（75%）為CRC，CTCs檢出癌前病變的靈敏度為76.6%，特異度為97.3%；檢出CRC的靈敏度為86.9%，特異度為97.3%。CTCs檢出癌前病變和CRC的準確率達到88.0%。因此，檢測CTCs有利于CRC的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

3.2 CTCs與CRC分期 晏玉武等[31]通過檢測71“例”結(jié)直腸患者的CTCs發(fā)現(xiàn)，根據(jù)臨床TNM分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況（N1、N2、N3）、腫瘤浸潤深度（T1、T2、T3、T4)和腫瘤分化程度（高分化、中分化、低分化），CTCs陽性率跟以上幾項均呈正相關(guān)。Tsai等[32]研究指出早期CRC患者腫瘤大小、位置、分化程度、轉(zhuǎn)移程度等方面均影響著CTCs的水平，且CTCs數(shù)量隨T分期增加而增加。還有研究發(fā)現(xiàn)CTCs陽性與TNM分期有關(guān)，術(shù)后CTCs的數(shù)值與侵襲深度及腫瘤部位顯著相關(guān)，術(shù)前及術(shù)后CTCs水平與年齡、性別、腫瘤病灶的分化程度無關(guān)[28，33]。因此CTCs可作為CRC腫瘤分期的依據(jù)，可與組織活檢相結(jié)合，為CRC患者提供進一步治療指導。

3.3 監(jiān)測CRC術(shù)前和術(shù)后CTCs的變化評估預后 在眾多影響外周血中CTCs數(shù)量的原因中，手術(shù)操作是一個極為重要的因素，術(shù)中腫瘤組織受到擠壓、牽拉等機械損傷，易導致腫瘤細胞脫落入血，影響CTCs水平，增加腫瘤轉(zhuǎn)移風險。Wang等[34]研究130例Ⅱ～Ⅲ期CRC手術(shù)患者發(fā)現(xiàn)，術(shù)前CTCs計數(shù)明顯低于術(shù)后3 d的CTCs計數(shù)，且在評估非轉(zhuǎn)移性CRC手術(shù)患者的腫瘤復發(fā)存活率方面，術(shù)后CTCs優(yōu)于術(shù)前CTCs。Yang等[35]研究138例行根治術(shù)CRC患者的無復發(fā)生存率，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTCs陽性是預后不良的獨立指標，與術(shù)前CTCs陽性無關(guān)。另一研究表明，早中期CRC術(shù)后分良好預后組(術(shù)后CTCs＜3或術(shù)后CTCs數(shù)目比術(shù)前CTCs數(shù)目減少或持平)，反之則為不良預后組[28]。

3.4 CTCs用于指導治療 CRC患者化療的目的是清除殘留在循環(huán)中的游離腫瘤細胞及微轉(zhuǎn)移灶，傳統(tǒng)的生物學監(jiān)測與CTCs相結(jié)合將更有利于癌癥的精確治療，如用藥的安全性、療效、監(jiān)測復發(fā)轉(zhuǎn)移等方面。王麗麗等[36]將121例晚期CRC患者化療后分為2組，腫瘤進展組81例與腫瘤控制組40例，腫瘤進展組CTCs陽性率比控制組高（87.5%vs 58.0%，P=0.001），證明CTCs計數(shù)與晚期CRC的化療療效相關(guān)，動態(tài)監(jiān)測CTCs或可作為化療效果早期評估的輔助性指標。另一試驗也證明了化療后CTCs陽性率與療效呈負相關(guān)[33]。Sastre等[37]通過檢測CTCs計數(shù)及KRAS來評估轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者接受貝伐珠單抗化療后的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當CTCs＜3/7.5 mL時，KRAS野生型腫瘤的無進展生存期和總生存期均高于CTCs＞3/7.5 mL時，CTCs計數(shù)及KRAS是評估化療效果的獨立因素。Krebs等[38]研究得出CTCs分層計數(shù)可識別不同化療方案中獲益較多的患者，從而避免高毒性藥物在低CTCs組中使用。Font-Clos等[39]通過建立類人型全身血液循環(huán)模型來模擬CTCs軌跡，該CTCs動力模型可模擬腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移擴散及黏附機制，同時結(jié)合影像學檢查甚至可能確定腫瘤未來的轉(zhuǎn)移部位，從而為腫瘤的轉(zhuǎn)移治療提供精確的指導。龐明輝等[40]檢測88例結(jié)腸癌患者術(shù)前1 d及術(shù)后1、6、12月末外周血中的CTCs數(shù)量，發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度低、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者外周血中CTCs水平較高，術(shù)后12月末較1月末CTCs值升高的患者生存時間更短，腫瘤復發(fā)概率更高，因此動態(tài)監(jiān)測CTCs水平的變化有利于腫瘤復發(fā)的早期判斷、評估化療效果，對術(shù)后短期內(nèi)復發(fā)的Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期患者的治療方案的選擇有指導意義。

3.5 CTCs評估CRC患者長期預后 外周血中CTCs的存在是大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因[41]。CTCs可以預測非轉(zhuǎn)移性CRC的未來轉(zhuǎn)移和不良的疾病結(jié)局，在轉(zhuǎn)移性CRC中則可以預示著轉(zhuǎn)移灶的重新播散[27]。曹霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)可依賴術(shù)后CTCs數(shù)值或動態(tài)檢測手術(shù)前后CTCs的變化預測早中期CRC的預后。任鐵軍等[42]使用CellSearch系統(tǒng)檢測CRC晚期患者外周血7.5 mL，基線CTCs＜3的人群中位無進展生存期及總生存期均高于CTCs≥3的人群(P＜0.05)，其認為晚期CRC患者治療前檢測CTCs有一定的臨床價值。Tsai等[32]利用微流控裝置收集行CRC根治性手術(shù)患者的外周血7.5 mL，發(fā)現(xiàn)CTCs≥5個的患者一年內(nèi)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的概率是CTCs＜5個患者的8倍。另一項使用CellSearch系統(tǒng)的前瞻性研究也證明了每7.5 mL血液中CTCs＞1個的CRC患者預后較差[43]。汪棟等[44]應(yīng)用密度梯度離心法和免疫熒光法檢測69例Ⅱ～Ⅲ期CRC患者術(shù)前、術(shù)后3 d及術(shù)后14 d外周血中的CTCs，發(fā)現(xiàn)CRC患者術(shù)后3 d和術(shù)后14 d的CTCs陽性率與術(shù)后腫瘤復發(fā)相關(guān)，因此檢測CRC患者圍手術(shù)期外周血中CTCs數(shù)目有助于預后判斷及腫瘤復發(fā)并提早干預。

綜上所述，CTCs與癌細胞在基因表達方面具有高度的相似性，可以從不同方面反映腫瘤細胞的生物學特性，如腫瘤細胞的異質(zhì)性、進化及突變等，對癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、診斷、鑒別具有重要意義。近年來，CTCs的檢測技術(shù)被應(yīng)用到胃腸道腫瘤的多個方面，評估預后、監(jiān)控微小病灶及腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移、監(jiān)測反應(yīng)/耐藥、輔助確定精準治療方案等。CTCs與傳統(tǒng)的腫瘤活檢有很好的一致性，檢測外周血中CTCs使獲取腫瘤標本更容易，并能對患者進行長期監(jiān)測以跟蹤病情[45]。但是現(xiàn)實中CTCs的檢測還存在著諸多不足，尚無如何定義CTCs最低標準的共識，檢測程序標準不統(tǒng)一，檢驗結(jié)果存在假陰性和假陽性，缺乏普遍化、靈活快捷、低成本的檢驗裝置等。盡管如此，隨著CTCs富集分析技術(shù)的進步，CTCs的重要性在胃腸癌患者的治療和診斷中將會進一步得以體現(xiàn)。