靈芝孢子粉中三萜類化合物的研究進(jìn)展

夏亞飛，閻 姝

靈芝（ganodermalucidum）是擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬真菌的總稱，為我國具有較高藥用價值的傳統(tǒng)珍貴中藥材，自古就有“仙草”“還魂草”的美譽(yù)，被歷代醫(yī)藥家視為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的神奇珍品?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將“六芝”列為草部上品之首，并說久服皆可“輕身不老，延年神仙”，同時也是《本草綱目》中收錄的唯一進(jìn)入五經(jīng)的藥物，對心、肝、脾、肺、腎等五臟具有補(bǔ)益作用[1]。靈芝在世界各地均有分布，以熱帶和亞熱帶地區(qū)為多。目前已實(shí)現(xiàn)人工培育，其孢子粉、子實(shí)體均可入藥。

靈芝孢子粉在生物學(xué)上被稱為“擔(dān)孢子”，是靈芝在生長發(fā)育后期從靈芝菌褶中噴射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，即靈芝的種子，能夠?qū)㈧`芝的遺傳物質(zhì)全部保留下來[2-3]。相關(guān)研究顯示，靈芝孢子粉具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤、保護(hù)肝臟等多種作用。但由于靈芝孢子粉由高分子纖維物質(zhì)組成，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、質(zhì)地堅(jiān)硬，影響孢內(nèi)物質(zhì)的消化吸收，破壁后更適合腸胃直接吸收，且較靈芝其他部位有效成分的含量高[5-6]。

靈芝孢子粉三萜（Ganodermalucidumsporetriterpenes，GLST）是靈芝的主要次級代謝產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。根據(jù)三萜類化合物所連接的官能團(tuán)和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同，可分為靈芝酸、靈芝醇、靈芝醛和靈芝內(nèi)酯等幾大類[7]，一般將含有羧基的三萜類物質(zhì)稱為靈芝酸。靈芝酸的生理活性主要是由具有不同功能的側(cè)鏈基團(tuán)決定的[8]。GLST是靈芝中的主要活性成分，現(xiàn)已證實(shí)其具有廣泛的生物活性。本文通過查閱、整理國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)，對GLST的結(jié)構(gòu)、提取工藝和生物活性等進(jìn)行綜述，為其深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 GLST的結(jié)構(gòu)

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同，三萜類化合物可分為單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)、五環(huán)和鏈狀三萜。靈芝中三萜類化合物按結(jié)構(gòu)分為四環(huán)或五環(huán)三萜[9]，包括靈芝酸、赤芝酸、靈芝醇等，其中多數(shù)屬于羊毛甾烷衍生物，結(jié)構(gòu)多樣且高度氧化。根據(jù)碳原子數(shù)可分為C24、C27、C30三大類[10]。根據(jù)官能團(tuán)和側(cè)鏈將其命名為靈芝酸、靈芝酸甲酯、赤靈酸、靈赤酸、靈赤酸甲酯、靈芝孢子酸、赤芝孢子內(nèi)酯、靈芝醇、靈芝醛和靈芝內(nèi)酯等[11]。靈芝孢子粉中的三萜類化合物包括：靈芝孢子酸A (Ganosporeic acid A)、靈芝酸A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ 和 θ(Ganoderic acid A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ、θ)、Ganoderiol F、Ganodermanontriol、Ganodermanondiol、Lucidumol A、Lucidumol B、Lucidenicacid SP1等。

2 GLST的提取工藝

2.1 傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取方法 靈芝三萜類化合物的結(jié)構(gòu)特性，決定了其難溶于水、易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)。一般常選用乙醇、甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑在常溫或高溫下進(jìn)行浸提或回流粗提。提取的效果取決于溶劑的選取、溶劑的用量、時間、溫度等因素，通過正交試驗(yàn)，得到最佳提取工藝參數(shù)。李康等[12]利用響應(yīng)面優(yōu)化提取靈芝破壁孢子粉中總?cè)?，含量可達(dá)6.45%，其最佳提取工藝條件為提取溶劑95%，料液比1︰60 mg/mL，溫度85 ℃，乙醇回流提取2 h，提取2次。

2.2 超聲波輔助提取 超聲波是指頻率在2×104～1×107Hz范圍內(nèi)的聲波，經(jīng)超聲波處理能產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化效應(yīng)及攪動作用，增加溶劑的滲透力，從而大大提高有效成分的提取率。康同輝等[13]以靈芝為原料，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計，確定超聲波輔助乙醇浸提靈芝三萜的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對三萜提取影響程度大小順序?yàn)槌暅囟龋疽掖紳舛龋境晻r間＞料液比，最佳工藝條件為乙醇濃度95%、超聲時間15 min、超聲溫度80 ℃、料液比1︰25，此時靈芝三萜得率為2.19%。Shen等[14]以靈芝孢子粉為原料，采用超聲輔助工藝從靈芝孢子粉中提取了三萜類化合物，并利用響應(yīng)面方法進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明其超聲提取的最佳工藝參數(shù)為：超聲功率為564.6 W，乙醇濃度為75%，超聲時間為5.4 min，料液比為1︰50，超聲波探頭距離為8.2 cm，在最佳超聲工藝條件下，實(shí)驗(yàn)值（0.97±0.04）與預(yù)測值（0.99）之間無明顯差異。

2.3 微波輔助提取 近年來，微波輔助提取技術(shù)作為一種新型提取技術(shù)，以提取時間短、提取效率高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用。該技術(shù)是利用產(chǎn)生的高頻電磁波，穿透組織外層結(jié)構(gòu)而迅速到達(dá)組織內(nèi)部。由于吸收微波能使組織內(nèi)部溫度和壓力迅速上升，導(dǎo)致細(xì)胞破裂，有效成分自由流出，所以能夠迅速、有效地提取植物類的有效成分。盧彥芳等[15]結(jié)合索氏提取的原理，自制了微波連續(xù)抽提裝置，通過與傳統(tǒng)方法的比較，研究了微波連續(xù)抽提法的特點(diǎn)和萃取效率，提出了最優(yōu)方案：以95%乙醇為萃取溶劑，微波功率200 W，微波時間14.5 min，總?cè)铺崛÷蕿?3.6%。

2.4 超臨界CO2萃取法 超臨界流體萃取技術(shù)是一種集分離、純化、富集于一體的高新分離技術(shù)，它以臨界壓力、臨界溫度以上的CO2作為萃取溶劑，具有提取效率高、選擇性好、速度快、溫度低等獨(dú)特優(yōu)勢，是一種無毒、無污染的綠色生物分離技術(shù)。另外，CO2的超臨界溫度低，可以有效地防止熱敏性成分如靈芝三萜類成分的氧化和反應(yīng)，完整保存生質(zhì)物體的活性。華正根等[16]采用不同高壓的超臨界CO2提取法與傳統(tǒng)的乙醇回流提取法進(jìn)行比較。研究表明，高壓超臨界CO2提取工藝條件為：提取壓力85 mPa，提取溫度50 ℃，提取時間4 h，在此條件下靈芝三萜含量為1.35%，而采用乙醇回流提取法提取的靈芝三萜含量為0.92%。與傳統(tǒng)乙醇回流提取法相比，用高壓超臨界CO2提取法，靈芝三萜含量提高了46.7%。

3 GLST的藥理活性

靈芝三萜因其結(jié)構(gòu)和種類多樣性，決定了其藥理學(xué)和生物學(xué)活性的多樣性，具有抗氧化、保肝護(hù)肝、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、降血脂、降血糖、防治心血管疾病、緩解哮喘、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抑制血小板聚集和防治癲癇等作用。

3.1 抗氧化 自由基和活性氧作為涉及氧化還原酶和代謝過程中的副產(chǎn)物，可通過氧化作用來破壞細(xì)胞，這種損傷經(jīng)過長期積累會引起衰老和各種年齡相關(guān)的疾病[17]。Kan等[18]研究發(fā)現(xiàn)水提醇沉獲得GLP80具有最佳的還原能力，DPPH自由基和氧自由基清除能力最好，效果依次優(yōu)于GLP、GLP60、GLP40。研究顯示靈芝醇提物（EGL）可以增加Nrf2的表達(dá)和磷酸化，導(dǎo)致HO-1的上調(diào)以發(fā)揮其抗氧化作用[19]。

3.2 保肝護(hù)肝 靈芝三萜具有保肝作用，能使變性、壞死的肝臟細(xì)胞得到明顯的改善和恢復(fù)。黃宗銹等[20]采用經(jīng)典的四氯化碳（CCl4）模型，同時給予動物低、中、高劑量的靈芝三萜，通過血清生化指標(biāo)的檢測，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜能夠明顯抑制CCl4引起小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的升高，此外靈芝三萜還能使肝臟組織形態(tài)學(xué)上的肝細(xì)胞變性、壞死程度得到明顯的改善和恢復(fù)，表明靈芝三萜類成分對CCl4引起的肝臟損傷有較好的保護(hù)作用。趙燕平等[21]通過尾靜脈注射Con A建立免疫性肝損傷小鼠模型，灌胃給予不同劑量的破壁靈芝孢子粉，研究表明破壁靈芝孢子粉能夠改善Con A誘導(dǎo)免疫肝損傷模型小鼠血清ALT、AST水平及肝組織炎癥程度。靈芝酸屬三萜類化合物，可通過改善肝功能障礙，降低肝臟自由基水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜的完整，實(shí)現(xiàn)對免疫性肝損傷的保護(hù)[22]。

3.3 增強(qiáng)免疫 赤芝（GLK）中的三萜類化合物能通過增加白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor，TNF）-α的表達(dá)來刺激免疫應(yīng)答，經(jīng)GLK三萜治療后，小鼠的脾臟和胸腺等免疫器官指標(biāo)明顯增加，GLK三萜類化合物在體外和體內(nèi)均具有抗肺癌活性、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[23]。李立等[24]經(jīng)口給予BALB/c小鼠不同劑量的破壁靈芝孢子粉連續(xù)30 d，溶劑對照組給予蒸餾水。通過刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、足趾增厚實(shí)驗(yàn)、抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、半數(shù)溶血值實(shí)驗(yàn)、碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和自然殺傷細(xì)胞活性測定評價免疫功能，結(jié)果表明破壁靈芝孢子粉對小鼠免疫功能具有增強(qiáng)作用。

3.4 抗腫瘤 腫瘤對人類的危害極大，開發(fā)安全高效的抗腫瘤藥物一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。靈芝三萜類化合物是靈芝的重要藥效成分。李康等[12]研究發(fā)現(xiàn)靈芝總?cè)茖θ私Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的IC50值分別為1.29、1.68、3.81 mg/mL；不同濃度的靈芝總?cè)疲?.64、1.6、4.0、10 mg/mL）作用于結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞36 h后能顯著誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡。柴秀麗等[25]研究破壁靈芝孢子粉（GLS）對肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下成瘤模型的作用及其機(jī)制，研究表明破壁靈芝孢子粉能夠抑制裸鼠肝癌SMMC-7721細(xì)胞皮下瘤體生長，其機(jī)制可能與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。Gao等[26]通過研究靈芝三萜對口腔黏膜癌模型的作用，發(fā)現(xiàn)靈芝三萜能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，起到抑制口腔黏膜癌的作用。鐘志如等[27]通過研究破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞皮下移植瘤生長增殖的影響，研究發(fā)現(xiàn)破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬能夠抑制腫瘤細(xì)胞增長及繁殖作用，并顯著降低腫瘤P53的表達(dá)達(dá)到潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。

3.5 降血脂血糖 靈芝孢子粉可以降低小鼠血清總膽固醇（TCHO）、血漿膽固醇、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和血清甘油三酯（TG），表明靈芝孢子粉具有調(diào)節(jié)血脂的作用[28]。靈芝三萜（GLTs）是醛糖還原酶和α-葡糖苷酶的活性抑制劑，可抑制餐后高血糖，在糖尿病治療中發(fā)揮重要作用。Fatmawati等[29]通過研究靈芝中羊毛甾烷型三萜類化合物作為α-葡糖苷酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系，研究表明C-3處的OH取代基是重要特征，并且側(cè)鏈中的羧基對于α-葡糖苷酶抑制活性的識別是必需的。

3.6 防治心血管疾病 趙東生等[30]以原位性高血壓大鼠為對象進(jìn)行研究表明，靈芝酸可提高超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，清除自由基、增加NO生成、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善和恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，起到降壓的作用。

3.7 緩解哮喘 通過皮膚試驗(yàn)和抗原特異性血清IgE檢測鑒定每名哮喘患者的特異性過敏情況，各項(xiàng)指標(biāo)表明靈芝酸β（GAβ）能有效恢復(fù)患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）的Th1/Treg-Th2平衡，增加白細(xì)胞介素-5（IL-5）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素 -10（IL-10）和白細(xì)胞介素 -12（IL-12）水平[31]，使哮喘癥狀得到有效緩解。靈芝三萜中的某些化合物對由中性粒細(xì)胞等釋放的炎癥介質(zhì)有抑制作用。在哮喘的鼠模型中，富含靈芝三萜的提取物顯著減弱了氣道高反應(yīng)性，減少了總體粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，減少了炎癥介質(zhì)的水平。

3.8 抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性 艾滋病毒是一種高度傳染性的病毒，影響全球約3500萬人。研究表明，從靈芝中提取分離得到三萜類物質(zhì)（靈芝酸β、靈芝酚B、靈芝酮二醇、靈芝馬酮和丹芝酸A），對HIV-1病毒、HIV-1蛋白酶均有一定的抑制作用，IC50在20～90 μmol/L[32]。在活性實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)赤芝中的靈芝酸B和靈芝醇B對HIV-1蛋白酶有較強(qiáng)的抑制作用，從紫芝中分離到的靈芝醇F等對HIV-1蛋白酶也有較強(qiáng)的抑制效果IC50在20～40 μmol/L[33-34]。

3.9 抑制血小板聚集 藥物抗血小板聚集是目前臨床上治療缺血性腦卒中的常用方式，劉玉蓮等[35]研究靈芝孢子粉對高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)大鼠血液流變學(xué)的影響，與模型組相比，靈芝孢子粉能夠降低血小板聚體率、血液黏度及體外血栓長度和濕重，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。靈芝孢子粉對Hhcy大鼠有保護(hù)作用，其可能通過影響血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)而發(fā)揮藥理作用。

3.10 防治癲癇 靈芝孢子粉可以增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量和保持細(xì)胞的形態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)、抑制神經(jīng)系統(tǒng)中N-鈣黏素的表達(dá)來保護(hù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，還通過降低癲癇大鼠神經(jīng)生長因子（NGF）的過度表達(dá)發(fā)揮抗癲癇的作用[36]。Wang等[37]通過對癲癇患者回顧性研究探討靈芝孢子粉治療癲癇的可行性和安全性，結(jié)果表明靈芝孢子粉可能有效減少癲癇患者每周的發(fā)作頻率。

4 GLST的應(yīng)用

靈芝孢子粉對多種病癥有輔助治療作用[38]。臨床腫瘤試驗(yàn)表明，靈芝孢子粉可以改善肺癌晚期患者的疲勞狀況和提高生活質(zhì)量[39]；在干預(yù)神經(jīng)衰弱患者過程中，明顯改善了患者的失眠多夢、健忘、煩躁等各種癥狀；可改善糖尿病患者的胰臟血液循環(huán)，降低血糖；可通過促進(jìn)骨髓內(nèi)細(xì)胞增生及成熟，達(dá)到補(bǔ)血作用和提高免疫機(jī)能的效果；可改善患者的失眠癥狀、改善腫瘤患者的精神及飲食情況等。靈芝三萜類化合物在制藥領(lǐng)域有一定的應(yīng)用，用于生產(chǎn)各類抗癌[40-41]、護(hù)肝[42-43]、抗氧化[44-45]、提高免疫力[46]和降血糖血脂類藥物。

5 研究前景展望

近年來，國內(nèi)外學(xué)者已對靈芝孢子粉進(jìn)行了廣泛的藥理作用和保健功能的研究，對部分活性成分進(jìn)行了提取分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定，不斷有新的藥理活性被報道，在新藥開發(fā)、治療佐劑、保健食品等方面展現(xiàn)出巨大的開發(fā)前景。同時隨著靈芝種植規(guī)模的擴(kuò)大，栽培技術(shù)和靈芝孢子收集技術(shù)的發(fā)展，破壁方法及分離技術(shù)的進(jìn)步，對其研究將會不斷深入，靈芝孢子粉更多的藥理作用將會不斷被發(fā)掘和證實(shí)，開發(fā)出新型藥品和新型保健品，進(jìn)一步推動靈芝孢子粉精深加工產(chǎn)品走向國際化。