腸道菌群調(diào)節(jié)腸道MicroRNA治療骨質(zhì)疏松癥

白浩 孫海飚 韓曉強(qiáng) 張子楠 李光明 薛建剛 張錦濤 許磊 馮志國(guó)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，山西 太原 030001 2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科，山西 太原 030001

1 骨質(zhì)疏松癥概述

全身骨骼系統(tǒng)是一個(gè)處于動(dòng)態(tài)更新的系統(tǒng)，經(jīng)歷著不斷重塑的過(guò)程，參與該過(guò)程的細(xì)胞包括成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，當(dāng)動(dòng)態(tài)平衡被打破，趨向于破骨細(xì)胞活性相對(duì)增強(qiáng)即會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)[1]。OP的特點(diǎn)是骨量降低，骨組織細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境惡化，最終導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。OP可根據(jù)雌激素缺乏或病理變化分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種[2]。有報(bào)道顯示在美國(guó)OP影響了大約5 400萬(wàn)人，其中50歲及以上的人群中，三分之一的女性和五分之一的男性會(huì)因OP而骨折，預(yù)計(jì)到2025年，因骨質(zhì)疏松性骨折造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將超過(guò)250億美元[3]。

OP治療目的是防止骨質(zhì)丟失，改善骨重建不平衡。目前，除了通過(guò)健康生活方式干預(yù)，還可通過(guò)補(bǔ)充維生素D和鈣劑預(yù)防治療OP[4]。對(duì)于存在高骨折風(fēng)險(xiǎn)的患者，則應(yīng)及早進(jìn)行藥物干預(yù)治療。但是有報(bào)道顯示，目前的抗OP藥物對(duì)上消化道存在刺激，嚴(yán)重者會(huì)引發(fā)頜骨骨壞死、骨肉瘤、乳腺癌、不典型轉(zhuǎn)子下骨折等嚴(yán)重不良事件[5]。這推動(dòng)著人們不斷探索和尋找預(yù)防、治療OP的新方案。

2 MicroRNA

2.1MicroRNA概述

MicroRNA(miRNA)是由真核細(xì)胞核中內(nèi)含子或外顯子DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，在被輸出到細(xì)胞質(zhì)之前，轉(zhuǎn)錄形成的初級(jí)前體miRNA(pri-miRNA)被加工成含70個(gè)堿基對(duì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體miRNA。隨后pre-miRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，由內(nèi)切酶Dicer將其裂解成小分子的雙鏈RNA片斷，然后將單鏈加載到沉默復(fù)合物中(RISC)，形成成熟的miRNA復(fù)合物[6]。miRNA能夠結(jié)合信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(qū)從而抑制mRNA的翻譯過(guò)程[7]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA可能由體內(nèi)一系列細(xì)胞分泌，如腸上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、血細(xì)胞或脂肪細(xì)胞，在人體生理或病理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用[8]。miRNA 不僅在細(xì)胞內(nèi)液可以檢測(cè)到，且在人的多種體液中，如血液、尿液、唾液及腦脊液中都可檢測(cè)到[9]。因此，這使得將miRNA作為疾病診斷依據(jù)及治療靶點(diǎn)成為可能。

2.2miRNA與OP

miRNA具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的作用，可參與調(diào)節(jié)骨形成和吸收中不同的細(xì)胞過(guò)程[10]。miRNA可通過(guò)抑制成骨抑制因子或介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，具有促進(jìn)骨形成作用[11]。由于miRNA發(fā)揮作用具有嚴(yán)格的核苷酸配對(duì)原則，因此當(dāng)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)位于或接近miRNA與mRNA相互識(shí)別的區(qū)域，即可能破壞miRNA-mRNA的相互作用，最終導(dǎo)致骨代謝異常和OP的發(fā)生[12]。與I型前肽(P1NP)和血清C端肽膠原蛋白(CTX)相比，miRNA在體液中往往具有更高的可測(cè)性和更強(qiáng)的穩(wěn)定性[13]。因此，可以看出miRNA不僅是骨代謝過(guò)程中的調(diào)節(jié)因子也可以作為骨代謝標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。據(jù)報(bào)道，7個(gè)miRNA家族的遺傳變異可能影響骨質(zhì)代謝過(guò)程，包括miR-27a、miR-124、miR-125、miR-146a、miR-149、miR-196a2和miR-2861。最近的研究進(jìn)一步揭示了幾個(gè)新的多態(tài)性家族(miR-140-5p、miR-149、miR-3679、miR-4274、miR-433、miR-499和pri-miR-34b/c)，這些多態(tài)性家族也與OP的發(fā)生過(guò)程密切相關(guān)[14-15]?？梢?jiàn)miRNA與骨形成密切相關(guān)，并且可用于檢測(cè)評(píng)估骨代謝情況。隨著相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，將有更多具有調(diào)節(jié)骨代謝作用的miRNAs被發(fā)現(xiàn)。

3 腸道菌群與益生菌

3.1腸道菌群與益生菌概述

腸道菌群(gut microbiota，GM)是宿主健康所必需的，在宿主新陳代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用、病原體抵抗和免疫功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。GM表達(dá)的基因組數(shù)量遠(yuǎn)約為人類基因組數(shù)量的100倍[16]。GM中也含有益生菌，其中乳酸菌、腸球菌、大腸桿菌、雙歧桿菌作為益生菌已被廣泛應(yīng)用于日常生活中[17]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)益生菌可能具有預(yù)防和治療疾病潛力。

3.2益生菌與OP

益生菌可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)pH值、分泌抗菌肽、增加黏液分泌、調(diào)節(jié)宿主腸道免疫系統(tǒng)、重構(gòu)GM結(jié)構(gòu)進(jìn)而改善腸道上皮組織通透性[18]。Britton等[19]利用12周大Balb / c小鼠制造卵巢切除(ovariectomized，OVX)模型，給予羅伊氏乳桿菌ATCC 6475干預(yù)治療后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)干預(yù)治療后的OVX小鼠與對(duì)照組小鼠相比骨密度(bone mineral density，BMD)顯著增加，完全不受骨量丟失的影響。進(jìn)一步研究認(rèn)為羅伊氏乳桿菌對(duì)骨的保護(hù)作用是由于其抑制破骨細(xì)胞中mRNA水平下降，進(jìn)而減少RANKL和TRAP5的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的?？梢?jiàn)益生菌可以防治OP，同時(shí)在骨代謝基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控。Collins 等[20]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌6475能夠系統(tǒng)性地抑制腸道和骨髓中促炎細(xì)胞因子和促破骨細(xì)胞因子的基因表達(dá)，減輕腸道炎癥，進(jìn)而促進(jìn)鈣通過(guò)腸道屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。Campbell 等[21]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFAs)，可降低腸道pH值，進(jìn)而增加礦物質(zhì)的吸收，防治OP。此外，雙歧桿菌被證明還能通過(guò)減少氧化應(yīng)激進(jìn)而減少NF-κB基因表達(dá)，預(yù)防雌激素缺乏大鼠骨質(zhì)流失[22]?？梢?jiàn)益生菌可以通過(guò)調(diào)節(jié)宿主腸道黏膜免疫細(xì)胞中炎癥因子轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，進(jìn)而改善離子通道通透性干預(yù)OP?？傊?，益生菌可能通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，減輕腸道炎癥，改善離子通道狀態(tài)，最終實(shí)現(xiàn)預(yù)防骨量丟失作用。

4 GM和miRNA相互作用關(guān)系

有研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌(germ-free，GF)小鼠和無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)小鼠的盲腸組織中有16個(gè)miRNA表達(dá)存在差異[23]，將SPF級(jí)小鼠糞便中提取出的GM移植入無(wú)菌小鼠腸道后，可以觀察到無(wú)菌小鼠的回腸和結(jié)腸內(nèi)有9個(gè)miRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，進(jìn)而導(dǎo)致其下游目的基因調(diào)控產(chǎn)物發(fā)生變化，而這些目的基因的表達(dá)產(chǎn)物與腸道屏障和免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)[24]?？梢?jiàn)GM可以調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞、腸黏膜免疫細(xì)胞內(nèi)miRNA水平，最終改變腸上皮通透性和黏膜免疫狀態(tài)。為研究miRNA是否參與了微生物介導(dǎo)的宿主基因表達(dá)調(diào)控，Dalmasso等[24]使用GF小鼠與SPF小鼠的微菌群進(jìn)行克隆，通過(guò)DNA微陣列基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-665的上調(diào)導(dǎo)致ATP binding cassette subfamily C member3 (Abcc3)基因顯著下調(diào)。可見(jiàn)GM可以通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA水平進(jìn)而影響宿主靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。

目前國(guó)內(nèi)外研究主要關(guān)注于GM與OP、miRNA與OP，但關(guān)于GM調(diào)節(jié)腸道m(xù)iRNA治療OP 鮮有報(bào)道。雖然目前尚未有報(bào)道明確提出腸道內(nèi)具有調(diào)節(jié)OP的miRNA，但是已有明確報(bào)道通過(guò)調(diào)節(jié)GM可以調(diào)節(jié)腸道m(xù)iRNA表達(dá)，進(jìn)而緩解炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，而IBD與OP有著密切的關(guān)系。因此通過(guò)上述分析我們有理由提出GM很可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞、黏膜免疫細(xì)胞內(nèi)miRNA，進(jìn)而調(diào)控與腸道屏障通透性、黏膜免疫狀態(tài)相關(guān)靶基因表達(dá)，最終治療OP。

5 IBD與OP

隨著人們認(rèn)識(shí)深入，OP已被描述為慢性炎癥性疾病。患有IBD、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、脊椎關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病等全身炎性免疫變態(tài)疾病的患者大多都長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療，而糖皮質(zhì)激素對(duì)骨骼有有害影響。炎癥本身是造成OP的另一個(gè)主要決定因素[25]。Ashcroft等[26]發(fā)現(xiàn)白介素2(IL-2)缺乏的小鼠自體免疫模型中，小鼠骨量減少與CD4自身反應(yīng)性T細(xì)胞的去調(diào)節(jié)和過(guò)度活化密切相關(guān)。NF-κB受體激活劑配體(RANKL)的增加可導(dǎo)致骨量丟失，通過(guò)調(diào)節(jié)RANKL-RANK與外源性重組骨保護(hù)蛋白(Fc-OPG)的相互作用，可以逆轉(zhuǎn)骨骼異常?？梢钥闯?，IBD患者由于GM失調(diào)促發(fā)腸道炎癥免疫變態(tài)反應(yīng)，是OP發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此，控制腸道炎癥狀態(tài)使IBD減輕，是治療IBD所致OP的關(guān)鍵。

5.1GM通過(guò)調(diào)節(jié)腸道m(xù)iRNA緩解IBD，間接治療OP

Lindsa等[27]借助超高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠模型空腸和結(jié)腸黏膜的miRNA進(jìn)行了定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)Dicer敲除小鼠中有許多腸屏障基因在轉(zhuǎn)錄后受到調(diào)控，它們可能依賴于miRNA。Xue等[28]觀察發(fā)現(xiàn)在SPF小鼠，腸道微生物群抑制宿主腸道上皮細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)中miR-10a的表達(dá)，有助于維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。Xue等[29]在另一個(gè)大腸桿菌感染的小鼠模型腸道中，發(fā)現(xiàn)miR-107在上皮細(xì)胞和CD11c+髓樣細(xì)胞(包括炎癥腸道中的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中顯著降低，從而下調(diào)IL - 6、IFN-γ、TNF-α。結(jié)合前面所述GM對(duì)于腸道m(xù)iRNA有調(diào)控作用，我們有理由推測(cè)GM可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道與IBD相關(guān)的miRNA表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控腸上皮屏障功能及腸黏膜免疫狀態(tài)緩解IBD，最終減輕由IBD導(dǎo)致的OP。

5.2GM通過(guò)調(diào)節(jié)腸道m(xù)iRNA直接治療OP

IBD和OP具有相同的miRNA作為宿主基因調(diào)控的中介，調(diào)控腸道通透性、免疫變態(tài)反應(yīng)及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活性。Xue等[29]研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a在GF小鼠腸道內(nèi)高表達(dá)，但在脾臟中表達(dá)水平很低，說(shuō)明miR-10a主要在腸道內(nèi)表達(dá)。結(jié)腸炎小鼠炎癥性腸組織表達(dá)低水平miR-10a和高水平IL-12/IL-23p40。微生物群通過(guò)TLR-TLR配體相互作用，以myd88依賴的方式下調(diào)DC中 miR-10a的表達(dá)，促使DC產(chǎn)生大量IL-12/IL-23p40，大量炎癥因子激發(fā)IBD的發(fā)生，從而腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)被破壞。Hou等[30]使用miR-10a 轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞前細(xì)胞系MC3T3-E1a，研究發(fā)現(xiàn)miR-10a 可以阻遏Wnt /β-catenin 信號(hào)通路。Wnt /β-catenin 信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的增殖、分化以及骨組織的再生中起著重要作用，該通路的激活可以促進(jìn)骨組織的再生。Koukos等[31]發(fā)現(xiàn)miR-124在潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者結(jié)腸組織中特異性下調(diào)，直接靶向結(jié)腸組織中STAT3磷酸化水平升高。Xue等[29]發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中，用 pre-miR-124治療，可使破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。NFATc1 是破骨細(xì)胞分化的一個(gè)關(guān)鍵因素，miR-124 能夠直接作用于 NFATc1，抑制破骨細(xì)胞的分化，緩解關(guān)節(jié)炎的發(fā)展?？梢钥闯瞿c道中也具有與骨代謝調(diào)控有關(guān)的miRNA，結(jié)合前面所述GM對(duì)于腸道m(xù)iRNA有調(diào)控作用，我們有理由推測(cè)GM通過(guò)調(diào)節(jié)腸道與骨代謝相關(guān)的miRNA治療OP。

綜合以上所述，GM一方面可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道IBD相關(guān)miRNA減輕腸道炎癥，緩解IBD進(jìn)而間接治療OP；另一方面可以直接調(diào)節(jié)腸道高表達(dá)的與OP和IBD同時(shí)相關(guān)的miRNA直接治療OP。通過(guò)檢測(cè)靶向調(diào)節(jié)腸道免疫應(yīng)答途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子；腸黏膜及上皮屏障功能；腸道炎癥因子水平[32]可以判斷GM究竟是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道m(xù)iRNA減輕腸道炎癥狀態(tài)間接治療OP，還是通過(guò)直接調(diào)節(jié)腸道高表達(dá)的與OP和IBD同時(shí)相關(guān)的miRNA直接治療OP。

6 總結(jié)與展望

總之，目前研究尚局限于GM干預(yù)OP、miRNA干預(yù)OP，很少關(guān)注GM可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)miRNA治療OP。通過(guò)分析可以看出GM可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)miRNA水平影響宿主腸道基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物，進(jìn)而影響腸上皮通道和腸黏膜免疫應(yīng)答，最終達(dá)到治療OP的目的。雖然目前尚無(wú)法得知究竟是哪種GM甚至是益生菌可以靶向調(diào)控腸道m(xù)iRNA水平的變化，也無(wú)法得知具體參與該過(guò)程的腸道m(xù)iRNA，但隨著腸道菌群檢測(cè)技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，這一切將變的可行，或許能夠?yàn)镺P 的預(yù)防和治療提供新的思路。