組織激肽釋放酶家族與胰腺癌

陳越，鄭軍

0 引言

胰腺癌屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，由于胰腺位置相對(duì)隱匿，解剖相對(duì)復(fù)雜，導(dǎo)致胰腺的早期病變不易被臨床診斷，有癥狀的胰腺癌多屬晚期。胰腺癌最常見(jiàn)的病理類型是導(dǎo)管腺癌（PDAC），占胰腺癌的90%以上，胰腺導(dǎo)管腺癌具有不同的亞型，預(yù)后也有一定的差別[1]。關(guān)于胰腺癌的病因尚沒(méi)有確切的說(shuō)法，目前主要認(rèn)為其發(fā)病與遺傳及復(fù)雜的環(huán)境因素密切相關(guān)，有觀點(diǎn)認(rèn)為肥胖、Ⅱ型糖尿病、過(guò)量飲用咖啡等與胰腺癌的發(fā)生有一定關(guān)系[2-5]。2018年，全球共報(bào)告了458 918例新的胰腺癌病例，同年有432 242例患者死于該疾病[6]。在中國(guó)，胰腺癌的診治現(xiàn)狀同樣不容樂(lè)觀，有統(tǒng)計(jì)顯示，2003—2015年期間，胰腺癌在中國(guó)的五年生存率從11.7%逐漸降至7.2%[7]。在醫(yī)學(xué)事業(yè)飛速發(fā)展的今天，其他腫瘤的生存率均有所提高，唯獨(dú)胰腺癌的生存率反而下降，所以亟需新的胰腺癌診治手段及方法。目前關(guān)于胰腺癌的治療主要以外科手術(shù)為主，根據(jù)2018年中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)胰腺癌專業(yè)委員會(huì)結(jié)合中國(guó)國(guó)情制定的《胰腺癌綜合診治指南》，胰腺癌外科術(shù)式包括了胰十二指腸切除術(shù)、遠(yuǎn)側(cè)胰腺切除術(shù)、全胰腺切除術(shù)等。但由于診斷措施的局限性及解剖的復(fù)雜性，只有約20%的患者適于外科手術(shù)[8]，即使在施行精準(zhǔn)的外科手術(shù)之后，其中位生存期也僅為15～20月，5年生存率為8%～15%[9]。

組織激肽釋放酶（kallikrein-related peptidase,KLKs）屬于蛋白水解酶的絲氨酸蛋白酶家族，最早由Kraut等1930年在胰腺中發(fā)現(xiàn)，并命名為Kallikrein，其編碼基因主要位于19q13.3～13.4，共有15個(gè)家族成員[10-11]。KLKs是體內(nèi)主要的降壓系統(tǒng)之一，故其又被稱為血管舒緩素。經(jīng)過(guò)多年的研究，KLKs被發(fā)現(xiàn)參與了多種生物學(xué)行為[12]，包括參與調(diào)控心血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能。當(dāng)然，KLKs研究最廣泛的領(lǐng)域當(dāng)屬皮炎[13]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)KLKs家族中很多成員在某些癌癥中上調(diào)或下調(diào)[14]，其可能作為癌癥診斷或治療的生物靶標(biāo)，由此引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。例如KLK1、KLK2及KLK3可能是前列腺癌潛在的生物治療靶點(diǎn)[15-16]，尤其是KLK3，也就是我們熟知的PSA（前列腺特異性抗原）已在臨床上使用多年；KLK4在卵巢癌及三陰性乳腺癌中展現(xiàn)了一定的生物治療潛力[17-18]；KLK5與結(jié)直腸癌預(yù)后具有一定的關(guān)系[19]。在眾多研究報(bào)告中，我們發(fā)現(xiàn)組織激肽釋放酶家族中多名成員與胰腺癌的相關(guān)惡性生物學(xué)行為有一定關(guān)系，本文就組織激肽釋放酶家族與胰腺癌的關(guān)系作一綜述。

1 KLK6與胰腺癌

KLK6是含有223個(gè)氨基酸殘基的絲氨酸蛋白酶[20]，其基因在大腦中強(qiáng)烈表達(dá)，主要分布在腦干和脊髓，其次是脈絡(luò)叢以及灰質(zhì)，它與人類神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有著密切關(guān)系，在諸如阿爾茲海默癥等疾病中研究尤為廣泛[21]。同時(shí)KLK6在胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中也有著一定的研究?jī)r(jià)值。早在2004年，Yousef等[22]就運(yùn)用基因表達(dá)和表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag,EST）表達(dá)譜進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLK6在胰腺癌中高表達(dá)。Diamandis[23]曾先后就100例慢性胰腺炎、胰腺腺癌及正常受試對(duì)象的血清進(jìn)行了三種組織激肽釋放酶（KLK6、KLK7及KLK10）的定量試驗(yàn)，其中5例胰腺癌患者KLK6高表達(dá)，在另外5例胰腺癌患者中則發(fā)現(xiàn)KLK6及KLK10同時(shí)升高，而KLK7未在任何患者血清中呈現(xiàn)此狀態(tài)，由此我們可以得出，KLK6作為胰腺癌一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)具有一定的研究?jī)r(jià)值。

關(guān)于KLK6抑制劑的報(bào)告相對(duì)較少，迄今為止共發(fā)現(xiàn)其小分子抑制劑有四種，包括通過(guò)計(jì)算機(jī)虛擬篩選的兩類小分子、基于PAR2的激活肽及香豆素衍生物[24]。Sananes等[25]運(yùn)用一種組合的方式合成了KLK6抑制劑，首先使用流式細(xì)胞儀篩選人淀粉樣蛋白前體蛋白Kunitz的蛋白酶抑制劑域（APPI），然后產(chǎn)生了APPIM17L、I18F、S19F、F34V（APPI-4M）等變構(gòu)形式，其中又以APPI-4M的抑制效率最高，并且在隨后的工作中運(yùn)用合成的抑制劑作用于高表達(dá)KLK6的乳腺癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)該抑制劑對(duì)癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用。隨著研究的不斷深入，KLK6抑制劑對(duì)胰腺癌的治療潛力會(huì)逐漸展現(xiàn)。

2 KLK7與胰腺癌

KLK7最早是從皮膚中提取并鑒定的，所以目前關(guān)于KLK7的報(bào)告多與皮膚疾病有關(guān)，同時(shí)KLK7也與我們的神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病有著密切關(guān)系，在帕金森病中，KLK7可被miR-326通過(guò)MAPK信號(hào)通路反向抑制，從而對(duì)該疾病產(chǎn)生明顯的負(fù)性作用[26]。隨著研究的進(jìn)展，KLK7在腫瘤診治中展現(xiàn)了一定的價(jià)值，有研究表明KLK7在胰腺癌中高表達(dá)。鄭蘇麗等[27]選取了胰腺癌BxPC-3和CFPAC細(xì)胞，并用慢病毒轉(zhuǎn)染從而構(gòu)建過(guò)表達(dá)KLK7的胰腺癌細(xì)胞株，平行使用KLK7-siRNA敲低KLK7，然后用CCK-8及Transwell檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)KLK7可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，降低化療敏感度，敲低KLK7則呈現(xiàn)相反的結(jié)果。Du等[28]選取了49名術(shù)后診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌的患者，將他們的離體標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLK7在癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，而在癌旁組織幾乎不表達(dá)，定量分析得出KLK7在胰腺癌組織中的表達(dá)量是癌旁組織的20倍，由此說(shuō)明了KLK7蛋白在胰腺癌組織中異常高表達(dá)，它可能是胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

基于在胰腺癌中高表達(dá)的KLK7，人們構(gòu)思能否設(shè)計(jì)藥物對(duì)其進(jìn)行抑制，從而對(duì)胰腺癌的惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生一定的影響，所以越來(lái)越多的人把目光投向了KLK7抑制劑的研究及開(kāi)發(fā)工作。KLK7抑制劑絕大多數(shù)是人工合成的，但不乏淋巴上皮組織Kazal型相關(guān)蛋白抑制劑（lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,LEKTI）等天然的抑制劑[29]。按分子量大小分類，KLK7抑制劑可分為大分子以及小分子類，大分子包括了LEKTI8、向日葵胰蛋白酶抑制劑（sunflower trypsin inhibitor,SFTI-1）等；小分子類則包含香豆素類、天然的異香豆素、異甘露糖苷衍生物、5-氨基-2-巰基苯并咪唑基喹唑啉酮衍生物等[30]。相對(duì)于小分子而言，大分子類抑制劑分子量大、化學(xué)性質(zhì)相對(duì)活躍及生物利用度低，導(dǎo)致其研究意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于小分子抑制劑。日本學(xué)者M(jìn)urafuji等就研究了一系列1,3,6-三取代的1,4-二氮雜-7-酮類化合物作為KLK7的抑制劑，其代表性化合物包括15、33a、35a、22g等表現(xiàn)出了對(duì)KLK7強(qiáng)有力的抑制作用[31-32]。香豆素衍生物對(duì)絲氨酸蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制能力，并且其特異性好，毒性小，因此在靶向治療中具有很大的潛力[33]。Du等[28]運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助，通過(guò)Lipinski五次法則、濾片過(guò)濾、對(duì)接篩選等方法，成功獲得了香豆素類KLK7小分子抑制劑，命名為Compound 8和Compound 42，其中Compound 8為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，而Compound 42是不可逆的自殺性抑制劑，RTCA驗(yàn)證了它們對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲具有抑制作用。隨著研究的不斷深入，KLK7小分子抑制劑在胰腺癌治療中的價(jià)值無(wú)疑會(huì)逐漸展現(xiàn)出來(lái)，從而為胰腺癌的靶向治療提供一條完美的思路。

3 KLK10與胰腺癌

KLK10基因又稱為正常上皮細(xì)胞特異性-1基因（normal epithelial cell specific-1,NES1）,它由腺上皮表達(dá)，存在于人體的腎臟、胃腸道、脈絡(luò)叢上皮、周圍神經(jīng)及某些神經(jīng)內(nèi)分泌器官中[21]。KLK10最早從變異的乳腺癌細(xì)胞中分離，所以早期的研究多圍繞乳腺癌，隨后其被發(fā)現(xiàn)在諸如卵巢癌等其他惡性腫瘤中異常表達(dá)，由此在腫瘤診治中展現(xiàn)了一定的潛力。有學(xué)者基于癌癥基因組解剖計(jì)劃（cancer genome anatomy project,CGAP）及其他數(shù)據(jù)庫(kù)的表達(dá)序列標(biāo)簽和基因表達(dá)系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE）得出KLK10在乳腺癌和前列腺癌中被下調(diào)，而在卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和胃癌中均明顯上調(diào)[34]。Cao等[35]運(yùn)用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus,GEO），同時(shí)建立胰腺癌PDX模型并選取確診的胰腺癌患者，確定了KLK10在胰腺導(dǎo)管腺癌及上皮內(nèi)瘤變中均呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其是在有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，且KLK10的表達(dá)與患者遠(yuǎn)期生存率密切相關(guān)，敲低KLK10可以明顯抑制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，阻滯KLK10減弱了FAKSRC-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和激活，這可能是KLK10促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制?？偟膩?lái)說(shuō)，KLK10也應(yīng)該被認(rèn)為是診斷及治療胰腺癌有前途的靶標(biāo)。

MicroRNA是一類非編碼RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控，Chow等[36]證實(shí)了96種KLK家族成員與MicroRNA的相互作用，其中KLK10是靶向最多的組織激肽釋放酶，其次是KLK5及KLK3，并且證明了多個(gè)靶向KLK的MicroRNA在某些惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，研究者選取了let-7f miRNA并驗(yàn)證了其可以導(dǎo)致KLK6和KLK10的蛋白水平顯著降低，由此我們認(rèn)為MicroNRA可以作為有效的KLK10靶向抑制物。Mizoguchi等[37]在后續(xù)的工作中更是對(duì)這一觀點(diǎn)進(jìn)行了佐證，他們利用MicroRNA-8073作用于一系列包括胰腺癌細(xì)胞在內(nèi)的癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)MicroRNA-8073可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，同時(shí)MicroRNA-8073能夠靶向KLK10的3’非編碼區(qū)（3’-UTRs）并觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和生存能力產(chǎn)生顯著的影響；在體內(nèi)試驗(yàn)中，該團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了結(jié)直腸癌的人源腫瘤細(xì)胞移植模型（cell line-derived xenograft,CDX），將合成的MicroRNA-8073作用于該模型，結(jié)果觀察到了對(duì)該模型明顯的抑制效果。由此，MicroRNA作為有效的KLK10靶向抑制物，在腫瘤的治療中展現(xiàn)了巨大的診治潛力。

4 小結(jié)

胰腺癌作為人類醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的一個(gè)難題，困擾了幾代學(xué)者，不管是手術(shù)方式的革新還是化療藥物的改進(jìn)，都沒(méi)能從根本上給患者帶來(lái)太多的收益。所以，重視胰腺癌的非手術(shù)治療方式顯得尤為重要，更多的研究者把目光投向了胰腺癌的靶向治療。組織激肽釋放酶家族自面世以來(lái)，在腫瘤的研究中展示了一定的潛力，它們當(dāng)中的一些成員在胰腺癌中異常表達(dá)，并且與胰腺癌的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)。所以，針對(duì)在胰腺癌中異常表達(dá)的組織激肽釋放酶，利用天然的或人工合成的抑制劑對(duì)其進(jìn)行作用，成為當(dāng)下的一個(gè)熱點(diǎn)，也為胰腺癌的靶向治療提供了一條切實(shí)可行的思路。我們堅(jiān)信隨著研究的深入，以組織激肽釋放酶為靶點(diǎn)的胰腺癌治療方式會(huì)逐漸被更多的研究者們所關(guān)注。