王 碩,張志華
(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,河北 承德 067000)
近年來(lái),mNGS正在從實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)展階段應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷,改變了臨床醫(yī)生診斷和治療感染性疾病和腫瘤以及人類(lèi)宿主基因表達(dá)異常(轉(zhuǎn)錄組)等各類(lèi)疾病的方式。mNGS技術(shù)是將通用接頭連接到要測(cè)序的片段化基因組DNA,然后使用不同的方法產(chǎn)生數(shù)千萬(wàn)的單分子多克隆聚合酶鏈反應(yīng)陣列,然后進(jìn)行大規(guī)模的引物雜交及酶延伸反應(yīng)。2005年二代測(cè)序(Next-generation sequencing,NGS)技術(shù)的出現(xiàn)使宏基因組學(xué)迅速發(fā)展,這是第一次可以同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)甚至幾百萬(wàn)的讀數(shù)進(jìn)行測(cè)序,并且可以同時(shí)檢測(cè)反應(yīng)后每個(gè)步驟產(chǎn)生的信號(hào),通過(guò)計(jì)算機(jī)分析獲得完整的DNA序列信息以得到臨床或環(huán)境樣本的整個(gè)遺傳內(nèi)容[1],測(cè)序成本降低推動(dòng)了mNGS技術(shù)的普及,且因其檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋范圍廣等優(yōu)勢(shì),具有良好的臨床應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì),本文就mNGS的臨床微生物學(xué)分析、病原體-宿主相互作用研究、腫瘤學(xué)和面臨的挑戰(zhàn)等方面進(jìn)行綜述。
1.1 病原微生物的鑒定:醫(yī)學(xué)微生物學(xué)是研究微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類(lèi)和社會(huì)革命活動(dòng)規(guī)律的一門(mén)科學(xué),包括細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、真菌學(xué)等。微生物學(xué)的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)包括培養(yǎng)鑒定、病原體的特異性抗體(血清)或抗原的檢測(cè)及其核酸(DNA或RNA)的分子生物學(xué)鑒定,目前最常用的檢測(cè)方法為PCR和RT-PCR(多聚酶鏈反應(yīng))。然而,分子生物學(xué)鑒定必須使用特定的引物或探針靶向鑒定特定的病原體,檢測(cè)的病原體種類(lèi)非常有限。宏基因組學(xué)可以檢測(cè)樣本中所有物種的DNA或RNA,能夠快速分析患者樣品中整體微生物群以及人類(lèi)宿主基因組和轉(zhuǎn)錄組,因此,mNGS對(duì)于發(fā)現(xiàn)新型病原體并檢測(cè)健康和患病狀態(tài)下的人類(lèi)具有顯著優(yōu)勢(shì)。
文獻(xiàn)表明目前仍有20%~60%的病例未檢測(cè)到致病病原體[2],基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)研究給病原體的識(shí)別鑒定帶來(lái)了新的方法和思路,mNGS可檢測(cè)臨床樣本中病原體的全部基因信息,獲得有關(guān)主要抗原和毒力基因,并進(jìn)行病毒基因分型,實(shí)現(xiàn)對(duì)新興病原體的識(shí)別、分型和溯源。Samarkos等通過(guò)全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)和美國(guó)的COVID-19的分離株聚集在同一系統(tǒng)進(jìn)化枝中,并發(fā)現(xiàn)其與兩種蝙蝠SARS樣冠狀病毒(Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21)的同源性為86.9%,故判斷其為一種新型冠狀病毒[3],研究還發(fā)現(xiàn)中國(guó)和美國(guó)COVID-19分離株的基因組序列在核苷酸水平上的同源性高達(dá)99.8%至100%,判斷其為同一種冠狀病毒。綜上,基于mNGS對(duì)COVID-19的全面分析一定能獲得該病毒的起源、傳播途徑以及物種屏障等相關(guān)信息,進(jìn)而為傳染病的預(yù)防、控制提供依據(jù)。
1.2 病原微生物組學(xué)分析:mNGS正在逐漸取替16S rDNA基因的靶向測(cè)序,以實(shí)現(xiàn)我們對(duì)不同環(huán)境微生物組成的檢測(cè)鑒定[4]。廣譜抗生素長(zhǎng)期大量應(yīng)用和胃腸外科手術(shù)等多種因素導(dǎo)致腸道菌群比例失調(diào),發(fā)生感染[5],嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致危及生命的暴發(fā)性偽膜性腸炎和中毒性巨結(jié)腸。其中治療方法之一為糞便菌群移植,成功率高達(dá)80~90%,間接證明微生物組學(xué)研究有助于治療艱難梭菌感染[6]。腸道宏基因組相關(guān)研究顯示腸道菌群與肥胖、糖尿病、炎癥性腸病等疾病密切相關(guān),通過(guò)mNGS鑒定腸道菌群失衡有助于靶向菌群移植治療[7],此外,通過(guò)mNGS分析微生物組的多樣性可以對(duì)宿主的健康和疾病狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估,Boulange等發(fā)現(xiàn)不同肺部疾病的肺泡灌洗液具有不同的微生物群落[8]。以微生物為靶點(diǎn),利用mNGS干預(yù)微生物組必將成為臨床治療新的探索方向。
1.3 病原體-宿主相互作用研究:mNGS基因表達(dá)分析具有互補(bǔ)作用,通過(guò)檢測(cè)微生物表達(dá)產(chǎn)物的RNA-seq讀數(shù)可以把感染、定植和活菌與死菌區(qū)別出來(lái)[9],實(shí)現(xiàn)了包括葡萄球菌、白色念珠菌、結(jié)核和流感的診斷治療[10~12]。基于病原體的特異性宿主反應(yīng)也可用于診斷復(fù)雜感染病例,例如膿腫和呼吸道分泌物等。此外,對(duì)于測(cè)序結(jié)果的二次數(shù)據(jù)(即結(jié)合微生物和宿主基因表達(dá)數(shù)據(jù))挖掘可提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。
1.4 在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用:在腫瘤發(fā)生機(jī)制中,mNGS可鑒定與癌癥相關(guān)的病毒(包括皰疹病毒、乳頭瘤病毒、肝炎病毒、EB病毒等)和病毒-宿主相互作用的數(shù)據(jù)[13]。根據(jù)病毒感染及其參與的信號(hào)通路為靶向抗病毒和(或)化療藥物的使用提供信息[14],丙型病毒性肝炎通過(guò)抗病毒治療后肝癌的風(fēng)險(xiǎn)性降低。目前,臨床mNGS主要應(yīng)用于晚期腫瘤的用藥指導(dǎo),多基因、多位點(diǎn)突變的檢測(cè)技術(shù)較傳統(tǒng)檢測(cè)手段具有顯著優(yōu)勢(shì)。此外,腫瘤DNA變異在腫瘤早期或腫瘤負(fù)荷較小時(shí)便出現(xiàn)于血液中,通過(guò)對(duì)血液中的游離DNA的檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷或判斷是否疾病進(jìn)展,mNGS還可用于腫瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、診斷微小殘留病灶等,為腫瘤患者的個(gè)體化診療提供依據(jù)。
mNGS技術(shù)的不斷完善正在推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)模式的發(fā)展,該技術(shù)仍存在諸多問(wèn)題限制其在病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用和發(fā)展,首先,mNGS的測(cè)定結(jié)果缺乏重復(fù)性和質(zhì)量保證,而且成本、報(bào)銷(xiāo)問(wèn)題也是臨床mNGS實(shí)施的障礙,此外,mNGS的檢測(cè)也是一項(xiàng)十分繁復(fù)的工作,需要定制質(zhì)量管理以達(dá)到監(jiān)管目的,另外,不規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作也可能引起外源性背景菌的污染從而增加診斷難度,故在臨床應(yīng)用之前,需進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證研究以獲得可信度高的測(cè)序結(jié)果。
2.1 實(shí)驗(yàn)流程:mNGS檢測(cè)前需要嚴(yán)格的樣品處理方案以避免錯(cuò)誤和交叉感染,包括樣品收集、核酸提取、文庫(kù)制備等過(guò)程,在上述過(guò)程中即使微量外源性DNA或RNA混進(jìn)待測(cè)樣本也可被檢測(cè)出來(lái)從而干擾測(cè)序結(jié)果,由于樣品處理的輕微偏差都會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果發(fā)生較大差異,所以需要將工作流程分為連續(xù)的幾個(gè)步驟,工作人員只需負(fù)責(zé)自己的工作步驟,這樣有助于避免實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤,此外,背景微生物數(shù)據(jù)庫(kù)(包括mNGS測(cè)序過(guò)程中檢測(cè)到的正常微生物和污染產(chǎn)生的微生物)的建立至關(guān)重要,通過(guò)排除背景微生物以實(shí)現(xiàn)臨床診斷,除此之外,還需要制定參考標(biāo)準(zhǔn)以確保mNGS的測(cè)序質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。
2.2 生物信息學(xué)技術(shù):mNGS在我國(guó)臨床感染性疾病的診斷中尚未普及,現(xiàn)有檢測(cè)機(jī)構(gòu)的測(cè)序方法,不僅生物信息算法存在差異,而且所用的數(shù)據(jù)庫(kù)也有所不同,導(dǎo)致微生物的鑒定以及豐度計(jì)算方面均存在差別,為保證臨床mNGS數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,必須對(duì)生物信息分析過(guò)程中每個(gè)數(shù)據(jù)處理步驟進(jìn)行評(píng)估分析,包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)和臨床樣本數(shù)據(jù)。微生物基因組的公共數(shù)據(jù)庫(kù)包括國(guó)家信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center for Information Biotechnology Information,NCBI)和華大基因數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)于目前臨床mNGS應(yīng)用來(lái)說(shuō),數(shù)據(jù)庫(kù)的綜合分析和整合更有利于數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,另外,需要對(duì)微生物測(cè)序讀數(shù)設(shè)定閾值以明確具有臨床意義的微生物。
mNGS對(duì)于感染性疾病的診治方面具有不可忽略的臨床應(yīng)用價(jià)值,隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,mNGS必將成為臨床病原體檢測(cè)的常規(guī)方法,為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療做出貢獻(xiàn)。