腸道菌群對腫瘤免疫治療的影響

鄭舒月，彭艷梅，張靜怡，崔慧娟

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院 腫瘤科，北京 102499；3.中日友好醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，北京 100029）

腫瘤免疫治療主要研究的是免疫檢查點抑制劑（immune checkpoints inhibitors，ICIs）的應(yīng) 用[1]，例如 針對細 胞毒性T 淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）和程序性細胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1，PD-1）的單克隆抗體[2，3]。前瞻性試驗和薈萃分析已經(jīng)證實了ICIs 與化療相比在患者中的療效和安全性[4，5]。值得注意的是，一旦ICIs 發(fā)揮作用，它們就更有可能長期具有抗癌功能，有些人甚至可以完全治愈[6]。然而ICIs 在應(yīng)用于患者機體治療時的異質(zhì)性卻很高[7]，能夠從免疫治療中取得顯著療效的患者群體，仍在探索中。人體腸道中有多種微生物，數(shù)目超過機體自身細胞的10 倍。近年研究表明，腸道菌群可以影響腫瘤的免疫治療結(jié)果[8，9]。臨床前的基礎(chǔ)研究提示，腸道微生物群可以通過與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用調(diào)節(jié)PD-1 抑制劑治療的反應(yīng)[10]。因此，腸道菌群目前被認為是一個可能預(yù)測腫瘤免疫治療效果的重要指標。

1 腸道菌群對免疫治療的影響

1.1 相關(guān)機制的基礎(chǔ)研究

2015年Sivan 等[11]注意到一些特殊共生細菌的豐富度與小鼠模型中PD-1 抑制劑的治療效果相關(guān)。他們比較了相似遺傳基因小鼠 （C57BL/6） 的在不同的腸道微生物群（JAX 和TAC） 中的PD-1 抑制劑治療效果， 結(jié)果表明在JAX 種群中腫瘤生長較慢，對PD-1 抑制劑治療更敏感。通過同居或移植JAX 糞懸液到TAC 小鼠體內(nèi)， 他們發(fā)現(xiàn)這種差異是由于JAX 增強了抗腫瘤的免疫能力。16S rRNA測序技術(shù)進一步研究表明，JAX 中的雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，進而導(dǎo)致腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）水平升高，最終使得PD-1 抑制劑治療的療效更好。Vétizou 等[12]發(fā)現(xiàn)一些特殊的腸道菌群補充劑可以增強CTLA-4 抑制劑的作用。他們同時注意到，廣譜抗生素的治療消除了CTLA-4 抑制劑的抗腫瘤作用，而且CTLA-4 抑制劑不能有效地抑制無菌小鼠的腫瘤進展， 這些都表明腸道菌群可能參與了CTLA-4 抑制劑的治療。為了證實這一結(jié)論，他們又在無菌小鼠或抗生素治療小鼠中移植了多形擬桿菌、脆弱擬桿菌或伯克霍爾德菌，最終解除了無菌小鼠對于CTLA-4 抑制劑的耐藥。

這些基礎(chǔ)研究表明腸道菌群中的部分種群可以提高PD-1 抑制劑和CTLA-4 抑制劑在腫瘤小鼠模型中的療效，甚至解除耐藥，值得在臨床中進一步探索研究。

1.2 臨床試驗進展

Gopalakrishnan 等[13]分析了接受PD-1 抑制劑治療的黑色素瘤患者的腸道微生物群。結(jié)果表明，應(yīng)答者的腸道微生物多樣性較高， 糞便樣本的α-多樣性與無進展生存率（progression-free survival，PFS）呈正相關(guān)。進一步細化分析表明，應(yīng)答者體內(nèi)的大腸桿菌水平較高，而非應(yīng)答者體內(nèi)的大腸埃希菌則顯著富集。Matson 等[14]也注意到腸道菌群對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者PD-1 抑制劑治療效果有影響。他們基于一種綜合的分析方法（包括16S rRNA 測序、亞基因組鳥槍測序和物種特異性定量聚合酶鏈反應(yīng)） 觀察到，一些細菌，如雙歧桿菌、長雙歧桿菌、嗜氣性柯林斯菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、乳酸桿菌屬、擬桿菌科和微小埃洛內(nèi)拉菌，在應(yīng)答者中顯著富集，而無應(yīng)答者中則有大量的卵形瘤胃球菌和腸道羅斯拜瑞氏菌。Routy 等[15]報道了腸道菌群在PD-1 抑制劑耐藥中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，對于接受PD-1 抑制劑治療的癌癥患者， 口服抗生素治療 （在PD-1 抑制劑治療開始的前2 個月或開始后的1 個月內(nèi)）會顯著縮短總生存率（overall survival，OS）和PFS。他們進一步比較了應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間腸道菌群組成上的差異，發(fā)現(xiàn)在應(yīng)答者所有過度表達的細菌中，嗜酸阿克曼菌與患者的應(yīng)答率最顯著相關(guān)（P=0.007）。Chaput 等[16]驗證了腸道菌群對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者CTLA-4 抑制劑治療的調(diào)節(jié)作用。在招募的患者中，基線測量腸道菌群中含有過多類桿菌的患者預(yù)后不良（P=0.034），而腸道菌群中糞桿菌較多的患者則有長期的獲益（P=0.0092）。此外，對存活時間超過18 個月的患者進行腸道菌群的分析發(fā)現(xiàn)， 它們含有大量的瘤胃球菌和漆球菌。聚類分析表明，腸道微生物群中含有糞桿菌或其他屬于厚壁菌門類的細菌的患者往往具有更好的臨床結(jié)果（PFS：P=0.039；OS：P=0.051）。

Jin 等[17]報道了接受Nivolumab 治療的非小細胞肺癌患者的數(shù)據(jù)， 通過16S rRNA 基因測序分析患者治療前后的糞便標本發(fā)現(xiàn)，腸道菌群多樣性較高的患者比多樣性較低的患者有較長的PFS。對Nivolumab 治療的應(yīng)答組和非應(yīng)答組的糞便組成差異性分析表明， 應(yīng)答組的Alistipes putredinis、長雙歧桿菌和Prevotella copri 等細菌明顯富集，而非應(yīng)答組的瘤胃球菌則較多。Elkrief 等[18]發(fā)現(xiàn)，在免疫治療前進行抗生素治療， 是導(dǎo)致PFS 縮短的獨立危險因素（HR=0.32，95%CI 0.13～0.83）。在免疫治療前接受抗生素治療的患者將會對免疫治療的有效反應(yīng)性降低（抗生素組與對照組的客觀反應(yīng)率分別為0%和34%），預(yù)后改善率下降 （抗生素組對比對照組的PFS=0.28，95%CI 0.10～0.76，P=0.01）。

這些研究所發(fā)現(xiàn)的有益腸道菌群的種群雖不完全相同，但可看出桿菌類的細菌，如雙歧桿菌、大腸桿菌等，往往能夠提高免疫治療的效果。而且大多研究提示在免疫治療的前期使用抗生素會降低免疫治療的效果。

2 腸道菌群

2.1 腸道菌群的組成和功能

腸道菌群中含有大量的微生物，如細菌、真菌、原生動物、病毒、噬菌體和古細菌等[19]。一般認為腸道菌群由必需菌和機會菌組成[20]。必需菌對人體有益，參與發(fā)酵未消化的碳水化合物和內(nèi)源性粘液，合成短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）和維生素，抵御病原體感染[21，22]。相反，機會性細菌的過度生長會導(dǎo)致感染[15]。必需細菌和機會性細菌之間的不平衡會導(dǎo)致腸道失調(diào)，這通常是指在環(huán)境或宿主相關(guān)因素的驅(qū)動下，微生物群的組成和功能的改變。

腸道的必需菌包括益生菌和共生菌，它們在腸道能夠形成有重要功能的菌膜。正常情況下，腸道菌群表層的主要成分是大腸埃希菌、腸球菌，中層主要是以類桿菌為主的厭氧菌，深層則主要是乳酸桿菌和雙歧桿菌。深層的菌群可以與腸黏膜上皮表面的特異性受體結(jié)合，形成可以抵御過路菌侵襲的生物屏障。雙歧桿菌等益生菌對機體的發(fā)育、代謝、合成維生素和微量元素、免疫激活、抵御致病菌、參與腸肝循環(huán)、保護機體健康等起到舉足輕重的作用[23]。

2.2 腸道菌群的測定方法

①分離培養(yǎng)，觀察菌落數(shù)：方萬紅[24]在分析四磨湯對患兒腸道菌群平衡和消化功能的影響時通過觀察菌落數(shù)，計算腸桿菌、葡萄球菌、乳酸桿菌、雙岐桿菌菌落數(shù)作為評定腸道菌群功能的方法。常規(guī)的基于分離培養(yǎng)、觀察菌落數(shù)的方法雖比較成熟，但是大多腸道菌群不能培養(yǎng)且比較耗時耗力。因此這種方法不能全面地分析種類和數(shù)量龐大的腸道微生物系統(tǒng)。②質(zhì)譜分析技術(shù)：可以在復(fù)雜體系中同時區(qū)分不同組分的特點，能夠快速、準確、高通量地鑒別不同的腸道菌群。③基因測序（16S rRNA 設(shè)計引物）：近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA 基因測序技術(shù)在細菌的鑒定與分類研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。Matson 等[15]在研究腸道菌群對轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者PD-1抑制劑治療的影響時采用了綜合的分析方法，其中就包括了16S rRNA 基因測序技術(shù)。Chaput 等[17]采用16S rRNA 基因測序來研究黑色素瘤患者的腸道菌群， 以預(yù)測ipilimumab 治療療效和結(jié)腸炎的發(fā)生率；Elkrief 等[18]在研究腸道菌群多樣性對中國非小細胞肺癌 （non-small-cell lung cancer，NSCLC） 患者免疫治療療效時也采用了16S rRNA基因測序來評估大便標本中的腸道菌群譜。16S rRNA 基因普遍存在于細菌細胞，在細菌基因組中位于核糖體小亞基（約1540bp），該區(qū)域兼顧保守性和高變性，含有10 個保守區(qū)域 （Conserved Regions） 和9 個高變區(qū)域（Variable Regions），保守區(qū)可用于設(shè)計引物進行目的片段的擴增，而通過對高變區(qū)的分析可以辨別細菌種類。因此，16S rRNA基因被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究和物種分類鑒 定[25，26]。

所以當粗略估測腸道菌群部分常見成分的數(shù)量變化多采用觀察菌落數(shù)的方法，而精準分析腸道菌群成分變化還是需要依賴16S rRNA 設(shè)計引物的高通量測序。

3 總結(jié)與討論

目前，免疫治療已逐漸成為腫瘤治療的主流?？鼓[瘤的免疫過程是用一個稱為“腫瘤免疫周期”的模型來描述的。首先由腫瘤源性的抗原啟動免疫反應(yīng)，之后抗原提呈細胞會捕獲和呈遞腫瘤抗原，接著在外周淋巴器官中的原始T 細胞就會被啟動和激活。然后，激活的T 細胞遷移、浸潤、殺死腫瘤細胞。所以抗腫瘤的免疫療法本質(zhì)上是通過機體自身的免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞[27]。

而腸道菌群可以調(diào)節(jié)多種免疫效應(yīng)物，尤其是樹突細胞（dendritic cell，DC）。DC 作為抗原提呈和T 細胞活化的核心，是免疫監(jiān)視和免疫清除的決定性因素。一些細菌如雙歧桿菌可以通過促進DC 成熟、 上調(diào)細胞因子分泌、以及促進腫瘤特異性T 細胞的活化來增強DC 的功能[24]。所以腸道菌群對宿主的免疫應(yīng)答有重要的影響，它們可以協(xié)同調(diào)節(jié)腫瘤免疫周期的多個步驟。目前認為在腫瘤的免疫治療中，調(diào)控腸道菌群可以誘導(dǎo)形成系統(tǒng)免疫，進而提高療效，克服耐藥性。同時部分臨床證據(jù)表明，免疫治療前后使用抗生素會降低免疫治療的效果。

當前對腸道菌群和腫瘤的免疫治療還存在一些問題：①各臨床試驗中發(fā)現(xiàn)的有益于免疫治療的腸道菌群并不完全相同；②腸道菌群在腫瘤免疫周期中的作用機制還有待進一步研究探討；③目前雖然已有不少臨床試驗研究腸道菌群對免疫治療的影響，但是樣本量較小，部分屬于回顧性研究，證據(jù)級別不高，需要更多前瞻性的研究；④使用抗生素是否影響免疫治療的效果仍存在爭議。所以，期待能夠開展更多的基礎(chǔ)和臨床研究來探索出有益的腸道菌群，選出免疫治療有效的患者群，進而通過菌群移植等方式提高免疫治療效果，使患者得到更長的生存期。