組織工程鼓膜的研究進(jìn)展

陸達(dá)鍇 張祥寶 康騁 汪際云 胡寶華

中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院耳鼻咽喉科（寧波315000）

鼓膜穿孔是臨床上常見疾病，中耳感染是造成穿孔的最主要原因，其次為外傷性，醫(yī)源性，這些損傷可導(dǎo)致聽力下降及耳道流膿反復(fù)感染[1]。根據(jù)穿孔的持續(xù)時間是否超過三個月可分為急性和慢性。急性期外傷性穿孔經(jīng)過合理治療后多可自愈，若穿孔長期不愈合，則可考慮行鼓室成形術(shù)以恢復(fù)鼓膜功能[2]。

鼓膜成形術(shù)是改善聽力及防止中耳感染的手術(shù)，雖然現(xiàn)在應(yīng)用傳統(tǒng)材料進(jìn)行鼓室成形術(shù)成功率也很高，但要做二次切口，且取材部位可能出現(xiàn)感染，變形等風(fēng)險，二次手術(shù)患者存在取材局限性，所以我們要尋找一種無需手術(shù)切口，安全性高且價格適中的新型材料。而組織工程通過構(gòu)建合適的支架，引入生長因子及細(xì)胞可合成新的鼓膜修補(bǔ)材料，或許可以幫助我們實現(xiàn)這一目標(biāo)。

1 傳統(tǒng)治療鼓膜穿孔的移植材料

從組織學(xué)來說，鼓膜穿孔是由于上皮層的生長超過纖維層的生長速度，越過纖維層與黏膜層相連，形成永久性穿孔，這就需要手術(shù)干預(yù)恢復(fù)鼓膜功能。目前臨床常用的材料主要有顳肌筋膜、脂肪組織、耳屏軟骨膜、耳屏軟骨、乳突鼓膜、靜脈[3-6]等，每種材料均取自于自體，有良好的生物相容性。

目前顳肌筋膜是最常用且療效較好的移植物，具有取材方便，柔韌性好的特點可以與鼓膜穿孔緣較好貼附，且厚度類似于鼓膜。然而，也有研究認(rèn)為在咽鼓管功能障礙，粘連性中耳炎，全部或次全穿孔的情況下，顳肌筋膜不如軟骨-軟骨膜[7]，應(yīng)用自體脂肪修補(bǔ)鼓膜也是近幾年常用的移植物之一，報道認(rèn)為應(yīng)用脂肪組織材料，對鼓膜小穿孔的修補(bǔ)成功率在76-100%之間[5]，且脂肪組織容易獲得，不良反應(yīng)低，成功率也與顳肌筋膜無異[8]。另外，脂肪移植物分泌血管生成和生長因子，促進(jìn)新生血管形成和組織修復(fù)，從而增加鼓膜穿孔周圍的血液供應(yīng)[9]。軟骨-軟骨膜復(fù)合物作為一種移植材料提倡在復(fù)雜的穿孔中使用，例如完全性、次全的穿孔、粘連性中耳炎、復(fù)發(fā)的穿孔以及咽鼓管功能障礙。

2 組織工程材料

近年來組織工程發(fā)展迅速，在組織工程鼓膜再生方面有巨大的潛力。組織工程材料一般包括支架材料、生物因子以及細(xì)胞。支架材料為細(xì)胞提供機(jī)械支撐，還維持細(xì)胞表型、提供細(xì)胞生長空間、促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)分泌，生長因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、表型穩(wěn)定和血管增生。因此可以通過建立合適的支撐支架，引入生長因子，以提高細(xì)胞對支架材料的黏附能力，形成用于修補(bǔ)鼓膜的組織工程材料[10，11]。

2.1 支架材料

鼓膜本身具有再生能力，但由于穿孔后上皮下沒有支撐架構(gòu)，且上皮組織生長快于纖維層，使上皮層與黏膜層相連，造成永久性穿孔。因此需要尋找一種支架或移植物作為支持，以促進(jìn)細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)向穿孔處遷移。組織工程正致力于大量新材料的研究，理想的支架應(yīng)具有一定的體內(nèi)可降解、良好的組織相容性、無細(xì)胞毒性和良好的機(jī)械性能，但還沒有一種符合所有這些標(biāo)準(zhǔn)的材料。目前研究的支架材料主要有脫細(xì)胞組織和聚合物。

脫細(xì)胞組織是在移植物或異種移植物完全去除細(xì)胞后獲得，它保留了天然組織的基本組織結(jié)構(gòu)和生化成分，且不會對異體組織移植所產(chǎn)生的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，亦不會誘發(fā)非特異性異物反應(yīng)[12]。移植后可作為上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞移行、新生血管形成的一個良好支架，具有良好生物和結(jié)構(gòu)相容性。Lee JM[13]和Min J[14]均比較人脫細(xì)胞真皮和軟骨膜作為移植物，對鼓室成形術(shù)的影響，認(rèn)為人脫細(xì)胞真皮可以有效替代軟骨膜，兩者具備的移植成功率和術(shù)后聽力檢測結(jié)果無明顯差異，且前者能明顯縮短手術(shù)時間。但由于脫細(xì)胞組織需要從尸體或其他物種中提取,當(dāng)中涉及的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)和生物安全問題對其應(yīng)用會有所限制[10]。

聚合物與上述支架相比具有許多優(yōu)點，它們的形狀，尺寸和多孔性可以根據(jù)要求可以更改。此外，它們具有生物相容性，生物降解性，易于合成和處理，可以大規(guī)模生產(chǎn)，并且可以控制它們的降解性和機(jī)械性能。目前研究的主要聚合物有明膠海綿[15]、乳膠賴氨酸聚合物、絲素蛋白、殼聚糖、海藻酸鈣、透明質(zhì)酸等。Huang P[16]應(yīng)用明膠海綿貼補(bǔ)法觀察了創(chuàng)傷性鼓膜穿孔的修復(fù)情況，認(rèn)為明膠海綿修補(bǔ)不僅起到上皮移植的支架作用，還促進(jìn)邊緣肉芽組織的水腫和增生，促進(jìn)血管生成，并加速鼓膜愈合。Jin ZH[17]等觀察了引入FGF-2用明膠海綿補(bǔ)貼法明顯縮短了鼓膜愈合時間。絲素蛋白也是一種有益鼓膜再生的材料，它是在去除家蠶絲抗原性成分絲膠蛋白后獲得的，具有彈性、可降解性和生物相容性好等諸多優(yōu)點。Levin B[18]置備了人鼓膜角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在絲素支架上，觀察其生長和粘附，結(jié)果認(rèn)為絲素蛋白可以支持粘附，增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化。殼聚糖是天然多糖甲殼質(zhì)的脫乙酰形式，其是具有抗細(xì)菌特性的粘多糖，具有無毒性、生物相容性好、可控的降解性和無免疫原性等優(yōu)點。湯勇[19]將膠原和殼聚糖互補(bǔ)制成膜后提高了生物學(xué)性能成為較理想的生物材料，改良了殼聚糖的吸附力，利于細(xì)胞的粘附生長、遷移和增值。也有研究認(rèn)為5%殼聚糖濃度的3D殼聚糖支架能使鼓膜細(xì)胞增殖，有合適的結(jié)構(gòu)特征和機(jī)械性能。在體內(nèi)動物研究中，鼓膜細(xì)胞能通過3D殼聚糖支架的孔隙和表面遷移，從而使鼓膜再生，3D殼聚糖支架技術(shù)可以在某些情況下用于代替鼓室成形術(shù)以愈合鼓膜穿孔[20]。海藻酸鈣是一種從海藻中提取的天然聚合物，可以支持黏膜和角化上皮的生長。Weber DE應(yīng)用海藻酸鈣貼補(bǔ)大鼠慢性鼓膜穿孔，得到較好的療效。但也有報道其潛在耳毒性風(fēng)險，因此需要進(jìn)一步的研究來長期評估人類安全性和有效性[21]。透明質(zhì)酸廣泛存在于機(jī)體的各種組織中，作為細(xì)胞間質(zhì)的主要成分之一，在一項已報道的動物研究中，透明質(zhì)酸刺激內(nèi)源性生長因子、表皮生長因子、胰島素生長因子、腫瘤壞死因子和血管內(nèi)皮生長因子[22]。在鼓膜愈合過程中起到纖維組織再生和調(diào)節(jié)作用，這些因素促進(jìn)了鼓膜愈合過程中的血運重建、細(xì)胞生長和分化。Alzahrani M[23]將脂肪移植物填入穿孔，再覆蓋透明質(zhì)酸膜，與穿孔緣相貼，成功率可達(dá)80%，透明質(zhì)酸脂肪移植物成形術(shù)（HAFGM）可能是傳統(tǒng)鼓膜成形術(shù)的替代治療方法。

2.2 生長因子

生長因子可刺激組織中的傷口愈合，這些生物分子及其受體在鼓膜的再生過程中表達(dá)，通過調(diào)控組織血管生成以及細(xì)胞增殖、遷移、上皮化幫助穿孔愈合。生長因子有五大類：表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF），成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast growth factor,FGF），血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor,PDGF），轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）和胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）。關(guān)于鼓膜再生組織工程，對EGF和FGF的研究較多，這些因子可以以滴劑的形式或浸泡在支架中施用。表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）刺激DNA、RNA、蛋白質(zhì)和透明質(zhì)酸的合成，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞的合成，表皮生長因子的表達(dá)與修復(fù)過程正相關(guān)，這種生長因子在鼓膜損傷后自然表達(dá)，局部使用EGF在急性和慢性穿孔的動物模型中取得了良好的效果[24]。Seonwoo H[25]構(gòu)建了表皮生長因子-殼聚糖片支架，殼聚糖有較好的生物相容性、機(jī)械性能、細(xì)胞黏附力、抗菌作用，EGF可以促進(jìn)鼓膜殘緣的上皮向中心生長遷移，提高鼓膜穿孔的愈合率，適用于鼓膜慢性穿孔。

成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast growth factor,FGF）家族中最受關(guān)注的是重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF），并證實bFGF是一種多肽類的細(xì)胞活素，能刺激和調(diào)節(jié)多種起源于中胚層、外胚層的細(xì)胞分化增殖，以修復(fù)鼓膜。Acharya AN[26]應(yīng)用bFGF修復(fù)了小兒患者的慢性鼓膜穿孔，也取得了成功，認(rèn)為或許可以微創(chuàng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的鼓膜成形術(shù)。但是局部應(yīng)用FGF能否引發(fā)膽脂瘤還存在爭議，一些研究表明FGF-2可能在鼓膜上皮誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，膽脂瘤可通過固有層增生的結(jié)締組織由表皮向內(nèi)生長形成，Hakuba等[27]報道了FGF用于治療慢性鼓膜穿孔時膽脂瘤的發(fā)生率為5%。

血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor,PDGF）由血小板α顆粒、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌。它對成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞有強(qiáng)的化學(xué)吸引作用和促有絲分裂作用。有研究PDGF應(yīng)用在大鼠鼓膜穿孔中，可以增加鼓膜愈合率，縮短穿孔閉合時間，具有更豐富的結(jié)締組織纖維組織層，而應(yīng)用在人體并沒有提高鼓膜愈合率。

自體血清含有多種生長因子、維生素和免疫球蛋白，能夠調(diào)節(jié)各種組織的增殖，促進(jìn)傷口愈合,自體血清耳滴療法在人慢性穿孔中是有效的，或許可以代替手術(shù)治療。此外，還進(jìn)行了對人臍帶血清的研究，人臍帶血清存在能夠促進(jìn)組織再生的因子，如EGF，F(xiàn)GF，PDGF，神經(jīng)生長因子（NGF），維生素A，纖維連接蛋白，抗蛋白酶和P物質(zhì)，臍帶血清的NGF，EGF和TGF-β濃度比外周血清更高，因此它可能對鼓膜修復(fù)更有效[28]。

2.3 種子細(xì)胞

支架材料、生物分子和種子細(xì)胞相互作用以實現(xiàn)鼓膜再生。因為鼓膜有來自穿孔邊緣的內(nèi)源性細(xì)胞，所以大多數(shù)研究不需要使用種子細(xì)胞，只應(yīng)用支架材料和生長因子促進(jìn)鼓膜細(xì)胞增殖。細(xì)胞可以通過注射或整合應(yīng)用到支架材料中，盡管理論上有多種細(xì)胞來源可用于鼓膜再生，但迄今為止只有少數(shù)動物研究得以實現(xiàn)。胚胎干細(xì)胞可以根據(jù)環(huán)境給與的信號分化成相應(yīng)的細(xì)胞，Von Unge[29]使用來自小鼠的胚胎干細(xì)胞，使其成功分化成鼓膜成纖維細(xì)胞修復(fù)鼓膜。脂肪干細(xì)胞（ASC)日益成為是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有前景的種子細(xì)胞,與其他干細(xì)胞相比，ASC具有來源豐富、取材容易、損傷小、生物學(xué)性能穩(wěn)定等獨特的優(yōu)勢,雷蕙嘉[30]觀察大鼠脂肪干細(xì)胞在聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架上的生長狀態(tài)、分裂增殖能力及黏附性,大鼠ASC與PLGA有較好的黏附性，可以在PLGA上正常黏附、增殖。然而，干細(xì)胞的應(yīng)用可能潛在感染，致畸和腫瘤形成風(fēng)險，也涉及道德和法律問題，因此在該領(lǐng)域的研究很少。另外有研究發(fā)現(xiàn)，鼓膜干細(xì)胞存在于鼓環(huán)及錘骨柄區(qū)域，這表明鼓膜本身有存在再生干細(xì)胞可能性。因此，如果殘余鼓膜有其自身干細(xì)胞時，它就無需結(jié)合外部細(xì)胞以實現(xiàn)鼓膜修復(fù)。

3 小結(jié)

目前臨床上應(yīng)用最多的仍是自體材料做為鼓膜穿孔移植物，然而大部分支架材料具有良好的相容性及機(jī)械性能，能支持細(xì)胞黏附，在鼓膜穿孔的修復(fù)的研究中均取得了較好的療效，因此，新型支架材料在未來可能代替自體材料。目前需要研究來改善生物材料，以再現(xiàn)與鼓膜類似的生物力學(xué)和振動特性，以及探索如何提高材料制作工藝，降低成本，推廣到臨床使用。生長因子可改善鼓膜穿孔的愈合，然而，在關(guān)于釋放載體，生長因子類型，劑量和治療持續(xù)時間存在爭議。一些研究表明，在穿孔完全閉合之前，應(yīng)持續(xù)使用這些生長因子，而另一些研究表明，單次使用就足以實現(xiàn)鼓膜愈合。生長因子可促進(jìn)表皮和結(jié)締組織的增殖，有報道使用生長因子可造成上皮珍珠和膽脂瘤形成，因此需要長期研究來評估其臨床應(yīng)用的療效和安全性。目前對種子細(xì)胞的研究是最缺乏的，研究均是動物實驗，盡管干細(xì)胞的應(yīng)用獲得了與鼓膜類似的新膜結(jié)構(gòu)，但由于可能出現(xiàn)的副作用、高成本以及倫理和法律問題，其臨床應(yīng)用受到限制。且殘余鼓膜有其自身干細(xì)胞，也沒必要應(yīng)用其他細(xì)胞。盡管目前組織工程材料的研究仍有不足，但隨著組織工程學(xué)科的發(fā)展，將會成為一門具有巨大潛力的學(xué)科，在未來可制作出合適的生物材料代替手術(shù)治療以修補(bǔ)鼓膜，且產(chǎn)生一定的商業(yè)價值。