細(xì)胞增殖在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

李文文 馬秀嵐

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科

中耳膽脂瘤是一種良性鱗狀上皮角質(zhì)化增生性病變[1]，由鱗狀層狀角質(zhì)化上皮細(xì)胞組成，它表現(xiàn)為一種含有成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞的表皮樣囊腫[2]，由囊內(nèi)容物、基質(zhì)、基質(zhì)外層三部分構(gòu)成，囊內(nèi)容物是由完全分化的無(wú)核的角化上皮組成；基質(zhì)包括形成囊壁結(jié)構(gòu)的角化的鱗狀上皮；基質(zhì)外層或固有層是膽脂瘤外周部分，由肉芽組織組成，可能包含膽固醇結(jié)晶，肉芽組織可產(chǎn)生蛋白水解酶。中耳膽脂瘤具有過(guò)度增殖能力，炎癥可能是角質(zhì)化細(xì)胞過(guò)度增殖的原因之一[3,4],伴隨的是角蛋白碎片的積累和顳骨及其周圍骨結(jié)構(gòu)的破壞[5]。膽脂瘤除導(dǎo)致聽力損傷和耳流膿外還可以導(dǎo)致多種顱內(nèi)外并發(fā)癥，如迷路炎、面癱、乙狀竇血栓性靜脈炎、腦膜炎、腦膿腫等[6,7]，重者可能危及生命。膽脂瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響因素很多[7]，至今未明確。一直以來(lái)對(duì)中耳膽脂瘤機(jī)制的研究主要集中在細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡等幾個(gè)方面，中耳膽脂瘤的特點(diǎn)是細(xì)胞過(guò)度增殖，但是不像腫瘤細(xì)胞那樣增殖的不受控制，而是在眾多的基因、蛋白、生長(zhǎng)因子等調(diào)控下與細(xì)胞凋亡相互作用，阻止了細(xì)胞無(wú)限增殖。如今關(guān)于細(xì)胞增殖在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注。本文對(duì)細(xì)胞增殖在中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行綜述。

1 Ki-67與細(xì)胞增殖

Ki-67核抗原是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，表達(dá)于細(xì)胞周期的所有活性階段(G1、S、G2、M)，而不表達(dá)于細(xì)胞周期的非活性階段(G0)。Ki-67負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體的耦合、穩(wěn)定以及核蛋白對(duì)稱分布的保護(hù)與調(diào)控[8]。根據(jù)Ki-67在細(xì)胞核、核仁或核漿的不同位置，其被分為粒狀、彌漫性或混合性細(xì)胞型。Ki-67具有特異性的免疫反應(yīng)，可在獲得性膽脂瘤基底和基底上層檢測(cè)到，而Ki-67僅出現(xiàn)在正常皮膚上皮的基底層。Erdoglija[9]等應(yīng)用免疫組化法對(duì)50例膽脂瘤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Ki-67在膽脂瘤中的表達(dá)高于外耳道皮膚和耳后區(qū)皮膚。增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量增多，在基底和基底上層均可檢測(cè)到。角化細(xì)胞標(biāo)志物Ki-67在細(xì)胞周期的所有活性階段均有表達(dá)。膽脂瘤的高增殖能力與其侵襲模式相關(guān)。Mahmood[10]等在研究中發(fā)現(xiàn)Ki-67在膽脂瘤組織中過(guò)表達(dá)，與骨吸收活性呈正相關(guān)。Ki-67可以預(yù)測(cè)膽脂瘤的侵襲性。

2 KGF/KGFR與細(xì)胞增殖

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族的獨(dú)特成員，主要由基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞分泌，KGF與其受體(KGFR)結(jié)合導(dǎo)致KGFR形成二聚體，激活細(xì)胞內(nèi)激酶域，從而使KGFR磷酸化。通過(guò)受體KGFR作用于皮膚中的上皮細(xì)胞，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，遷移等生命活動(dòng)中起重要作用。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體底物2(FRS2)被KGFR磷酸化，進(jìn)而形成蛋白復(fù)合體，而后激活Ras/Raf/MAPK通路和PI3K/Akt通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和存活[11,12]。Xie[13]等在研究中發(fā)現(xiàn)KGF/KGFR膽脂瘤中的表達(dá)與復(fù)發(fā)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，提示KGF/KGFR信號(hào)通路可能參與了膽脂瘤上皮細(xì)胞高增殖活性和膽脂瘤復(fù)發(fā)。Yamamoto-Fukuda[14]等研究發(fā)現(xiàn)KGF過(guò)表達(dá)可能增加干細(xì)胞/祖細(xì)胞增殖，阻斷終末分化，導(dǎo)致上皮增生，這是中耳膽脂瘤的典型表現(xiàn)。Harabagiu[15]等在研究中發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮細(xì)胞的異常行為似乎是由KGF和KGFR的旁分泌相互作用所致。KGF和KGFR的膽脂瘤在膽脂瘤中表達(dá)增高，這與其侵襲性有關(guān)。結(jié)果提示，過(guò)量的KGF和KGFR合成可能導(dǎo)致膽脂瘤的高增殖狀態(tài)，可以解釋膽脂瘤與慢性化膿性中耳炎的病理差異。

3 microRNA與細(xì)胞增殖

microRNA是mRNA轉(zhuǎn)錄后控制基因表達(dá)水平的重要因素。各種生物過(guò)程，例如生長(zhǎng)和分化，都受到microRNA的調(diào)控。microRNA已被證明在聽力損失的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。目前，microRNA被認(rèn)為是參與不同生理、生物和病理過(guò)程的關(guān)鍵因素，如基因表達(dá)、進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽力損失、年齡相關(guān)性聽力損失、噪聲性聽力損失、膽脂瘤、神經(jīng)鞘瘤、內(nèi)耳炎癥等。Zhang[16]等收集23例中耳膽脂瘤，提取培養(yǎng)中耳膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞，研究中發(fā)現(xiàn)miRNA Let-7a通過(guò)兩種不同的機(jī)制抑制膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞的生長(zhǎng):在G0/G1期促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miRNAlet-7a除了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)外，還抑制膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和侵襲。miRNAlet-7a可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21及其靶點(diǎn)來(lái)控制細(xì)胞增殖和凋亡。研究顯示miRNAlet-7a下調(diào)miR-21的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-21可負(fù)性調(diào)控其靶基因PTEN和PDCD4的表達(dá)，促進(jìn)膽脂瘤的增殖和入侵角質(zhì)細(xì)胞。Zang[17]等研究發(fā)現(xiàn)miR-203a在膽脂瘤中下調(diào)，同時(shí)Bmi1上調(diào)，Bmi1是miR-203a的直接靶基因。沉默miR-203a可增加Bmi1表達(dá);促進(jìn)HaCaT細(xì)胞的增殖、集落形成和遷移;和抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示miR-203a可能通過(guò)靶向Bmi1調(diào)控膽脂瘤的生長(zhǎng)和增殖。這些發(fā)現(xiàn)為膽脂瘤的非手術(shù)治療提供了新的選擇。

4 中耳負(fù)壓與細(xì)胞增殖

中耳有兩個(gè)壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng):咽鼓管和中耳粘膜的氣體交換。咽鼓管或者中耳粘膜任何一個(gè)的功能障礙均可導(dǎo)致中耳持續(xù)負(fù)壓。中耳負(fù)壓可能是中耳慢性疾病發(fā)展的重要致病因素之一，如鼓膜萎縮、持續(xù)性中耳積液、粘連性中耳炎、中耳膽脂瘤等。特別是單純慢性咽鼓管阻塞所致中耳較高的負(fù)壓，被認(rèn)為與內(nèi)陷袋性膽脂瘤的病因及術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Friedmann[18]討論了外耳道鱗狀上皮細(xì)胞(EAC)可能遷移到中耳形成膽脂瘤。機(jī)械力是細(xì)胞骨架和分子重組中的重要因素[19,20]。有趣的是，在肺上皮細(xì)胞中，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到機(jī)械變形會(huì)影響上皮細(xì)胞的周轉(zhuǎn)和細(xì)胞骨架的重塑[19]。Naotaro[21]等在在大鼠中耳形成負(fù)壓模型，研究中發(fā)現(xiàn)中耳持續(xù)負(fù)壓可能會(huì)加速鼓膜上皮細(xì)胞的增殖和分化，負(fù)壓下全耳鼓膜松弛部收縮。組織學(xué)分析顯示鼓膜松弛部上皮增厚。該區(qū)域細(xì)胞角蛋白5（ck-5）陽(yáng)性細(xì)胞和細(xì)胞角蛋白10（ck-10）陽(yáng)性細(xì)胞層厚度增加。結(jié)果顯示中耳持續(xù)負(fù)壓可使鼓膜松弛部上皮增厚，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和分化。

5 EGFR/AKT/NF KappaB/cyclinD1與細(xì)胞增殖

表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)在表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的正常增殖中發(fā)揮著重要的生理作用。然而，在許多涉及異常增殖的病理?xiàng)l件下，EGF的表達(dá)水平被上調(diào)。EGF調(diào)節(jié)膽脂瘤的增殖可能通過(guò)兩條途徑，一是通過(guò)旁分泌調(diào)節(jié)膽脂瘤上皮下的炎癥細(xì)胞，二是通過(guò)自分泌調(diào)節(jié)膽脂瘤上皮的角化細(xì)胞。EGF受體(EGFR)是ErbB家族的酪氨酸激酶受體，是一種170 kDa的糖蛋白，由細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域[21]組成。EGF與EGFR結(jié)合形成二聚體，隨后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域磷酸化而活化，從而啟動(dòng)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號(hào)通路[22]。Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在腦、心、肺、皮膚等多種人體組織的細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的正常調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。據(jù)推測(cè)，在正常的細(xì)胞周期中，Akt的調(diào)節(jié)得到了很好的控制。相反，在增生性疾病中，很可能存在調(diào)節(jié)失調(diào)，磷酸化Akt可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF kappaB和下調(diào)cyclinD1從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[23]，EGF、TGF-α和AR，是重要的生長(zhǎng)因子，對(duì)表皮正常的增殖細(xì)胞,成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞等起重要作用。這些配體結(jié)合,通過(guò)自身磷酸化激活表皮生長(zhǎng)因子受體,從而激活細(xì)胞內(nèi)激酶級(jí)聯(lián)的PI3K/Akt/NF-κB cyclinD1途徑[22]，Liu[24]等在研究中發(fā)現(xiàn)p-EGFR、p-Akt、NF kappaB、cyclinD1分別在膽脂瘤中的表達(dá)高于外耳道皮膚，斯皮爾曼相關(guān)分析顯示p-EGFR和p-Akt為正相關(guān)，p-Akt和NF kappaB為正相關(guān)，NF kappaB和cyclinD1為正相關(guān)，結(jié)果顯示EGFR/AKT/NF KappaB/cyclinD1可能參與了膽脂瘤上皮細(xì)胞增生機(jī)制。此研究結(jié)果與王曉麗[25]研究結(jié)果一致。

6 KRT基因與細(xì)胞增殖

KRT（細(xì)胞角蛋白基因）是存在于上皮起源細(xì)胞中的IF超家族成員，通常以高度調(diào)控、組織特異性、細(xì)胞周期階段和分化依賴性的方式表達(dá)。因此，細(xì)胞角蛋白常作為上皮細(xì)胞遷移、分化和增殖狀態(tài)的標(biāo)志物。角蛋白和其他蛋白質(zhì)之間的相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。在惡性上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了幾種不同表達(dá)的細(xì)胞角蛋白，其特異性表達(dá)模式往往與某些腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，如乳腺癌和口腔腫瘤[26]。KRT1與KRT10在表皮基底上共表達(dá)，KRT1/KRT10復(fù)合物表達(dá)升高，提示角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化增加。KRT19特異性表達(dá)于發(fā)育中的表皮的外周。雖然KRT19是腫瘤細(xì)胞檢測(cè)最常用的標(biāo)記物之一，但最近的研究結(jié)果表明，KRT19是一種潛在的腫瘤抑制因子。它通過(guò)調(diào)節(jié)Egr1核定位負(fù)調(diào)控Akt信號(hào)。下來(lái)調(diào)節(jié)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的核易位β-catenin從而調(diào)制NUMB-dependent NOTCH信號(hào)通路[27]。膽脂瘤高增殖表型的背景下存在大量的細(xì)胞角蛋白[28]。Enik? Palkó[29]等對(duì)獲得性膽脂瘤26例進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，KRT1和KRT10基因雖然位于不同的染色體上但是在角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化過(guò)程中他們協(xié)同表達(dá)，IF形成時(shí)他們的蛋白產(chǎn)物形成功能二聚體。結(jié)果顯示KRT1和KRT10的表達(dá)模式相同，兒童病例中KRT1和KRT10的表達(dá)高于成人，尤其是在兒童復(fù)發(fā)樣本中。KRT19的表達(dá)水平與KRT1/KRT10的表達(dá)水平成反比，在兒童和成人侵襲性較強(qiáng)的復(fù)發(fā)病例中表達(dá)水平均較低。

7 未來(lái)與展望

膽脂瘤發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今對(duì)其的探究從未止步，其治療方法單一，臨床上主要依靠手術(shù)治療，但是并不能防止其復(fù)發(fā)，據(jù)報(bào)道5年的膽脂瘤殘留率和復(fù)發(fā)率分別為20.6%和5.1%[30]。對(duì)于膽脂瘤的研究最終的目的是希望能達(dá)到預(yù)防，治療，防止復(fù)發(fā)等一系列從根本上解決膽脂瘤對(duì)患者帶來(lái)的痛苦的措施。既往研究表明，5-FU乳膏局部應(yīng)用2-5次，間隔2周，經(jīng)KGF信號(hào)通路可明顯降低膽脂瘤角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性[31]。與對(duì)照組相比，5-FU組Ki-67標(biāo)記指數(shù)明顯降低(5-FU組為37.5±0.2%，對(duì)照組為49.5±0.2%)，提示對(duì)早期膽脂瘤有良好的藥物治療前景。EGFR抑制劑AG1478完全抑制了表皮生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，表皮生長(zhǎng)激素中和抗體和siRNA-表皮生長(zhǎng)激素可顯著降低角質(zhì)形成細(xì)胞與膽脂瘤成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的集落形成效率[32]，推測(cè)抗表皮生長(zhǎng)激素有希望對(duì)膽脂瘤起治療作用。探索分子信號(hào)通路有助于拓寬治療選擇的范圍，開發(fā)非侵入性治療方法，確定抑制上皮細(xì)胞過(guò)度增殖的某些關(guān)鍵靶向分子，以防止獲得性膽脂瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)[33,34]。種種研究表明，有望從細(xì)胞增殖的角度出發(fā)，針對(duì)于有關(guān)細(xì)胞增殖的信號(hào)通路、蛋白、基因等各方面對(duì)膽脂瘤進(jìn)行非侵入性治療。