血清SHBG與SAA4聯(lián)合檢測對涂陰肺結(jié)核輔助診斷的價值

黃琪淋，溫 莎，葉紹燕，萬逢潔，何 敏,

(1. 廣西壯族自治區(qū)龍?zhí)夺t(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，廣西 柳州 545005； 2. 廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，廣西 南寧 530021； 3. 柳州市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與學(xué)校衛(wèi)生防治所，廣西 柳州 545007； 4. 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染肺部形成的一種慢性傳染病，其中涂陰肺結(jié)核約占肺結(jié)核患者總數(shù)的一半[1]。涂陰肺結(jié)核患者早期不易被及時發(fā)現(xiàn)，易漏診、誤診。然而，結(jié)核病的延遲診斷可能會增加疾病的嚴重程度和病死率，并加大傳播風(fēng)險。在一項橫斷面調(diào)查[2]中發(fā)現(xiàn)，涂陰肺結(jié)核導(dǎo)致結(jié)核患者延遲治療風(fēng)險比為2.3倍。在撒哈拉以南非洲地區(qū)的一項研究[3]中，涂陰肺結(jié)核患者對該地區(qū)的結(jié)核病控制項目構(gòu)成了巨大的負擔(dān)，其中三分之一的涂片陰性結(jié)核病患者在初診后一年內(nèi)死亡，三分之一患者可能發(fā)生復(fù)發(fā)性肺結(jié)核。因此，尋求一種靈敏度高、特異度強的涂陰肺結(jié)核血清標志物是結(jié)核病研究關(guān)注的熱點。近年來，血清蛋白組學(xué)技術(shù)為結(jié)核病的輔助診斷提供了契機[4]。本課題組前期血清蛋白組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)及血清淀粉樣蛋白4(serum amyloid A4，SAA4)在血清中的差異表達，并且目前在國內(nèi)外研究中除本課題組外尚未見有關(guān)血清SHBG及SAA4輔助診斷涂陰肺結(jié)核的相關(guān)報道，因此，本研究通過檢測涂陰肺結(jié)核血清潛在標志物，即SHBG及SAA4在血清中的表達水平，并應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線進一步評估兩項指標的輔助診斷效能，為涂陰肺結(jié)核的輔助診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集2017年3—5月廣西柳州市龍?zhí)夺t(yī)院收治的88例涂陰肺結(jié)核患者的血清標本，參照中華醫(yī)學(xué)會制定的《臨床診療指南結(jié)核病分冊》[5]進行涂陰肺結(jié)核患者的診斷，排除合并腫瘤、嚴重器質(zhì)性病變、免疫功能低下的肺結(jié)核患者。同一時期采集56例廣西柳州市本地區(qū)的健康體檢人員的血清標本作為健康對照組，排除結(jié)核、肺炎、塵肺、腫瘤及其他嚴重肺部疾病患者。

1.2 血清SHBG、SAA4蛋白含量檢測 采集研究對象空腹時外周靜脈血3 mL，4℃靜置2 h，3 000 r/min離心5 min，取上層血清：(1)血清稀釋100倍后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法(試劑盒購于R&D Systems公司)檢測兩組血清SHBG蛋白含量；(2)血清稀釋10倍后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法(試劑盒購于LifeSpan BioSciences公司)檢測兩組血清SAA4蛋白含量。檢測過程均嚴格參照試劑盒說明書進行操作。

1.3 近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測方法分析

1.3.1 檢索策略 檢索三大中文數(shù)據(jù)庫：萬方數(shù)據(jù)庫、中國知識基礎(chǔ)設(shè)施工程(中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫)、維普數(shù)據(jù)庫于2016年1月1日至今發(fā)表的中文文獻，按照下述條件進行檢索：(涂陰肺結(jié)核 OR 菌陰肺結(jié)核)AND(靈敏度 OR 敏感度 OR 特異度)AND(T-SPOT OR ELISPOT OR 酶聯(lián)免疫斑點技術(shù) OR γ-干擾素釋放試驗)。

1.3.2 文獻納入與排除標準 納入標準：(1)患者明確診斷為涂陰肺結(jié)核或菌陰肺結(jié)核；(2)應(yīng)用T-SPOT.TB檢測方法；(3)數(shù)據(jù)能直接提取四格表數(shù)據(jù)或經(jīng)計算得出四格表數(shù)據(jù)；(4)病例及對照樣本數(shù)均>40例；(5)文獻為中文期刊發(fā)表論文。排除標準：(1)無法提取四格表數(shù)據(jù)；(2)綜述或Meta類文獻；(3)數(shù)據(jù)有限的摘要文獻；(4)重復(fù)文獻。

1.4 涂陰肺結(jié)核血清學(xué)指標診斷效能評價標準 根據(jù)比較靈敏度、特異度、曲線下面積(area under curve，AUC)、約登指數(shù)指標來評估各項研究中T-SPOT.TB檢測方法的涂陰肺結(jié)核診斷效能。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25～P75)]表示，組間比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗。繪制ROC曲線，并計算曲線下面積、靈敏度、特異度、約登指數(shù)。應(yīng)用MedCalc 16.2軟件進行Z檢驗，比較ROC曲線AUC的差異，進而評價單一與聯(lián)合指標診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能。采用卡方檢驗分別進行涂陰肺結(jié)核SHBG與SAA4兩者聯(lián)合診斷試驗與近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測方法的靈敏度和特異度比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 88例涂陰肺結(jié)核患者中男性51例，女性37例，平均年齡(49.49±16.13)歲；56例健康體檢人員中男性36例，女性20例，平均年齡(46.80±9.88)歲。兩組間年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，資料具有可比性。

2.2 血清SHBG與SAA4蛋白表達水平 ELISA法檢測結(jié)果顯示：涂陰肺結(jié)核組血清SHBG與SAA4蛋白濃度分別為52.32(24.58～81.19)nmol/L、56.71(41.87～77.57)ng/mL，健康對照組SHBG與SAA4蛋白濃度分別為25.97(16.60～36.45)nmol/L、35.79(29.81～41.07)ng/mL。涂陰肺結(jié)核組血清SHBG與SAA4蛋白表達水平高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。見圖1。

圖1 血清SHBG、SAA4蛋白的表達水平

2.3 SHBG、SAA4單一及聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的ROC曲線 對88例涂陰肺結(jié)核患者及56例健康對照組血清SHBG、SAA4蛋白的檢測結(jié)果繪制ROC曲線，結(jié)果表明兩指標聯(lián)合診斷時曲線下面積AUC為0.906(95%CI:0.857～0.955)(P<0.001)。見表1、圖2。應(yīng)用Z檢驗比較ROC曲線的結(jié)果如下：SHBG、SAA4兩者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的效能明顯優(yōu)于單一指標的診斷效能(P<0.001)，而比較SHBG、SAA4單項診斷涂陰肺結(jié)核時，兩蛋白指標的單獨診斷效能差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 SHBG與SAA4聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能

圖2 SHBG、SAA4單一及聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核的ROC曲線

Figure2ROC curves of single and combined detection of SHBG, SAA4 for SNPT

2.4 近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測方法分析 共檢索到102篇相關(guān)文獻，其中萬方數(shù)據(jù)庫79篇、中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫20篇、維普數(shù)據(jù)庫3篇，按照納入及排除標準，最終納入12篇中文文獻，排除90例，其中64篇無法提取四格表數(shù)據(jù)，11篇樣本例數(shù)少于40，3篇為綜述或Meta類文獻，10篇為重復(fù)文獻，2篇為非T-SPOT.TB檢測方法。從近三年已報道涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測方法的診斷效能來看，表2顯示各研究中的T-SPOT檢測技術(shù)在診斷肺結(jié)核時其診斷效能結(jié)果不一致，本研究的聯(lián)合診斷特異度不比T-SPOT.TB檢測方法差，在靈敏度上T-SPOT.TB檢測技術(shù)除兩項研究比本研究的聯(lián)合診斷靈敏度高外，其他均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，且本研究聯(lián)合診斷的約登指數(shù)為0.752，與這12項研究相比具備較好的準確性，可見SHBG與SAA4兩者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核具有比較優(yōu)勢。

3 討論

在結(jié)核病的流行過程中，相對于涂陽肺結(jié)核患者，涂陰肺結(jié)核患者的結(jié)核傳播率約為22%[18]，且肺結(jié)核病例中約有一半的涂片呈陰性[1]，意味著結(jié)核病的整體負擔(dān)嚴重，將加大結(jié)核病的防控難度。因此，快速準確地診斷涂陰肺結(jié)核病對于促進疾病早期治療的開始，改善患者的預(yù)后和減少結(jié)核病傳播至關(guān)重要。近年來血清學(xué)檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床疾病工作中，有研究[19]表明該項技術(shù)有助于結(jié)核病的輔助診斷，且血清學(xué)檢測對于痰量達不到標準的患者(如兒童、HIV/AIDS患者)和肺外結(jié)核患者具有一定的優(yōu)勢。因此，迫切需要尋找一種應(yīng)用多項血清學(xué)指標聯(lián)合診斷結(jié)核病的方法。

表2納入12篇文獻中近三年涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT檢測技術(shù)比較

Table2Comparison of T-SPOT detection technique of SNPT in 12 literatures in recent three years

第一作者病例組(例)對照組(例)靈敏度特異度約登指數(shù)李振生[6]170640.971* 0.652# 0.623郝興亮[7]66400.864 0.900 0.764何 莉[8]1947440.866 0.808 0.674任甜甜[9]168810.792 0.630# 0.421嚴松盛[10]1021000.794 0.640# 0.434楊映暉[11]491150.714 0.826 0.540彭 寧[12]135790.822 0.924 0.746周前選[13]185640.778 0.688# 0.466李愛英[14]1561440.955* 0.896 0.851蔡向敬[15]1142030.856 0.714# 0.570何梅芳[16]93400.849 0.900 0.749王甲甲[17]77890.8960.764#0.660

*：與SHBG+SAA4聯(lián)合診斷靈敏度相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；#：與SHBG+SAA4聯(lián)合診斷特異度相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

本課題組在前期研究中利用血清蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出了肺結(jié)核患者血清差異表達蛋白SHBG與SAA4，在此基礎(chǔ)上，本研究進一步鑒定了SHBG、SAA4蛋白在涂陰肺結(jié)核患者血清中均高表達，預(yù)示著該蛋白可能作為涂陰肺結(jié)核患者診斷血清學(xué)候選標志物。因此，本研究運用ROC曲線進一步評價這兩種蛋白對涂陰肺結(jié)核的輔助診斷價值。在評估SHBG與SAA4蛋白單獨及聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核時，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷效能明顯高于單個蛋白指標的診斷效能，其中聯(lián)合診斷的ROC曲線下面積可達0.906(95%CI:0.857～0.955)，且靈敏度為84.1%，特異度可達91.1%。近年來，新的檢測技術(shù)γ-干擾素釋放試驗已經(jīng)被引入到肺結(jié)核臨床診斷中且表現(xiàn)出較高的診斷價值，我國主要使用結(jié)核感染T-SPOT.TB試劑盒，該試驗主要通過測定由結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激效應(yīng)T細胞產(chǎn)生的γ-干擾素來判斷被檢者有無結(jié)核病或是否存在結(jié)核感染。與近三年的涂(菌)陰肺結(jié)核的T-SPOT.TB檢測方法比較，本研究的聯(lián)合診斷的特異度不比T-SPOT.TB檢測技術(shù)差，在靈敏度上T-SPOT.TB檢測技術(shù)除兩項研究比本研究的聯(lián)合診斷靈敏度高外，其他均無統(tǒng)計學(xué)意義，且本研究的約登指數(shù)0.752與納入的這12項研究的約登指數(shù)相比，具備較好的準確性，表明該聯(lián)合診斷試驗的真實性好，能較好地發(fā)現(xiàn)真正的涂陰肺結(jié)核患者，可見SHBG與SAA4兩者聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核具有比較優(yōu)勢。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合檢測SHBG、SAA4蛋白為涂陰肺結(jié)核患者提供了良好的輔助診斷價值。同時還發(fā)現(xiàn)雖然本研究與周穎等[20]研究中應(yīng)用的SHBG蛋白檢測試劑盒均來自R&D公司，但兩項研究中SHBG單一指標診斷涂陰肺結(jié)核的診斷效能存在差異，除了樣本的差異外，可能還與兩項研究購買的科研試劑盒由于批次不同而存在檢測結(jié)果不穩(wěn)定的因素有關(guān)，可見，檢測試劑盒向臨床應(yīng)用推廣需實行標準化生產(chǎn)管理，以達到臨床指標穩(wěn)定檢測的效果。

目前對于兩種蛋白引起肺結(jié)核患者體內(nèi)差異表達的作用機制尚不清楚。結(jié)核病被稱為消瘦性疾病，結(jié)核患者脂聯(lián)素水平增高[21]，脂聯(lián)素可以通過肝脂質(zhì)含量的變化水平上調(diào)肝細胞核因子-4A，最終促進肺結(jié)核患者體內(nèi)SHBG的表達增加[22]。SAA4是一種組成型蛋白，屬于SAA蛋白家族，可作為對損傷或炎癥本身的反應(yīng)產(chǎn)物，SAA4蛋白被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌及卵巢癌中表達增加[23-24]，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展；同時De等[4]通過SOMAscan蛋白質(zhì)組學(xué)平臺對來自于7個結(jié)核病流行國家的血清標本進行了深入分析，篩選出了結(jié)核患者722種差異表達蛋白，其中SAA蛋白在結(jié)核患者中表達增加，且與非結(jié)核患者相比，該蛋白的中位數(shù)倍數(shù)變化最大，達7.99倍。在感染結(jié)核分枝桿菌期間，結(jié)核病患者響應(yīng)炎癥刺激引起機體血液高凝狀態(tài)[25]，有研究[26-27]表明，SAA的升高可能與這些患者慢性感染分枝桿菌引起機體凝血途徑活化與抗凝血受損相關(guān)。相比于De的研究，本研究準確突出SAA蛋白家族里的SAA4蛋白在涂陰肺結(jié)核患者中的高表達和結(jié)核診斷價值。

鑒于本研究SHBG與SAA4蛋白聯(lián)合診斷涂陰肺結(jié)核顯示出較高的靈敏度及特異度，下一步本課題組將繼續(xù)擴大樣本量進行兩種蛋白對涂陰肺結(jié)核聯(lián)合診斷效能的多中心評價試驗，為探討提高涂陰肺結(jié)核患者的診斷率以及輔助診斷提供經(jīng)濟、高效、實用的新方法。