中華蜜蜂工蜂中腸響應(yīng)東方蜜蜂微孢子蟲脅迫的高表達(dá)基因分析

付中民， 周丁丁， 陳華枝 ， 耿四海 ， 陳大福 ， 鄭燕珍 ， 熊翠玲 ， 徐國鈞 ， 張 曦 ， 郭 睿

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002； 2. 棗莊職業(yè)學(xué)院，棗莊 277100)

1 引 言

蜜蜂是自然界中最重要的授粉昆蟲，能顯著提高作物、果蔬的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]，具有無可比擬的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值.蜜蜂也是一種高度進(jìn)化的社會性昆蟲，在社會行為學(xué)和種群遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2].中華蜜蜂(Apisceranacerana，簡稱中蜂)是東方蜜蜂(Apiscerana)的指名亞種，也是適應(yīng)我國本土自然環(huán)境的特有蜂種，具有善于利用零星蜜源、采集力強(qiáng)及抗病性強(qiáng)等優(yōu)勢[3].

微孢子蟲是專性胞內(nèi)寄生的真菌，宿主范圍包括哺乳動物、魚類和昆蟲等脊椎動物和無脊椎動物[4].微孢子蟲對家蠶和蜜蜂等經(jīng)濟(jì)昆蟲的影響尤為嚴(yán)重[5].東方蜜蜂微孢子蟲(Nosemaceranae)特異性侵染成年蜜蜂的中腸上皮細(xì)胞，可導(dǎo)致蜜蜂免疫力下降，工蜂離巢飛行提前，壽命縮減，以及產(chǎn)蜜量下降，嚴(yán)重危害蜜蜂健康[6-7].隨著東方蜜蜂微孢子蟲基因組(大?。?.86 Mb)的公布和東方蜜蜂基因組(大小：228.332 Mb)完善，二者互作的組學(xué)研究不斷深入[8-10].較多的研究結(jié)果表明，N.ceranae是導(dǎo)致蜂群崩潰綜合癥的關(guān)鍵因素之一[11-12].前人對N.ceranae與西方蜜蜂(Apismellifera)的相互作用進(jìn)行了較多的組學(xué)研究，取得了一些重要進(jìn)展.Aufauvre等[13]利用二代測序技術(shù)對N.ceranae、殺蟲劑脅迫及二者共同脅迫1 d和7 d的西方蜜蜂的中腸樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分析發(fā)現(xiàn)7 d時宿主的中腸免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)受到了強(qiáng)烈抑制，表皮防御功能以及海藻糖代謝通路受到了顯著影響.Badaoui等[14]利用RNA-seq技術(shù)研究了N.ceranae感染5、10和15 d的西方蜜蜂的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因可歸入3種表達(dá)模式，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)N.ceranae感染對宿主的氨基酸代謝產(chǎn)生干擾及抗菌肽基因的表達(dá)產(chǎn)生抑制，表明N.ceranae感染抑制了西方蜜蜂的免疫系統(tǒng).但有關(guān)N.ceranae-東方蜜蜂互作的組學(xué)研究較為滯后，相關(guān)信息匱乏.

筆者所在課題組前期對N.ceranae脅迫意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica，簡稱意蜂)工蜂過程中宿主和病原的高表達(dá)基因(highly expressed gene, HEG)進(jìn)行全面分析，揭示了二者的HEG的表達(dá)譜及潛在作用[15].本研究利用Illumina測序技術(shù)對正常及N.ceranae脅迫的中蜂7 d和10 d工蜂中腸進(jìn)行測序，通過生物信息學(xué)方法對宿主的HEG進(jìn)行深入分析，以期在轉(zhuǎn)錄組水平探究中蜂對N.ceranae的脅迫應(yīng)答.研究結(jié)果可揭示HEG在中蜂脅迫應(yīng)答中的作用，為探明背后的分子機(jī)制提供有益的信息和線索.

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

中蜂工蜂取自福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場；N.ceranae孢子由福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并純化[16].

2.2 方 法

2.2.1 孢子純化、接種感染及人工飼養(yǎng)N.ceranae孢子的粗提和純化方法如下：(1)從N.ceranae感染嚴(yán)重的意蜂蜂群巢門口抓取外勤蜂若干只，拉取中腸放入研缽加水充分研磨，差速離心后棄上清液，純水懸浮沉淀，繼續(xù)多次差速離心以去除雜質(zhì)，將得到的孢子粗提液，按照1∶10比例加入無菌水后分裝到1.5 mL滅菌的EP管內(nèi)，4 ℃，3000 r/min離心5 min，吸去上清液后將5管渾濁液合為1管，4 ℃，1 200 r/min離心3 min；(2)分別配制25%、50%、75%、100%的percoll純化液.各濃度的percoll液取200 μL按照密度從高到低的濃度依次分裝到干凈的EP管中，最后加入離心后的渾濁液，4 ℃，14 000 r/min離心30 min；(3)將無菌的注射器小心吸取孢子，針頭插入乳白色的孢子帶中，注意不要吸到孢子帶上下方的液體.

參照本實(shí)驗(yàn)室前期已建立的方法[17]進(jìn)行中蜂工蜂的接種感染和人工飼養(yǎng)：(1)配制含孢子的50%(w/v)糖水，孢子濃度為2×108/mL；(2)選取群勢較強(qiáng)的成熟封蓋子脾迅速提至實(shí)驗(yàn)室，放入34±0.5 ℃，(60%～70%)RH培養(yǎng)箱，將剛出房的工蜂放入滅菌的塑料盒(塑料盒四周打孔以通風(fēng)，30只/盒)，將裝有50%(w/v)無菌糖水的飼喂器插入每個盒子上方；(3)將工蜂出房當(dāng)天記為0 d，34±0.5 ℃培養(yǎng)24 h；將上述中蜂工蜂單頭固定后饑餓處理2 h，處理組工蜂單只飼喂含孢子的糖水5 μL，對照組工蜂單只飼喂不含孢子的糖水5 μL；(4)24 h后均飼喂不含孢子的糖水，每日更換糖水，及時清理未食盡糖水的工蜂及死去的工蜂，食盡糖水的工蜂用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，用50%(w/v)的糖水飼喂工蜂，適宜條件飼喂至10 d.處理組和對照組均包含3個生物學(xué)重復(fù)，每組重復(fù)包含9只工蜂中腸.適宜條件飼喂至7 d時，處理組中的9只工蜂中腸，分別放入3個EP管，該混合樣品記為Ac7T(Ac7T-1、Ac7T-2、Ac7T-3)；對照組的9只工蜂中腸，分別放入3個EP管，該混合樣品記為Ac7CK(Ac7CK-1、Ac7CK-2、Ac7CK-3)；每次取樣在20 s內(nèi)迅速放于液氮后，迅速轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?10 d的處理和對照組中腸樣品也按照上述方法進(jìn)行取樣和保存，分別記為Ac10T(Ac10T-1、Ac10T-2、Ac10T-3)和Ac10CK(Ac10CK-1、Ac10CK-2、Ac10CK-3).

2.2.2 RNA提取、cDNA建庫及RNA-seq 首先利用RNAiso Reagent試劑盒分別抽提上述12個中腸組織樣品的總RNA，然后用RNase-Free DNase I去除殘留的基因組DNA.接著利用Oligotex mRNA Kits Midi對抽提的總RNA進(jìn)行RNA純化，通過分光光度計對純化RNA進(jìn)行定量檢測.RNA的質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000( Nano Drop公司，美國)進(jìn)行檢測.參照陳大福等[18]的方法進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建.委托廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司，采用Illumina Hiseq 4000測序平臺進(jìn)行雙端測序.

2.2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控、HEG篩選及生物信息學(xué)分析 對于測序得到的原始讀段(raw reads)，去除含接頭(adapter)、含未知堿基(N)的比例大于10%、低質(zhì)量的讀段，用Tophat軟件將過濾得到的有效讀段(clean reads)映射核糖體數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而將未比對上的clean reads映射東方蜜蜂基因組(assembly ACSNU-2.0)，將比對上的clean reads用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析.

利用FPKM(Fragment Per Kilobase of per Million mapped reads)算法計算基因表達(dá)量，公式為FPKM =Total exon fragment/[Mapped fragment (millions) × exon length (KB)]，按照FPKM >15的標(biāo)準(zhǔn)從所有表達(dá)基因中篩選出HEG[19].利用在線工具平臺OmicsShare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Index/index.html)對篩選出的共有及特有HEG進(jìn)行GO分類及KEGG pathway富集分析等相關(guān)生物信息學(xué)分析.

表1 RT-PCR的引物信息

2.2.4 HEG的RT-PCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證本研究RNA-seq的數(shù)據(jù)的可靠性，從4組中腸樣品的共有HEG中隨機(jī)選取8個HEG進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證.根據(jù)上述8個基因的序列，利用Primer Premier 5設(shè)計特異性引物，委托福州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成，相關(guān)引物序列信息見表1.利用試劑盒AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep(AXYGEN公司，中國)抽提上述4組中腸樣品的總RNA.以上述總RNA作為模板，利用試劑盒HiScript 1st Strand cDNA Synthsis Kit(Vazyme公司，中國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)步驟按照說明書進(jìn)行.PCR反應(yīng)在T100熱循環(huán)儀(Bio-Rad公司，美國)上進(jìn)行，反應(yīng)體系包括：Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸凝膠成像儀(上海培清，中國)觀察拍照.

3 結(jié)果與分析

3.1 高通量測序數(shù)據(jù)概述

本文中蜂工蜂中腸樣品共測得1 809 736 786條raw reads，經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)控得到1 562 162 742條clean reads，將未比對上核糖體數(shù)據(jù)庫的clean reads映射到東方蜜蜂基因組，Ac7CK、Ac7T、Ac10CK及Ac10T各組的平均比對率為75.78%、55.01%、78.13%和44.19%；Q30均達(dá)93.34%及以上(表2).此外，Ac7CK、Ac7T、Ac10CK及Ac10T的Pearson相關(guān)系數(shù)都在0.872 8及以上(圖1).上述結(jié)果說明測序樣品的重復(fù)性較好，測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量可滿足進(jìn)一步分析需要.

表2 RNA-seq數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計

圖1 中蜂工蜂中腸各組樣品內(nèi)不同生物學(xué)重復(fù)間的Pearson相關(guān)性

Fig.1 Pearson correlations among different biological repeats within eachA.c.ceranaworker’s midgut sample group

3.2 HEG的Venn分析

根據(jù)FPKM >15的標(biāo)準(zhǔn)，分別從Ac7CK、Ac7T、Ac10CK及Ac10T中篩選出3 162、3 311、3 305和2 463個HEG.Venn分析結(jié)果顯示四組樣品的共有HEG為2 074個，特有HEG分別為89、283、156和78個(圖2).

圖2 中蜂工蜂中腸各組樣品HEG的Venn分析

Fig.2 Venn investigation of HEGs in everyA.c.ceranaworker midgut sample group

3.3 共有及特有HEG的GO分類

GO富集分析結(jié)果顯示，共有HEG主要涉及生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能三類，分布于45個GO條目.生物進(jìn)程中，富集基因數(shù)最多的是代謝進(jìn)程(409)、細(xì)胞進(jìn)程(380)和單組織進(jìn)程(314)(圖3A)；細(xì)胞組分中，富集基因數(shù)最多的是細(xì)胞(254)、細(xì)胞組件(254)和細(xì)胞膜(153)(圖3B)；分子功能中，富集基因數(shù)最多的是結(jié)合(385)、催化活性(329)和轉(zhuǎn)運(yùn)器活性(60)(圖3C).

Ac7CK特有HEG涉及37個GO條目，基因富集數(shù)最多的是細(xì)胞進(jìn)程(204)、代謝進(jìn)程(196)、結(jié)合(191)、催化活性(181)和單組織進(jìn)程(165)；Ac7T特有HEG涉及35個GO條目，基因富集數(shù)最多的是細(xì)胞進(jìn)程(219)、代謝進(jìn)程(210)、結(jié)合(193)、催化活性(189)和單組織進(jìn)程(183)；Ac10CK特有HEG涉及37個GO條目，基因富集數(shù)最多的是細(xì)胞進(jìn)程(230)、代謝進(jìn)程(223)、結(jié)合(217)、催化活性(203)和單組織進(jìn)程(183)；Ac10T特有HEG涉及28個GO條目，基因富集數(shù)最多的是細(xì)胞進(jìn)程(71)、結(jié)合(63)、單組織進(jìn)程(59)、代謝進(jìn)程(58)和催化活性(51).

圖3 共有HEG的GO分類Fig.3 GO categorization of the shared HEGs

3.4 共有及特有HEG的KEGG代謝通路富集分析

KEGG富集分析結(jié)果顯示，共有HEG富集在39條通路，其中基因富集數(shù)最多的前3位分別是核糖體(90)、氧化磷酸化(63)和蛋白酶體(25)(圖4).

Ac7CK的特有HEG富集在39條通路，富集基因數(shù)最多的前4位分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(33)、氧化磷酸化(27)、核糖體(25)和內(nèi)吞作用(25)；Ac7T的特有HEG富集在39條通路，富集基因數(shù)最多的前4位分別是核糖體(32)、氧化磷酸化(29)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(26)和剪接體(23)；Ac10CK的特有HEG富集在39條通路，富集基因數(shù)最多的前4位分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(38)、氧化磷酸化(32)、核糖體(27)、和碳代謝(26)；Ac10T的特有HEG富集在37條通路，富集基因數(shù)最多的前4位分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(8)、PI3K-Akt信號通路(7)、Wnt信號通路(6)和TGF-β信號通路(5).

圖4 共有HEG的KEGG代謝通路富集分析

圓圈大小代表富集在某一通路的基因數(shù)多少，越大代表基因數(shù)越多；圓圈顏色代表某一通路的富集基因的顯著性高低，越紅代表顯著性越高

Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of the shared HEGs

The size of the circle indicates the number of enriched genes in a certain pathway, the bigger the more; the color of the circle indicates the significance of enriched genes in a certain pathway, and the redder the color, the higher the more significant

圖5 8個共有HEG的RT-PCR驗(yàn)證

A:類易化海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)體tret1編碼基因; B: 類胰蛋白酶-1編碼基因; C: 類磷脂酶A1編碼基因; D: 精氨酸激酶亞基X1編碼基因; E: 類α胰蛋白酶-3編碼基因; F: 40S核糖體蛋白S15編碼基因; G: 類鋅羧肽酶編碼基因; H: 類生命必需蛋白lethal(2)編碼基因

Fig.5 RT-PCR verification of eight shared HEGs

A:facilitated trehalose transporter Tret1-like encoded gene; B: trypsin-1-like encoded gene; C: phospholipase A1-like encoded gene; D: arginine kinase isoform X1 encoded gene; E: trypsin alpha-3-like encoded gene; F: 40S ribosomal protein S15 encoded gene; G: zinc carboxypeptidase-like encoded gene; H: protein lethal(2) essential for life-like encoded gene

從4個樣品共有的HEG中隨機(jī)挑選8個進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果顯示8對引物均能擴(kuò)增出符合預(yù)期的目的條帶(圖5)，初步證實(shí)了本研究預(yù)測的HEG真實(shí)表達(dá).

4 討 論

中蜂是我國養(yǎng)蜂生產(chǎn)的主要蜂種之一，經(jīng)長期進(jìn)化已高度適應(yīng)我國的生態(tài)環(huán)境.中蜂是N.ceranae的原始寄主，二者經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化已相互適應(yīng)，N.ceranae經(jīng)跨種侵染已擴(kuò)散至世界各地的西方蜜蜂蜂群.目前，關(guān)于N.ceranae與蜜蜂互作方面的研究主要集中在西方蜜蜂[20-22].前人也對中蜂與N.ceranae的互作進(jìn)行了一些研究，但組學(xué)研究較為滯后，相關(guān)信息頗為匱乏.Chaimanee等[21]曾對N.ceranae侵染3、 6和12 d的西方蜜蜂(Apismellifera)工蜂進(jìn)行研究，通過檢測4種抗菌肽基因(defensin、abaecin、apidaecin和hymenoptaecin)、eater基因和卵黃原蛋白編碼基因(vitellogenin)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)N.ceranae侵染對宿主的體液免疫造成了較強(qiáng)抑制.Sinpoo等[22]對西方蜜蜂和東方蜜蜂進(jìn)行了蜜蜂微孢子蟲(Nosemaapis)和N.ceranae交叉感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)二種蜜蜂的抗菌肽編碼基因和細(xì)胞免疫相關(guān)基因均顯著上調(diào)表達(dá)，但東方蜜蜂的上皮細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的體液免疫水平且含有更少的孢子數(shù)，作者推測東方蜜蜂對N.apis和N.ceranae可能具有更強(qiáng)的抵抗力.本研究利用RNA-seq技術(shù)對正常及N.ceranae感染的中蜂工蜂中腸進(jìn)行測序，從正常的7和10 d工蜂中腸分別篩選出3 162及3 305個HEG，從N.ceranae脅迫的7和10 d工蜂中腸分別篩選出3 311及2 463個HEG.Ac7CK、Ac7T、Ac10CK和Ac10T的共有HEG數(shù)為2 074個，推測這些共有HEG對中蜂工蜂中腸的生長和發(fā)育中具有重要作用.此外，Ac7T和Ac10T的特有HEG數(shù)分別為283及78個，說明隨著脅迫時間的延長，宿主應(yīng)答的特有HEG數(shù)呈下降趨勢，推測這些HEG在宿主響應(yīng)N.ceranae脅迫的不同階段發(fā)揮特殊作用.本研究中，Ac7CK、Ac7T、Ac10CK及Ac10T各組的平均比對率為75.78%、55.01%、78.13%和44.19%，處理組的平均比對率明顯低于對照組，究其原因，處理組中腸樣品包含大量的病原孢子，其測序數(shù)據(jù)為宿主和病原的混合數(shù)據(jù)，因病原的clean reads無法比對上東方蜜蜂的參考基因組，勢必影響宿主clean reads的比對率；而對照組中腸樣品的測序數(shù)據(jù)中絕大部分都為宿主本身的數(shù)據(jù)，因而clean reads的比對率較高.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，處理組和對照組測序得到的raw reads，以及質(zhì)控的clean reads，基本處于同一數(shù)量級，因此對后續(xù)生物信息學(xué)分析的影響很小.

本研究中，Ac7T和Ac10T的特有HEG中分別有219和71個注釋到細(xì)胞進(jìn)程，210和58個注釋到代謝進(jìn)程，189和51個注釋到催化活性，顯示伴隨N.ceranae的入侵，中蜂工蜂中腸的新陳代謝和細(xì)胞生命活動處于不同幅度的激活狀態(tài)，但激活程度隨著病原增殖而呈下降趨勢.病原微生物入侵昆蟲時會遭到宿主細(xì)胞免疫和體液免疫的聯(lián)合抵抗，包括內(nèi)吞作用、吞噬作用、酶促水解作用、黑化作用以及抗菌肽的合成與釋放等[15].本研究發(fā)現(xiàn)，Ac7T和Ac10T的特有HEG中分別有95和68個富集在應(yīng)激反應(yīng)，1和1個富集在免疫系統(tǒng)進(jìn)程，表明中蜂工蜂對N.ceranae產(chǎn)生了免疫應(yīng)答且應(yīng)答水平隨脅迫時間的延長有所下降.

本研究中，Ac7T和Ac10T的210和58個特有HEG可注釋到77和39條物質(zhì)代謝通路，包含碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子與維生素代謝、核苷酸代謝、多糖生物合成與代謝等，進(jìn)一步說明中蜂工蜂中腸的物質(zhì)代謝因N.ceranae脅迫而激活，但激活程度隨脅迫時間延長而降低.前期研究中，筆者所在課題組對脅迫中蜂7和10日齡工蜂中腸的N.ceranae的共有HEG進(jìn)行了代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)與物質(zhì)代謝相關(guān)的信號通路多達(dá)43條，包含碳代謝(15)、糖酵解/糖異生(11)、氧化磷酸化(8)和磷酸戊糖途徑(5)等，表明N.ceranae在侵染過程中的物質(zhì)和能量代謝較為旺盛(數(shù)據(jù)未發(fā)表).結(jié)合本研究中的分析結(jié)果，推測N.ceranae在其增殖過程中一方面增強(qiáng)自身物質(zhì)和能量代謝以滿足核酸和蛋白合成需要，另一方面通過某種操縱策略提高宿主的代謝水平，促使其攝入更多的物質(zhì)和能量滿足中蜂和N.ceranae的需要，從而利于病原的增殖.Li等[23]對新羽化的成年意蜂工蜂接種感染N.ceranae，通過檢測宿主體內(nèi)的脂類含量發(fā)現(xiàn)宿主的脂質(zhì)含量隨感染時間的延長而顯著降低，作者推測脂質(zhì)可能是用于維持宿主生長和病原增殖的首選營養(yǎng)物質(zhì).本研究發(fā)現(xiàn)，Ac7T和Ac10T中分別有31和8個特有HEG富集到12和6條脂質(zhì)代謝通路，包括脂肪酸降解、磷脂酰甘油代謝、鞘脂代謝等，表明宿主通過提高脂質(zhì)的合成來滿足自身和N.ceranae的需要，與前人的研究結(jié)果一致.前人研究發(fā)現(xiàn)在N.ceranae感染的西方蜜蜂對低濃度的蔗糖溶液可產(chǎn)生伸吻反應(yīng)，取食更多的蔗糖溶液，氧化磷酸化富集基因的數(shù)量增加，表明N.ceranae對西方蜜蜂造成了能量脅迫[24-26].本研究中，Ac7T和Ac10T中分別有29和1個特有HEG富集在氧化磷酸化，表明N.ceranae對宿主造成能量脅迫，與西方蜜蜂的相關(guān)研究結(jié)果一致.

Toll樣受體是一類富含亮氨酸的重復(fù)序列的模式識別受體蛋白質(zhì)家族，廣泛分布于免疫細(xì)胞及某些體細(xì)胞的表面，作為宿主防御反應(yīng)中的重要組成部分以及先天性免疫和獲得性免疫的連接點(diǎn)[27].MAPK屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，MAPK信號通路是一種包括MAPK、MAPK激酶激酶、MAPK激酶的保守三級激酶模式，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長、分化、增殖及對環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞生理及病理的過程[28].NF-κB信號通路通過調(diào)節(jié)某些抗死亡基因和分子的表達(dá)，介導(dǎo)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答[29].本研究中，Ac7T中分別有3、6和1個特有HEG富集在Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路和NF-κB信號通路；Ac10T中有1個特有HEG富集在NF-κB信號通路，但未發(fā)現(xiàn)有HEG富集在其余兩條體液免疫通路.上述結(jié)果表明Toll樣受體等3條信號通路在中蜂工蜂響應(yīng)N.ceranae脅迫的前期表現(xiàn)活躍，可能發(fā)揮重要的免疫防御作用，隨著脅迫時間的延長，宿主的NF-κB信號通路在免疫防御中的角色漸趨關(guān)鍵.細(xì)胞因子介導(dǎo)的Jak-STAT信號通路參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等諸多生物學(xué)過程.本研究中，Ac10T中有2個特有HEG富集在Jak-STAT信號通路，表明該信號通路被N.ceranae激活.筆者團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)對于N.ceranae脅迫10 d的意蜂工蜂中腸，沒有HEG富集Jak-STAT和NF-κB通路[15]，表明中蜂和意蜂響應(yīng)N.ceranae脅迫的免疫應(yīng)答存在差異，值得進(jìn)一步深入探討.N.ceranae感染可抑制西方蜜蜂中腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平[15].本研究發(fā)現(xiàn)，Ac7T中有2個特有HEG富集在細(xì)胞凋亡，Ac10T中無HEG富集在此通路，推測中蜂工蜂中腸細(xì)胞可通過提高相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以限制N.ceranae的增殖.

綜上所述，本研究對正常及N.ceranae脅迫的中蜂工蜂中腸HEG進(jìn)行了細(xì)致深入的生物信息學(xué)分析，提供了宿主的HEG表達(dá)譜，揭示了HEG在宿主響應(yīng)N.ceranae脅迫中的潛在作用.研究結(jié)果為在分子水平深入解析中蜂響應(yīng)N.ceranae脅迫的應(yīng)答機(jī)制、宿主-病原互作機(jī)制提供了有益的信息和線索.