巨菌草對(duì)鄂爾多斯砒砂巖土壤酶活性和可培養(yǎng)真菌的影響

黃在興, 梅 蘭, 宋昭昭, 賈雨雷, 王澤輝, 王安南, 劉怡萌, 蘇德偉, 林占熺

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

砒砂巖地區(qū)是黃河流域能源基地的核心區(qū)，但由于其土層薄、營(yíng)養(yǎng)匱乏，植被生長(zhǎng)困難[1]，也成為生態(tài)環(huán)境最脆弱、水土流失最嚴(yán)重的區(qū)域[2].目前，沙棘因其柔性而被視作砒砂巖生態(tài)治理的植物“柔性壩”，對(duì)提高土壤養(yǎng)分和含水量，以及治理水土流失具有一定作用[3-4]；但沙棘生長(zhǎng)速度慢，并且植物“柔性壩”只能在砒砂巖侵蝕的溝底部種植，對(duì)于坡面和溝坡的水土流失不能達(dá)到理想的治理效果[5].因此，為解決砒砂巖地區(qū)的生態(tài)治理難題，急需找到一種生長(zhǎng)速度快、生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益明顯、能適應(yīng)惡劣環(huán)境的植物作為砒砂巖生態(tài)恢復(fù)的先鋒植物.

巨菌草(PennisetumgiganteumZ.X.Lin)為被子植物門(mén)單子葉植物綱禾本科狼尾草屬，其具有生長(zhǎng)適應(yīng)能力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，被廣泛用于食藥用菌生產(chǎn)，能夠作為飼料，又可用于制備沼氣及治理生態(tài)等，有很好的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[6-8].目前，巨菌草已成為多種生態(tài)脆弱區(qū)生態(tài)綜合治理的先鋒植物，對(duì)土壤改良效果明顯[7,9-10].土壤酶參與各種生化過(guò)程，可以用來(lái)評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量[11].但有關(guān)植物對(duì)砒砂巖地區(qū)土壤酶的影響鮮有報(bào)道，巨菌草對(duì)砒砂巖地區(qū)土壤酶的影響尚不明確.為此，本研究擬測(cè)定巨菌草對(duì)砒砂巖地區(qū)5種土壤酶，即脲酶(urease, URE)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、蔗糖酶(solid-sucrase, S-SC)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的活性和土壤可培養(yǎng)真菌的數(shù)量、多樣性的影響，以期為應(yīng)用巨菌草治理砒砂巖生態(tài)環(huán)境提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于黃土高原丘陵溝壑區(qū)皇甫川流域——內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市準(zhǔn)格爾旗暖水鄉(xiāng)圪秋溝村，地理坐標(biāo)為北緯39°46′—39°77′、東經(jīng)110°40′—110°68′.此處為典型的砒砂巖區(qū)，覆沙、覆土、裸露3種類(lèi)型并存，植被稀疏，基巖裸露，水土流失嚴(yán)重，生態(tài)和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)環(huán)境惡劣.從20世紀(jì)80年代至今，該區(qū)域?yàn)閲?guó)家重點(diǎn)治理和科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)區(qū)域，代表性強(qiáng).本研究在該區(qū)域選取農(nóng)田、河灘和山頂為樣地，于2017年4月初分別在3塊樣地種植健康且長(zhǎng)勢(shì)相同的巨菌草，人工灌溉措施均相同.

1.2 土樣采集與預(yù)處理

分5個(gè)時(shí)期采集土樣，以45 d為一個(gè)時(shí)期，即4月初為種植前，5月中旬為苗期，以此類(lèi)推分為種植前、苗期、分蘗期、拔節(jié)期和成熟期共5個(gè)時(shí)期.參照林先貴[12]的方法分別在每個(gè)時(shí)期灌溉前采集土樣：按照“隨機(jī)”、“等量”、“多點(diǎn)混合”的原則，在各試驗(yàn)區(qū)沿“S”形隨機(jī)選取10個(gè)點(diǎn)，清除地表1 cm左右的表層土壤，在0～20 cm深度處采集等量土壤，清除雜物，用四分法對(duì)角取2份土壤混合放進(jìn)取樣袋，注明采樣地點(diǎn)、時(shí)間.將部分土樣置于陰涼通風(fēng)處風(fēng)干，然后過(guò)篩用于土壤酶活性分析；另一部分置于4 ℃冰箱中用于土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量的測(cè)定；少量土樣置于-80 ℃超低溫冰箱中，用于分子生物學(xué)試驗(yàn).

1.3 土壤酶活性和可培養(yǎng)真菌數(shù)量測(cè)定

土壤酶活性測(cè)定參照關(guān)松蔭[13]的方法.土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量的測(cè)定參照林先貴[12]的方法.

1.4 土壤可培養(yǎng)真菌ITS鑒定

采用稀釋涂布平板法分離土壤可培養(yǎng)真菌，挑取具有形態(tài)差異的單菌落接到PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng).培養(yǎng)3 d后，截取菌塊接種到裝有PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，150 r·min-1、28 ℃培養(yǎng)3 d，收集菌絲，液氮冷凍后研磨成粉末，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

采用福州麥力公司快速無(wú)毒通用DNA提取試劑盒提取真菌DNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(110 V，30 min)，在紫外光下檢測(cè)，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度.

用ITS1和ITS4引物(由上海生工生物工程股份有限公司合成)對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增.擴(kuò)增體系：PCR Mix 12.5 μL, ddH2O 9.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,總體積25 μL.PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 40 s，退火56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中電泳，上樣5 μL，凝膠成像儀觀察.經(jīng)PCR篩選后，用具有目的條帶的PCR產(chǎn)物和引物直接測(cè)序.測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成.運(yùn)用GenBank中的Blast工具將測(cè)得的供試菌株rDNA序列在DNA系列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比較分析.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，采用GraphPad Prism軟件制圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 巨菌草對(duì)土壤URE活性的影響

由圖1A可以看出，3塊樣地巨菌草各生長(zhǎng)期的URE活性均高于種植前的URE活性，且差異顯著(P<0.05)；在同一時(shí)期，山頂土壤URE活性最高，農(nóng)田次之，河灘土壤的URE活性最低.這表明巨菌草能夠明顯提高土壤URE活性，但對(duì)不同樣地的影響不同.

2.2 巨菌草對(duì)土壤PPO活性的影響

由圖1B可知，巨菌草能夠顯著(P<0.05)降低土壤PPO活性，農(nóng)田、山頂和河灘土壤PPO活性最大降幅分別達(dá)67.11%、66.11%和73.49%；但在巨菌草不同生長(zhǎng)時(shí)期，土壤PPO活性變化不顯著(P>0.05).

2.3 巨菌草對(duì)土壤S-SC活性的影響

由圖1C可知，山頂土壤的S-SC活性隨著巨菌草的生長(zhǎng)逐漸降低，成熟期酶活性最低，比種植前降低了73.66%；農(nóng)田土壤的S-SC活性在巨菌草生長(zhǎng)期內(nèi)呈先增加再降低的趨勢(shì)，拔節(jié)期時(shí)達(dá)到最大值，達(dá)7.760 mg·g-1，比種植前增加了16.80倍；河灘土壤的S-SC活性在巨菌草不同生長(zhǎng)期差異不顯著(P>0.05).

2.4 巨菌草對(duì)土壤ALP活性的影響

由圖1D可知，山頂土壤的ALP活性在5個(gè)時(shí)期均明顯(P<0.05)高于其他2塊樣地.山頂土壤的ALP活性在苗期時(shí)最大，達(dá)41.554 μg·g-1，農(nóng)田和河灘土壤的ALP活性均在巨菌草成熟期時(shí)達(dá)到最大值，分別為15.134和3.848 μg·g-1.

2.5 巨菌草對(duì)土壤CAT活性的影響

由圖1E可知，3塊樣地土壤CAT活性的變化趨勢(shì)一致(降低—增加—降低)，且均在巨菌草拔節(jié)期達(dá)到峰值；但山頂土壤的CAT活性在不同時(shí)期均明顯(P<0.05)高于其他2塊樣地，最大值達(dá)4.13 mL·g-1.

2.6 巨菌草對(duì)土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量的影響

從圖1F可知，不同樣地的土壤真菌數(shù)量在巨菌草生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)變化不同.山頂和河灘土壤真菌數(shù)量均在種植前最高，且隨著巨菌草的生長(zhǎng)變化趨勢(shì)基本一致；農(nóng)田的土壤真菌數(shù)量在巨菌草分蘗期達(dá)到峰值，達(dá)5.52×104CFU·g-1，比種植前高出1.58倍.

2.7 土壤可培養(yǎng)真菌多樣性分析

rDNA的ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶單一，大小在500～750 bp之間，表明獲得的目的DNA片段產(chǎn)量高、純度好，可用于測(cè)序.

將測(cè)序得到的rDNA ITS區(qū)段的DNA序列在GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，在巨菌草分蘗期，河灘土壤中分離的優(yōu)勢(shì)真菌菌株分別屬于漆斑菌屬(Myrothecium)、被孢霉屬(Mortierella)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、支頂孢屬(Acremonium)、頂囊殼(Gaeumannomyces)、栓菌屬(Trametes)、小球殼屬(Mycosphaerella)、擬層孔菌屬(Fomitopsis).其中，屬于被孢霉屬的菌株數(shù)最多，屬于青霉屬和漆斑菌屬的菌株次之(表1).

在巨菌草分蘗期，農(nóng)田土壤中分離得到的優(yōu)勢(shì)真菌菌株分別屬于擬青霉屬(Paecilomyces)、鐮刀霉屬(Fusarium)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、被孢霉屬、青霉屬、栓菌屬、鏈格孢屬(Alternaria).其中，屬于被孢霉屬的菌株數(shù)最多，屬于鐮刀霉屬和青霉屬的菌株次之(表2).

表1 河灘土壤分離的優(yōu)勢(shì)真菌菌株Blast比對(duì)結(jié)果Table 1 Blast comparison of fungal strains isolated from flood land soil

表2 農(nóng)田土壤分離的優(yōu)勢(shì)真菌菌株Blast比對(duì)結(jié)果Table 2 Blaset comparison of fungal strains isolated from farmland soil

在巨菌草分蘗期，山頂土壤中分離得到的優(yōu)勢(shì)真菌菌株分別屬于曲霉屬(Aspergillus)、被孢霉屬、青霉屬、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、籃狀菌屬(Talaromyces)、分子孢子菌屬(Cladosporium)、漆斑菌屬.其中，屬于被孢霉屬的真菌所占的比例最大，屬于青霉屬的菌株次之(表3).

2.8 土壤酶之間以及土壤酶與可培養(yǎng)真菌之間的關(guān)聯(lián)性分析

如表4所示，URE、S-SC、CAT與ALP之間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；URE、S-SC與CAT之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；其他各酶之間不存在顯著的相關(guān)性(P>0.05).真菌與PPO、S-SC、ALP以及CAT之間均呈正相關(guān)關(guān)系，而與URE之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性均不顯著(P>0.05).

表3 山頂土壤分離的優(yōu)勢(shì)真菌菌株Blast比對(duì)結(jié)果Table 3 Blast comparison of fungal strains isolated from hilltop soil

表4 土壤酶之間以及土壤酶與可培養(yǎng)真菌之間的相關(guān)性分析1)Table 4 Correlation analysis between soil enzymes and culturable fungi

1)**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01).

3 討論

3.1 巨菌草對(duì)砒砂巖地區(qū)土壤酶活性的影響

陳勝男等[14]與劉紅艷等[15]的研究結(jié)果顯示，土壤URE活性與固氮菌呈正相關(guān)關(guān)系.本研究結(jié)果顯示，3塊樣地種植巨菌草后的土壤URE活性比種植前高，這可能與巨菌草根部含有豐富的固氮菌有關(guān)[16]，說(shuō)明種植巨菌草能有效促進(jìn)土壤氮素循環(huán).此外，有研究表明，禾本科—豆科輪作相對(duì)其他方式能夠更有效增加土壤有機(jī)碳儲(chǔ)存[17]；楊瑞娟等[18]研究表明，禾本科植物伴生番茄，提高了土壤S-SC活性，同時(shí)可以減少根結(jié)線蟲(chóng)的發(fā)生.本研究中的巨菌草也是禾本科植物之一，因此，其在增加土壤有機(jī)碳儲(chǔ)存和促進(jìn)團(tuán)聚體建成方面具有一定優(yōu)勢(shì)，可能成為克服連作障礙的伴生植物.

褚素貞等[19]研究了土壤CAT與土壤中全氮、堿解氮、全磷和速效磷、全鉀和速效鉀等主要肥力因子之間的關(guān)系，結(jié)果表明土壤CAT與這些肥力因子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.本研究中的3塊樣地在巨菌草生長(zhǎng)期內(nèi)，土壤CAT活性在拔節(jié)期最高，說(shuō)明土壤肥力在巨菌草拔節(jié)期較低.這可能由于巨菌草在拔節(jié)期生長(zhǎng)迅速，吸收的土壤養(yǎng)分增多，導(dǎo)致土壤中的養(yǎng)分相對(duì)較低.但在其他時(shí)期CAT活性均低于種植前，表明種植巨菌草總體上能夠提高土壤養(yǎng)分.

5種土壤酶之間的關(guān)聯(lián)性分析表明，URE、S-SC、CAT與ALP之間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，這與安韶山等[20]的研究結(jié)果一致.另外，URE、S-SC與CAT之間也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，其他各酶之間不存在顯著的相關(guān)性.這表明土壤有機(jī)物在轉(zhuǎn)化時(shí)，土壤酶所發(fā)揮的作用并不是孤立的，而是存在相互制約、互相促進(jìn)的復(fù)雜關(guān)系，各土壤酶既可專(zhuān)一指示土壤某一種或某一類(lèi)養(yǎng)分，又可以共同指示土壤肥力.

3.2 巨菌草對(duì)砒砂巖地區(qū)土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量和多樣性的影響

真菌具有強(qiáng)大的酶系統(tǒng)，分解復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)的能力強(qiáng)，可分解植物殘?bào)w中的纖維素、木質(zhì)素和果膠等，也可分解含氮蛋白質(zhì)類(lèi)化合物釋放出氨，對(duì)土壤肥力有直接影響[21-22].在巨菌草生長(zhǎng)期內(nèi)，3塊樣地的土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量均在在分蘗期達(dá)到峰值，但僅農(nóng)田分蘗期的土壤真菌數(shù)量比種植前高，且農(nóng)田土壤真菌數(shù)量在巨菌草不同生長(zhǎng)時(shí)期差異顯著，說(shuō)明巨菌草對(duì)農(nóng)田土壤真菌的影響較大.多樣性分析發(fā)現(xiàn)，3塊樣地均存在被孢霉屬、青霉屬的土壤真菌，且所占比例較大.被孢霉屬在工業(yè)上被廣泛用于糖化酶和蛋白酶生產(chǎn)，還可以生產(chǎn)γ-亞麻酸等有機(jī)酸[23]；土壤青霉菌對(duì)瓜果腐霉和尖孢鐮刀菌等土壤有害菌有較好的抑制效果[24].此外，在山頂土壤中分離出了產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)，其對(duì)于重金屬Cd、Pb、Cu均有一定的抗性[25].因此，種植巨菌草可以提高土壤有益真菌含量.

3.3 土壤酶與可培養(yǎng)真菌之間的相關(guān)性

許多研究表明，土壤酶與土壤微生物數(shù)量和活性有直接關(guān)系[26-28].本研究發(fā)現(xiàn)，土壤真菌與URE呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與李明[29]的研究結(jié)果一致.不同學(xué)者對(duì)于微生物與土壤酶之間的研究有不同的結(jié)果[30-32]，這與土壤酶來(lái)源的廣泛、土壤真菌種類(lèi)的豐富有關(guān)[33].本研究中，被孢霉屬的土壤真菌是優(yōu)勢(shì)菌屬，土壤真菌數(shù)量與S-SC、ALP、CAT、PPO之間呈正相關(guān)關(guān)系，其中與S-SC的正相關(guān)系數(shù)最大.S-SC能夠?qū)⒄崽撬獬善咸烟呛凸牵活檿苑f等[34]研究表明，高山被孢霉的最佳碳源為葡萄糖.因此，S-SC的增加能夠?yàn)楸绘呙箤僬婢峁└训纳L(zhǎng)條件.

綜上所述，種植巨菌草能夠改良土壤狀況.今后可從巨菌草不同種植模式、不同種植年限、巨菌草對(duì)土壤關(guān)鍵因子的作用方式等方面進(jìn)一步揭示巨菌草對(duì)土壤的改良機(jī)制.